1、第十六抗生素类药物分析优选第十六抗生素类药物分析一、抗生素的定义及特点一、抗生素的定义及特点低化学纯度低化学纯度同系物多、异构体多、降解物多同系物多、异构体多、降解物多活性组分的变异性活性组分的变异性生产过程中条件的变生产过程中条件的变化化不稳定性不稳定性不稳定性结构不稳定性结构 是指是指“生物在其生命活动中产生的，能在生物在其生命活动中产生的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称能的化学物质的总称”抗生素的分类抗生素的分类内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素多烯大环类抗生素制菌霉素、两性霉素多肽类抗生素放线
2、菌素、多黏菌素酰胺醇类抗生素氯霉素抗肿瘤类抗生素其他抗生素二、抗生素类药物的分类二、抗生素类药物的分类按化学结构分按化学结构分三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性1、耐药性的种类固有耐药性：天然耐药性，由细菌染色体基因决定获得性耐药性：2、耐药的机制（1）产生灭活酶，使抗菌药失活 如-内酰胺酶（2）抗菌药物作用靶位改变（3）降低细菌外膜通透性（4）影响主动流出系统四、抗生素药物的质量分析四、抗生素药物的质量分析鉴别试验鉴别试验1、官能团的显色反应特殊基团的反应2、光谱法特征吸收3、色谱法保留行为4、生物学方法抗菌能力检
3、查检查1、影响产品稳定性的检查项目水份、酸碱度等2、控制有机和无机杂质的检查项目3、与临床安全性密切相关的检查项目异常毒性、热原等4、其他检查项目其他共存组分 含量或效价测定含量或效价测定1、微生物检定法比浊法管碟琼脂扩散法抑菌圈Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少 U/mg是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法方法灵敏度高、需用量少灵敏度高、需用量少适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的适用范围广纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化可一次测定同类型抗生素的总效价无需分离纯化与临床的应用要求一致与临床的应用要求一致
4、操作繁琐、费时费力操作繁琐、费时费力误差较大误差较大是结构复杂和多组分抗是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方生素效价测定的首先方法法优点优点 含量或效价测定含量或效价测定1、微生物检定法缺点缺点 2、物理化学法 HPLC LC-MS UV 容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照仪器分析方法 含量或效价测定含量或效价测定1、影响产品稳定性的检查项目水份、酸碱度等氨苄西林（氨苄青霉素）HPLC法（2000版）5 mg/ml 对照液（2）：-苯甘氨酸 0.头孢氨苄 max=262nm判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小分子量大于药物
5、本身的杂质总称。青霉素类 C3 C5 C6是指“生物在其生命活动中产生的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称”头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：ODS 流动相：0.主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。二、抗生素类药物的分类母核参与的聚合反应N型聚合反应Internal standard IS（1）酸碱两性C4（二甲氨基）、C10（酚羟基）准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少 U/mg（2）峰面积的RSD5特殊杂质的检查Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生
6、素有效成分的多少 U/mg第二节 内酰胺类抗生素-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸（6-APA）；青）；青霉素类；霉素类；7-氨基头孢菌烷氨基头孢菌烷酸（酸（7-ACA）；）；头孢菌素类；头孢菌素类；一、结构及分类一、结构及分类NSCH3CH3COOHONHRO1234567HHHNONHRO567SCOOHCH2R181234HH氢化噻嗪环氢化噻嗪环氢化噻唑环氢化噻唑环CONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素青霉素（青霉素钾、钠）（青霉素钾、钠）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2氨苄西林氨苄西林（氨苄青霉素）（氨苄青霉素）阿莫西林阿莫西林（羟氨苄青霉
7、素）（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2头孢氨苄头孢氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2头孢羟氨苄头孢羟氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2HO 理化性质理化性质1 1、酸性与溶解性、酸性与溶解性2 2、旋光性、旋光性3 3、紫外吸收特性、紫外吸收特性4 4、不稳定性、不稳定性NONHRO567SCOOHCH2R181234NSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性酸性一、结构特点与性质一、结构特点与性质NaNa与碱金属与碱金属(Na(Na+、K K+)成盐成盐 （一）羧
8、基（一）羧基 易溶于水易溶于水 与有机碱与有机碱(普鲁卡因普鲁卡因)成盐成盐 难溶于水难溶于水普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NSO123456787654321NOS头孢菌素类头孢菌素类 C6 C7青霉素类青霉素类 C3 C5 C6 旋光性旋光性 NSO头孢菌素类头孢菌素类 母核有共轭体系母核有共轭体系 青霉素类青霉素类 母核无明显母核无明显UVUV 多数有苯环取代基多数有苯环取代基 NOS UVUV青霉素类 C3 C5 C6第二节 内酰胺类抗生素庆大霉素C2a R=CH3 R1=R2=HUV酰胺键易水解准确可靠、专属性
9、高、操作简单、省时、样品用量少1、影响产品稳定性的检查项目水份、酸碱度等头孢氨苄 max=262nm主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：ODS 流动相：0.药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。（4）与金属离子的配位化合物反应酚羟基和烯醇基2、物理化学法2、基本特点对青霉素而言烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干求。容量法（3）异构体之间可以相互聚合L-L、D-D、L-D与碱金属(Na+、K+)成盐产物1和产物2再相互作用生成橙红色化合物。（四）（四）内酰胺环的不稳定性内酰胺环
10、的不稳定性 水溶液水溶液 不稳定不稳定 干燥纯净干燥纯净 稳定稳定 不稳定不稳定性因素性因素四元环张力大四元环张力大 酰胺键易水解酰胺键易水解 含水量含水量 纯度纯度 青霉素类青霉素类 某些氧化剂某些氧化剂酸、碱、青霉素酶酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（某些金属离子）（温度）（温度）降解降解失效失效（四）（四）内酰胺环内酰胺环 NSCH3CH3COOHONHRO1234567HHNSCH3CH3COOHONHRO1234567HOH青青 霉霉 素素 酶酶青青 霉霉 噻噻 唑唑 酸酸强强 酸酸 性性 环环 境境NSCH3CH3COOH1234HNRHOOCN酸酸 性性 加加 热热CH2CONH
11、CH2CHOCCH3HSCH3CHCOOHH2N+弱弱 酸酸 性性青青 霉霉 醛醛青青 霉霉 胺胺ONORNHCH3CH3HSCOOH青青 霉霉 烯烯 酸酸NH2OH青青 霉霉 噻噻 唑唑 酸酸 酰酰 基基 羟羟 胺胺 酸酸HgCl2青青 霉霉 酸酸与含水量和纯度密切相与含水量和纯度密切相关关青霉素的降解途径青霉素的降解途径青霉素的降解产物青霉素的降解产物青霉噻唑酸青霉素酶青霉噻唑酸青霉素酶青霉酸强酸性环境青霉酸强酸性环境青霉烯酸弱酸性环境青霉烯酸弱酸性环境青霉醛强酸性青霉醛强酸性-加热加热青霉胺强酸性青霉胺强酸性-加热加热/青霉素酶青霉素酶-重金属重金属降解产物降解产物二、鉴别反应二、鉴别反
12、应（一）显色反应（一）显色反应1、异羟肟酸铁反应、异羟肟酸铁反应NONHRO567SCOOHCH2R181234NaOHHNONHRO567SCOONaCH2R11234NHOHFe3+HNONHRO567SCOONaCH2R11234FeNHONH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH22.茚三酮反应茚三酮反应-氨基氨基-氨基氨基茚三酮茚三酮 蓝紫色蓝紫色3.双缩脲反应双缩脲反应 CONH（开环分解）（开环分解）-内酰胺类内酰胺类碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜紫紫4.与重氮苯磺酸反应与重氮苯磺酸反应橙黄色橙黄色重氮苯磺酸重氮苯磺酸 5 56 6OHHC（偶合）（偶合）酚羟基酚羟基头孢哌酮头孢哌酮
13、1.K+、Na+的火焰反应的火焰反应（二）各种盐的反应（二）各种盐的反应 焰色焰色鲜黄色鲜黄色 +醋酸氧铀锌醋酸氧铀锌黄黄 Na+焰色焰色紫色紫色 +0.1%四苯硼钠四苯硼钠 白白 K+2.沉淀反应（青霉素盐）沉淀反应（青霉素盐）遇酸遇酸白白青霉素青霉素青霉素钠青霉素钠青霉素钾青霉素钾+H+1、对结构已知或提纯的抗生素0%2）测定方法 进样供试液，用流动相A；（4）与金属离子的配位化合物反应酚羟基和烯醇基第二节 内酰胺类抗生素2、物理化学法（3）column temperature庆大霉素 pH212HPLC5 mg/ml 对照液（2）：-苯甘氨酸 0.头孢呋辛酯A异构体计算n1500。药物的
14、自身聚合物，来自于生产、贮存过程。6-氨基青霉烷酸（6-APA）；1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；硫酸链霉素、硫酸青大霉素的鉴别方法是绛红糖胺 +脱氧链霉胺 +加洛糖胺三氯化铁反应 B.（2）需要标准品对照，用外标法定量判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小3.重氮化重氮化 -偶合反应偶合反应 青霉素普鲁卡因普鲁卡因青霉素+H重氮化重氮化-偶合反应偶合反应红红 芳伯氨基芳伯氨基光谱法光谱法（三）（三）1、UV法法 样品、分解产物样品、分解产物nm339HA+苯苯唑唑青青霉霉烯烯酸酸苯苯唑唑青青霉霉素素Cu2+AEcm,min,max,%
15、11光谱图头孢氨苄头孢氨苄 max=262nm青霉素青霉素V钠钠 A280nm/A264nm=1.301.502、IR法法3180cm-1 N-H内酰胺内酰胺 C=O1690cm-1仲酰胺仲酰胺 C=O1250cm-1 C-O以阿莫西林为例以阿莫西林为例色谱法色谱法（四）（四）1、TLC法法对照品对照法对照品对照法和和斑斑点点颜颜色色比比较较供供试试品品对对照照品品相相同同条条件件fR2、HPLC法法Rt比比较较供供试试品品对对照照品品相相同同条条件件三、杂质检查三、杂质检查 药物药物 检查项目检查项目 检查方法检查方法 头孢他啶头孢他啶 聚合物聚合物 HPLCHPLC法法 头孢曲松钠头孢曲松
16、钠 头孢哌酮钠头孢哌酮钠 头孢噻肟钠头孢噻肟钠 头孢呋辛酯头孢呋辛酯 有关物质和异构体有关物质和异构体 HPLCHPLC法法 头孢氨苄头孢氨苄 有关物质有关物质 反相反相TLCTLC法法 青霉素钾（钠）青霉素钾（钠）吸收度吸收度 紫外分光光度法紫外分光光度法 1.1.头孢他啶聚合物的测定头孢他啶聚合物的测定 分子排阻色谱法分子排阻色谱法 固定相：葡聚糖凝胶固定相：葡聚糖凝胶G-10G-10 流动相流动相A A：3.5%3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.01mol/L0.01mol/L磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液液 流动相流动相B B：0.01%0.01%十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 对照品溶液：头孢他啶对
17、照品对照品溶液：头孢他啶对照品 100100g/mlg/ml 1 1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用子用1mg/ml1mg/ml蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖20002000、流动相、流动相A A测定；重测定；重复性用对照品溶液、流动相复性用对照品溶液、流动相B B测定。测定。N N不低于不低于900900，拖尾因子，拖尾因子0.0.751.5.5，峰面积的，峰面积的RSDRSD应小于应小于5.0%5.0%2 2）测定方法）测定方法 进样供试液，用流动相进样供试液，用流动相A A；进样对照液，用；进样对照液，用流动相流动相B B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物
18、以。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过头孢他啶计不得超过0.3%0.3%。2.2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：固定相：ODSODS 流动相：流动相：0.2mol/L0.2mol/L磷酸二氢铵磷酸二氢铵-甲醇（甲醇（62:3862:38）1 1）头孢呋辛酯）头孢呋辛酯2 2-异构体的制备：头孢呋辛酯对异构体的制备：头孢呋辛酯对 照品照品+流动相流动相 头孢呋辛酯头孢呋辛酯2 2-异构体。异构体。2 2）系统适用性试验：各异构体之间的）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5R1.5，以，以 头孢呋辛酯头孢呋辛酯A A异构体计算异构体
19、计算n1500n1500。2112RRttr异构体异构体A A异构体异构体B B头孢呋辛头孢呋辛3.3.头孢氨苄中有关物质的检查头孢氨苄中有关物质的检查-反相反相TLCTLC法法 固定相：活化后的硅胶固定相：活化后的硅胶G G板置板置5%5%（V/VV/V）正十四）正十四 烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干 展开剂：展开剂：0.1mol/L0.1mol/L枸橼酸枸橼酸-0.2mol/L-0.2mol/L磷酸氢二磷酸氢二 钠钠-丙酮（丙酮（120120：8080：3 3）供试液：本品供试液：本品 50mg/ml 50mg/ml 对照液（对照液（1 1）：本品）：本品
20、 0.5 mg/ml0.5 mg/ml 对照液（对照液（2 2）：）：-苯甘氨酸苯甘氨酸 0.5 mg/ml0.5 mg/ml 对照液（对照液（3 3）：）：7-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml0.5 mg/ml结果判断：供试液如显杂质斑点，与对结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（照液（2 2）（）（3 3）位置相同上所的斑点比）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑 点，与对照液（点，与对照液（1 1）所显的主斑点比较，）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。其颜色不得更深。4.4.青霉素钠（钾）的吸收度检
21、查：青霉素钠（钾）的吸收度检查：供试液供试液 1.80mg/ml1.80mg/ml，结果判断：结果判断：A A280280不得大于不得大于0.100.10（一）高效液相色谱法（一）高效液相色谱法原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。优化色谱分析条件优化色谱分析条件（1 1）Column -CN ODS CColumn -CN ODS C1818 C C8 8 -Ben -Ben（2 2）
22、mobile phase/flow ratemobile phase/flow rate（3 3）column temperature column temperature（4 4）detection wavelengthdetection wavelength（5 5）workstation sample preparationworkstation sample preparation四、含量测定四、含量测定-容量法和仪器分析法容量法和仪器分析法实验注意事项实验注意事项（1 1）色谱峰要达到较好的分离基线分离）色谱峰要达到较好的分离基线分离(base separation)(base se
23、paration)（2 2）需要标准品对照，用外标法定量）需要标准品对照，用外标法定量（3 3）可同时测定多个组分的含量）可同时测定多个组分的含量（4 4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰（二）生物样本中（二）生物样本中-内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析血浆血浆尿样尿样唾液唾液胆汁胆汁生物样生物样本本色谱柱：色谱柱：Hypersil ODS C18(200 mm4.6 mm,I.D.5m)样品制备：样品制备：取血浆取血浆200L，加入内标，加入内标5L，再加入，再加入HCLO4，窝旋提取窝旋提取Internal standard IS第三节第三
24、节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素苷苷苷苷元元糖糖缩缩合合+氨基糖苷氨基糖苷苷元苷元氨基糖氨基糖缩合缩合+链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素链霉素链霉素链霉胍链霉胍+链霉糖链霉糖+N甲基甲基L葡萄糖胺葡萄糖胺 苷元苷元糖糖链霉双糖胺链霉双糖胺链霉素：链霉素：链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺OOOOHOOHOHCH3CHOOHCH2OHOHOHHNCH3HNHNCCNHNH2NHH2N巴龙霉素巴龙霉素D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺+脱氧链霉胺脱氧链霉胺+D-+D-核
25、糖核糖+巴龙霉糖巴龙霉糖巴龙胺巴龙胺苷元苷元巴龙二糖胺巴龙二糖胺 糖糖 庆大霉素庆大霉素 糖糖 苷元苷元绛红糖胺绛红糖胺 +脱氧链霉胺脱氧链霉胺 +加洛糖胺加洛糖胺 糖糖 ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺绛红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺庆大霉素庆大霉素C复合物复合物 庆大霉素庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素庆大霉素C2a R=CH3 R1=R2=H 庆大霉素
26、庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3一一、结构与性质结构与性质多与硫酸成盐多与硫酸成盐链霉素链霉素 3 3个个庆大霉素庆大霉素 5 5个个碱性中心碱性中心碱性碱性（一）（一）水溶性水溶性溶解性溶解性（二）（二）链霉素链霉素 pH57.5庆大霉素庆大霉素 pH212 稳定稳定稳定性稳定性（四四）UV（三三）NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应坂口反应N-甲基葡萄甲基葡萄糖胺反应糖胺反应麦芽酚反应麦芽酚反应二二、鉴别鉴别 茚三酮反应茚三酮反应（一一）蓝蓝紫紫色色庆庆大大霉霉素素链链霉霉素素茚茚三三酮酮羟基胺结构羟基胺结构
27、（2）Molisch反应反应 具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成糠素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，加入醛或羟甲基糠醛，加入 萘酚（红紫色）萘酚（红紫色）或蒽酮（蓝紫色）或蒽酮（蓝紫色）OHOH2CCHOOHOH2CCHOHOHOH红紫色红紫色 （3）Elson-Morgan反应反应 水解产生的水解产生的N-甲基甲基-L-葡萄糖胺在碱性溶葡萄糖胺在碱性溶液中与乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再与对液中与乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物
28、。樱桃红色缩合物。OHOH2CCHOOOOH2COH2C蓝紫色蓝紫色 （4）麦芽酚反应链霉素的特征反应）麦芽酚反应链霉素的特征反应 链霉素水解得到的链霉糖经分子重排使环链霉素水解得到的链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺，甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍，生成再消除链霉胍，生成-甲基甲基-羟基羟基-吡喃酮吡喃酮（麦芽酚），该化合物与（麦芽酚），该化合物与Fe3+在弱酸性溶液中在弱酸性溶液中形成红紫色配位化合物。形成红紫色配位化合物。NH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2O NaOHOOO
29、HCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红紫红麦芽酚麦芽酚（5）坂口反应链霉胍的特有反应）坂口反应链霉胍的特有反应 向链霉素的水解产物链霉胍与向链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反应反应得产物得产物1；8-羟基喹啉也和羟基喹啉也和NaBrO2反应得产物反应得产物2。产物产物1和产物和产物2再相互作用生成橙红色化合物。再相互作用生成橙红色化合物。（八）色谱法（八）色谱法（1 1）TLCTLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液对照液 判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位判断：供试液与对照液所显
30、斑点的颜色与位 置应一致。置应一致。点样：供试液点样：供试液 对照液：硫酸链霉素标准品对照液：硫酸链霉素标准品 对照液：硫酸链霉素标准品对照液：硫酸链霉素标准品 +硫酸硫酸 新霉素标准品新霉素标准品+硫酸卡那霉素标准品硫酸卡那霉素标准品判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小 应与对照液应与对照液 相同，相同，对照液应显示分离清晰的对照液应显示分离清晰的3 3个斑点个斑点 否则试验无效。否则试验无效。（2 2）HPLCHPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保留比较供试液与对照液各组分的保留时间。时间。特殊杂质的检
31、查特殊杂质的检查（1）链霉素中链霉素）链霉素中链霉素B的检查的检查TLC法法硅胶硅胶G板（使用前需活化）、展开剂板（使用前需活化）、展开剂 甲苯甲苯-冰乙冰乙酸酸-甲醇（甲醇（50:25:25）、）、0.2二羟萘的乙醇二羟萘的乙醇20硫酸混合液硫酸混合液（2）庆大霉素中组分）庆大霉素中组分C的检查衍生化后的检查衍生化后HPLC色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索 组分组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的效价和临床疗效导致产品的效价和临床疗效+4 41010.pH吲哚衍生物吲哚衍生物巯基醋酸巯基醋
32、酸邻苯二醛邻苯二醛氨基氨基max=330nm衍生化原理衍生化原理 1.1.1-烷基硫代烷基硫代-2-烷基烷基异吲哚衍生物异吲哚衍生物RNH2+HSCH2COOHOH-CHOCHONRSCH2COOHRPHPLC方法方法 2.规定规定 C1 2550%C1a 1540%C2a+C2 2050%计算计算 3.%AAAAA%ACCCCiiaa1 10 00 0+1 11 1峰面积归一化法峰面积归一化法四四、含量测定含量测定微生物检定法微生物检定法 各国药典主要采用各国药典主要采用HPLC法法 常用于体内药分常用于体内药分 第四部分：四环素类抗生素第四部分：四环素类抗生素RRRRHN(CH3)2OHC
33、ONH2OOHOOHOHABCD410Trtracyclines TC 理化特性理化特性（1）酸碱两性）酸碱两性C4（二甲氨基）、（二甲氨基）、C10（酚羟基）酚羟基）（2）旋光性含有手性中心（一般为左旋）旋光性含有手性中心（一般为左旋）（3）紫外吸收特性具有共轭双键体系（吸收波长）紫外吸收特性具有共轭双键体系（吸收波长为长波方向）为长波方向）（4）与金属离子的配位化合物反应酚羟基和烯醇）与金属离子的配位化合物反应酚羟基和烯醇基基（5）不稳定性对各种外界条件，包括氧化剂、酸、）不稳定性对各种外界条件，包括氧化剂、酸、碱，易形成差向、脱水和异四环素，颜色加深碱，易形成差向、脱水和异四环素，颜色加
34、深RRRRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410RRRRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410弱酸性环境弱酸性环境ETC差向四环素差向四环素RH3CO HR HN(C H3)2O HC O N H2OO HOO HO HABCD410RR HN(C H3)2O HC O N H2OOO HO HO HABCD410C H366强酸性环境强酸性环境ATC脱水四环素脱水四环素RH3COHRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410RRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410CH366O碱性环境碱性环境EATC异四环素
35、异四环素差向脱水四环素差向脱水四环素二二、鉴别试验鉴别试验 浓浓H H2 2SOSO4 4反应反应（一一）黄色黄色朱红色朱红色绿绿蓝蓝深紫色深紫色盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸四环素盐酸四环素4 4 SOH盐酸美他环素盐酸美他环素橙红色橙红色FeCl3反应反应（二二）褐色褐色橙褐色橙褐色深褐色深褐色红棕色红棕色盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸四环素盐酸四环素3 3FeClTLCTLC法法（三三）盐酸土霉素的鉴别盐酸土霉素的鉴别 HPLC HPLC法法（五五）EDTAEDTA 克服痕量金属造成的克服痕量金属造成的 拖尾现象
36、拖尾现象比较保留时间比较保留时间三三、特殊杂质检查特殊杂质检查 4-4-差向四环素（差向四环素（ETCETC）脱水四环素脱水四环素（ATCATC）差向脱水四环素差向脱水四环素（EATCEATC）盐酸金霉素盐酸金霉素（CTCCTC）有关物质有关物质（一一）HPLCHPLC法（法（20002000版）版）盐酸四环素盐酸四环素四环素有关物质四环素有关物质TLCTLC图图I.供试液供试液(5 mg/ml)ETC(0.2 mg/ml)ATC(0.025 mg/ml)IV.EATC(0.025 mg/ml)CTC(0.1 mg/ml)VI.混合液混合液40.50.52吸收度吸收度（二）（二）nmmax35
37、53556868、盐酸四环素盐酸四环素杂质吸收度杂质吸收度 取供试品配成每取供试品配成每10mg/ml10mg/ml的溶液至的溶液至4cm4cm的吸收池中，在的吸收池中，在530nm530nm处测定，其吸处测定，其吸收度不得超过收度不得超过0.120.12。应严格控制温度和时间应严格控制温度和时间四四、含量测定含量测定HPLCHPLC法法 盐酸四环素的测定盐酸四环素的测定 系统适用性试验：盐酸四环素、有关系统适用性试验：盐酸四环素、有关 物质及物质及ATCATC峰间的峰间的 分离度均应符合要分离度均应符合要 求。求。定量方法：外标法以峰面积计定量方法：外标法以峰面积计。第五节 抗生素类药物中高
38、分子 杂质的检查1.1.高分子杂质高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。分子量大于药物本身的杂质总称。蛋白、多肽、多糖或抗生素蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。霉噻唑多肽。药物的自身聚合物，来自于药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。生产、贮存过程。可引发过敏。外源性杂质外源性杂质内源性杂质内源性杂质2 2、基本特点对青霉素而言、基本特点对青霉素而言青霉噻唑多肽外源性的（青霉噻唑多肽外源性的（24003500）青霉素聚合物内源性的（
39、聚合度）青霉素聚合物内源性的（聚合度）母核参与的聚合反应母核参与的聚合反应N N型聚合反应型聚合反应 侧链参与的聚合反应侧链参与的聚合反应L L型聚合反应型聚合反应分类分类（1 1）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，易与药物形成多肽类杂质产品中，易与药物形成多肽类杂质（2 2）形成的聚合物也可发生不同程度的降解）形成的聚合物也可发生不同程度的降解（3 3）异构体之间可以相互聚合）异构体之间可以相互聚合L-L、D-D、L-D（4 4）高分子杂质与生产工艺密切相关）高分子杂质与生产工艺密切相关特点特点高分子杂质的控制方法高分子杂质的控制方法（1 1）高效
40、液相色谱法）高效液相色谱法（2 2）凝胶色谱自身对照外标法）凝胶色谱自身对照外标法 Sephadex G-10（3 3）离子交换色谱）离子交换色谱凝胶色谱法：利用凝胶的分子筛作用，让药凝胶色谱法：利用凝胶的分子筛作用，让药物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻的原理进行的。故此大分子则子杂质被排阻的原理进行的。故此大分子则先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。高分子杂质的分析方法高分子杂质的分析方法（1）蓝色葡聚糖在高分子分离中的）蓝色葡聚糖在高分子分离中的 N2500/m，拖尾因子，拖尾因子0.751.5
41、（2）峰面积的）峰面积的RSD5色谱适用性条件色谱适用性条件HPLCHPLC系统系统简单测定系统简单测定系统分析方分析方法法练习与思考练习与思考AA型题型题 1.1.硫酸链霉素、硫酸青大霉素的鉴别方法是硫酸链霉素、硫酸青大霉素的鉴别方法是A.A.三氯化铁反应三氯化铁反应 B.B.硫色素反应硫色素反应 C.C.茚三酮反应茚三酮反应 D.D.与碱性酒石酸铜试液反应与碱性酒石酸铜试液反应 E.E.双缩脲反应双缩脲反应2.2.青霉素钠青霉素钠中国药典中国药典规定的含量测规定的含量测定方法为定方法为A.A.非水溶液滴定法非水溶液滴定法 B.B.旋光法旋光法 C.HPLCC.HPLC法法 D.D.紫外分光法紫外分光法 E.E.汞量法汞量法
