基因诊断和基因治疗分子生物学课件.ppt

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资源描述

1、学会选择 懂得放弃愿意奋斗 知道感恩二代基因测序技术用于临床诊断2011,临床研究性应用无创产前基因检测癌症及其他疾病风险的基因检测神话般的“基因体检”国内基因测序诊断产品无一经过医疗器械审批注册二、自本通知发布之日起,包括产前基因检测在内的所有医疗技术需要应用的检测仪器、诊断试剂和相关医用软件等产品,如用于疾病的预防、诊断、监护、治疗监测、健康状态评价和遗传性疾病的预测,需经食品药品监管部门审批注册,并经卫生计生行政部门批准技术准入方可应用。已经应用的,必须立即停止。基因诊断基因诊断Gene Diagnosis李文强李文强生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室河南省生物精神病学

2、重点实验室河南省生物精神病学重点实验室一.基因诊断的基本概念和特点一.基因诊断的基本概念和特点25%的生理缺陷、30%的儿童死亡都是由遗传病引起,基因与人类健康的关系如此紧密,实现基因诊断成为现代医学必然需求主要内容一基因诊断的基本概念和特点二基因诊断的内容和基本策略三基因诊断的基本步骤四基因诊断的常用技术方法五基因诊断的应用及意义一.基因诊断的基本概念和特点生化诊断免疫诊断表型分析临床诊断一.基因诊断的基本概念和特点DNA确定为遗传物质1976年加州大学华裔科学家简悦威用核酸分子杂交首次对珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断人类基因组计划人类单体型计划千人基因组计划疾病与基因的关系愈加明晰,基因诊断

3、进入快速发展期一.基因诊断的基本概念和特点狭义:在基因(DNA或RNA)水平,用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程,对疾病作出诊断。广义:应用于DNA指纹分析、个体识别、亲子鉴别等司法鉴定,动植物检疫以及转基因动植物中阳性基因的检测等方面。一.基因诊断的基本概念和特点目标疾病:与基因有关内源性基因变异疾病(先天/后天)单基因病多基因病获得性基因病 外源性基因(如病毒等)侵入机体引起的疾病一.基因诊断的基本概念和特点特点针对性强:特定基因特异性高:针对序列的定性定量灵敏度高:实现单分子诊断稳定性高:遗传物质的稳定性,相对于表型应

4、用范围广:早期诊断,全程诊断一.基因诊断的基本概念和特点实现基因诊断的要素疾病或个体表型的本质明确遵循生物遗传学基本规律分子生物学技术与方法可靠完备二.基因诊断的基本策略和内容基本策略基因诊断策略基因诊断策略致病基因检测连锁遗传标志检测基因表达定量分析表型克隆基因分析二.基因诊断的基本策略和内容基本内容1.检测个体的基因序列的特征(多态性)镰刀状红细胞贫血:珠蛋白基因的第六个密码子AT,表达产物:谷氨酸缬氨酸2.基因突变分析(碱基插入,缺失,倒位等)杜氏肌营养不良:DMD基因突变以缺失二.基因诊断的基本策略和内容基本内容3.基因表达产物分析对mRNA进行分析(AFP)4.检测是否存在外源基因感

5、染性疾病5.基因连锁分析存在遗传标记的疾病三.基因诊断的基本步骤1.获得待检样品2.分离纯化DNA或RNA3.选择合适的技术手段4.基因检测分析技术上已无任何障碍,继续向简便化、高通量、低成本努力四.基因诊断的常用技术方法1.核酸分子杂交2.PCR及相关技术3.核酸序列分析技术4.限制性酶谱分析技术5.基因芯片核酸分子杂交和PCR是基因诊断的基本技术四.基因诊断的常用技术方法1.核酸分子杂交Southern blotNorthern blot Dot hybridizationReverse dot hybridizationFISH:fluorescence in situ hybridiz

6、ation四.基因诊断的常用技术方法1.核酸分子杂交 是指单链核酸分子(DNA或RNA)在特定条件下,与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。碱基互补:DNA与DNA杂交:A=T、GC DNA与RNA杂交:A=U、GC 变性:在一定温度下,使核酸双链解开为两条单链;复性:随温度逐渐恢复,变性的两条单链重新形成互补双链四.基因诊断的常用技术方法1.核酸分子杂交利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理,可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针,与待测样本中的单链核酸互补配对,以判断有无互补的同源核酸序列的存在。四.基因诊断的常用技术方法Southern blot是早期基因诊断的主力是早期基因诊

7、断的主力四.基因诊断的常用技术方法FISHFISHFISH荧光染色体原位杂交应用最为广泛荧光染色体原位杂交应用最为广泛四.基因诊断的常用技术方法点杂交Dot hybridizationA AC C探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子突变型野生型2.PCR及相关技术四.基因诊断的常用技术方法2.PCR及相关技术四.基因诊断的常用技术方法正常人患者扩增电泳四.基因诊断的常用技术方法3.核酸序列分析技术正常对照正常对照病例病例SOX9SOX9基因基因HMG boxHMG box内发生单碱基置换突变内发生单碱基置换突变患儿患儿最直接、最确切的基因诊断方法四.基因诊断的常用技术方法4.限制性酶谱

8、分析技术最经典的基因诊断方法HMN四.基因诊断的常用技术方法5.基因芯片基因芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术多基因多位点,基因表达分析,药物敏感分析五.基因诊断的应用及意义1.遗传性疾病的基因诊断2.肿瘤的基因诊断3.传染病的基因诊断4.个体识别和物证分析五.基因诊断的应用及意义1.遗传性疾病的基因诊断辅助遗传病的临床诊断单基因遗传病的基因诊断:已不存在任何技术障碍 产前诊断:高危人群,优生优育 1.1kb五.基因诊断的应用及意义1.3kb1.1kb0.2kb123 1、正常人、正常人 2、突变携带者、突变携带者 3、患者、患者 1.1 kb 1.3kb正常基因正常基因突变基因突变基因PC

9、R-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变五.基因诊断的应用及意义1.遗传性疾病的基因诊断疾病易感性及患病风险预测 遗传病患病风险分析:常见遗传病遗传筛查,疾病易感性预测性诊断:疾病易感基因检测 在一些有明显遗传倾向的肿瘤中,这二类基因的突变与肿瘤发生有密切关系例:视网膜母细胞瘤与RB基因 李-佛美尼症候群综合征与p53基因 乳腺癌与BRCA-1基因 五.基因诊断的应用及意义2.肿瘤的基因诊断检测异常表达基因:甲胎蛋白检测肿瘤细胞基因变异:甲基化改变,序列改变肿瘤易感基因变异:易感基因p53、p21 五.基因诊断的应用及意义3.传染病的

10、基因诊断检测病原体的遗传物质检测病原体引起的基因表达 多采用荧光定量PCRHBVHBV病毒病毒HIV病毒病毒SARS病毒病毒五.基因诊断的应用及意义4.个体识别和物证分析嫌疑人生物材料的物证分析亲缘关系 物证12 3 4五.基因诊断的应用及意义意义疾病诊断和风险预测的有力工具是遗传病预防的基本支撑可用于疗效评价和个体化用药指导未来医学基本支撑点是个体识别和法医学的核心技术存在的问题技术上需要简便、可靠、低成本理论上需要普及降低专业依赖性临床化 基因治疗基因治疗Gene Therapy李文强李文强生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室河南省生物精神病学重点实验室河南省生物精神病学重

11、点实验室2012年11月3日,欧盟委员会批准了西方世界首个基因治疗药物Glybera,标志着修复基因缺陷的新颖医疗技术的一个里程碑。该药用于治疗一种极其罕见的遗传性疾病脂蛋白脂肪酶缺乏症。预计每名患者的花费将高达125万欧元(约合160万美元),该药将创造昂贵现代医药的新纪录。1990年,美国批准了第一例临床基因治疗申请。患者为四岁女孩,由于缺失腺苷脱氨酶(ADA)基因而患有严重综合性免疫缺陷症。腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)治疗策略:淋巴细

12、胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%维持免疫系统功能 改善病人症状 Ashanti de Silva,Now 26主要内容一基因治疗的概念和特点二基因治疗的基本策略三基因治疗的基本方法四基因治疗的应用五基因治疗的意义及前景一基因治疗的概念和特点经典概念(狭义概念):将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的基因,从而达到治疗疾病的目的。广义概念:将某些遗传物质转移至患者体内,使其在体内表达,或者在基因水平改变基因的表达,最终达到治疗某种疾病的方法,均称之为基因治疗。一基因治疗的概念和特点拓展了传统医学的理论体系从病因上解决部分疾病的治疗问题为大量遗传病提供了治疗手段能带动医学和生命科学

13、的整体进展二基因治疗的基本策略1.基因置换 2.基因增补 3.基因干预 4.“自杀基因”5.免疫基因治疗6.耐药基因治疗 二基因治疗的基本策略1.基因置换 2.基因增补 3.基因干预 4.“自杀基因”5.免疫基因治疗6.耐药基因治疗 二基因治疗的基本策略1.基因置换 定义:指将特定的目的基因导入特定细胞,通过定位重组,以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。目的:将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复,不涉及基因组结构的任何改变。二基因治疗的基本策略1.基因置换 要实现基因置换,需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。定向导入的发生

14、率约1/100万,采用胚胎干细胞培养的方法,这种同源重组的检出率最高可达1/10。二基因治疗的基本策略2.基因增补定义:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:A:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因,补偿缺陷基因的功能而细胞内的缺陷基因并未除去;B:向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因,利用其表达产物达到治疗疾病的目的。二基因治疗的基本策略2.基因增补目标位点目的基因基因载体染色体二基因治疗的基本策略3.基因干预定义:采用特定的方式抑制某个基因的表达,或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达,以达到治疗疾病的目的。(区别于抗生素的基因水平调节)二基因治疗的基本策略4.“自杀基

15、因”定义:自杀基因又称前体药物酶转化基因,这种基因导入受体细胞后可产生一种酶,它可将原来无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒性物质,将细胞本身杀死,这种基因被称为“自杀基因”,可以通过整合位点等选择目标细胞。二基因治疗的基本策略5.免疫基因治疗定义:通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织,以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。6.耐药基因治疗 定义:化疗过程中,把产生抗药物毒性的基因导入患者体内,从而使患者能耐受更大剂量的化疗。三基因治疗的基本方法1.治疗性基因的获得在了解疾病发生的分子机制基础上,选择对疾病有治疗作用的特定基因。如,对单基因缺陷遗传病,可用野生型(非突变)基因即可用于

16、治疗;对于肿瘤,最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因的获得有赖对疾病病因和病理机制的深入研究三基因治疗的基本方法2.基因载体的选择基因治疗关键步骤之一,是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体:逆转录病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体等;非病毒载体:脂质体,受体介导等采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。三基因治疗的基本方法2.基因载体的选择容易生产持续表达弱免疫源复制、分裂和整合能力能感染分裂期细胞和未分裂期细胞 逆 转 录 病 毒逆 转 录 病 毒(RV)(RV)慢病毒慢病毒(HIV(HIV、

17、FIVFIV等等)腺病毒腺病毒(Ad)(Ad)腺 相 关 病 毒腺 相 关 病 毒(AAV)(AAV)单 纯 疱 疹 病单 纯 疱 疹 病毒毒(HSV)(HSV)基 因 组 大 小基 因 组 大 小(kb)(kb)8 811119.29.29.79.735354.64.6152152核酸类型核酸类型RNARNARNARNADNADNADNADNADNADNA外 源 基 因 容外 源 基 因 容量量约约10kb10kb约约10kb10kb7 78kb8kb约约4kb4kb可达可达30kb30kb重 组 病 毒 滴重 组 病 毒 滴度度较高较高较高较高非常高非常高高高相对低相对低靶细胞状态靶细胞状

18、态分裂期细胞,分裂期细胞,表 面 须 有 特表 面 须 有 特殊受体殊受体分 裂 期 细 胞分 裂 期 细 胞及 非 分 裂 期及 非 分 裂 期细胞细胞分裂期细胞及分裂期细胞及非分裂期细胞非分裂期细胞分 裂 期 细 胞分 裂 期 细 胞及 非 分 裂 期及 非 分 裂 期细胞细胞分 裂 期 细 胞分 裂 期 细 胞及 非 分 裂 期及 非 分 裂 期细 胞,嗜 神细 胞,嗜 神经性经性基因整合基因整合随机整合随机整合随机整合随机整合不整合不整合定点整合定点整合不整合不整合外 源 基 因 表外 源 基 因 表达情况达情况瞬时表达瞬时表达/稳稳定表达定表达瞬时表达瞬时表达/稳稳定表达定表达瞬时表

19、达瞬时表达稳定表达稳定表达瞬时表达瞬时表达主要病毒载体的特点比较主要病毒载体的特点比较三基因治疗的基本方法3.靶细胞的选择 体细胞生殖细胞只限于某一体细胞的基因的改变限于个体当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代对生殖细胞进行基因治疗,可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其对生殖细胞进行基因治疗,可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因,理论上讲是根治遗传病的理想方法。后代均具有正常基因,理论上讲是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题,目前基因治疗中禁止使用生殖细胞但由于涉及安全性和伦理学问题,目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞。作为靶细胞。三基因治疗的基本方法

20、3.靶细胞的选择较坚固,耐受处理,易于由人体分离,便于输 回体内具有增殖优势,生命周期长,能存活几个月或几年,至病人的整个生命易于受外源遗传物质的转化。在选用病毒载体时,目的基因具表达最好具有组织特异 性的细胞成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞 三基因治疗的基本方法4.基因转移方法导入方法:直接体内疗法 间接体内疗法 化学方法物理方法膜融合法载体法直接注射磷酸钙法DEAE葡聚糖法电穿孔法粒子轰击法(基因枪法)间接体内直接体内三基因治疗的基本方法载体载体目的基因目的基因靶细胞三基因治疗的基本方法5.治疗基因的受控表达时间:在患者需要实施治疗时才表达,而平时不需要进行治疗时则

21、处于关闭状态空间:限制治疗基因只在靶细胞中表达,避免治疗基因指导合成的蛋白质干扰非靶细胞的正常生活,产生毒副作用表达水平:既要考虑治疗效果,又要避免副作用基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境三基因治疗的基本方法5.治疗基因的受控表达基因内部调节机制使用正常细胞或病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件酪氨酸酶是皮肤细胞产生色素途径中的一种酶,可利用其启动子驱动治疗基因只在皮肤细胞中表达,治疗某些皮肤病。甲胎蛋白(AFP)基因在成年肝脏细胞中表达,可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因)在癌细胞中表达,杀死癌细胞。三基因治疗的基本方法5.治疗基因的受控表达基因外部的调节机制基因携

22、带调控序列,通过施加外部刺激,促进治疗基因在特定细胞或组织中表达热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因,可以通过对病灶局部进行热处理,达到使治疗基因特异性表达的目的。电离辐射可以诱导Egr-1基因表达,将其调控序列启动的治疗基因(如肿瘤坏死因子基因)导入肿瘤组织,可在电离辐射作用下,使治疗基因获得暂时性的局部表达,杀死肿瘤细胞。四环素诱导表达。三基因治疗的基本方法5.治疗基因的受控表达利用病灶微环境使治疗基因特异性表达病灶微环境与正常时往往不同,因此可利用这些变化控制治疗基因的表达机体发炎可产生许多急性期蛋白,其基因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达,炎症消失治疗基因的表达也终止。肿

23、瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞,造成肿瘤内部缺氧,缺氧条件可以通过缺氧诱导因子和缺氧响应元件(HRE)相互作用,调节治疗基因的表达,而在正常组织中不表达。三基因治疗的基本方法6.体外细胞回输体内基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中;将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织;采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞;或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。四基因治疗的应用遗传病的基因治疗肿瘤的基因治疗病毒性疾病的基因治疗四基因治疗的应用遗传病的基因治疗单基因缺陷疾病仅限体细胞的基因治疗靶细胞易获取、培养、及回输体内治疗效果应胜过对病人的危害表达水平无需调控且无副作用需经动物实

24、验验证安全可行 可供选择并符合上述4条以上要求的不过只有30余种遗传病四基因治疗的应用遗传病的基因治疗腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症 珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 血友病和其他血浆蛋白缺乏症 苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征 家族性高胆固醇血症 囊性纤维化病 四基因治疗的应用肿瘤的基因治疗通过基因置换和基因补充,导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移抑制癌基因的活性,通过干扰癌基因的转录和翻译,发挥抑癌作用增强肿瘤细胞的免疫原性,通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰,刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应通过导入“自杀基

25、因”杀伤癌细胞提高化疗效果的辅助基因治疗四基因治疗的应用肿瘤的基因治疗临床研究最多市场前景最大手段最多四基因治疗的应用病毒性疾病的基因治疗通过导入免疫活化因子基因或者抗原基因调节机体免疫应答,增强免疫反应的活性和能力 乙肝通过导入抑制病毒生长繁殖的基因,抑制病毒增殖 艾滋病75%的人类传染病是由病毒引起的五基因治疗的问题及前景难以获得真正有治疗作用的基因 外源基因的表达难以在体内精确调控体细胞经体外培养后,其生物学特性会有改变过多的外源蛋白对机体带来可能的影响随机整合潜在的威胁36岁的乔妮莫尔患有风湿性关节炎,2007年2月26日第一次接受基因治疗,7月2日,接受了第二次基因治疗,第二天乔妮感

26、觉周身不适,体温上升到38.50,后上升到400,7月24日,乔妮因全身广泛性出血和肝衰竭而死亡。进行基因治疗使用的是西雅图的目标遗传公司研发的一种制剂,称为tgAAC94,载体为腺相关病毒,携带一种编码TNF抑制蛋白的基因。迄今尚未确定导致死亡的原因。最后安全原则:基因疗法现在还不成熟,因此不是无法治疗的疾病不宜用基因疗法来试验的知情同意:知情同意书需要病人带回家中阅读并病人仔细考虑,而不能在第一次看完协议就签字利益回避:二是当病人的大夫是一项研究的主要研究者时,应当由他人提出建议,即应该遵守回避原则乔妮的死亡背后还有不可低估的商业因素。风湿性关节炎是仅在美国每年就有30亿美元用于该病的治疗

27、。2000年,NIH前主任瓦姆斯(Vamus)就透露,在美国共发生691例利用腺相关病毒进行基因治疗试验的严重事件,但向NIH汇报的只有39例。前景很好:错误总是有的,要不然前进的道路上会人满为患 问题很多:安全性首当其冲,伦理冲突也很严重1962年Szybalski等人类DNA去转化人类细胞,发现Ca2有刺激DNA转入细胞的作用,为人工转移遗传物质迈出第一步。1967年Nirenberg提出遗传工程空用于人类基因治疗。1968年Burnett等用DEAE协同转移的方法将病毒导入培养细胞。1972年Grahant等对磷酸钙介导的DNA转移过程进行了详细的研究,使这一技术得到普遍的接受和应用。7

28、0年代初Graessman和Dicumak奠定了用显微注射法转移基因。1973年美国科学家和几名医生在德国进行了首次基因治疗实验。病人是一对体内缺乏一种稀有酶的姐妹研究人员将一种携带有可使病人本身的酶分泌恢复正常的的病毒-肖普化乳头瘤病毒注入患者体内。实验无疗效也无副作用。1980年美国医生对两名严重地中海贫血患者进行基因治疗,但也未能获得成功。1988年美国国家卫生研究院重组DNA咨询委员会首次批准将标记基因导入肿瘤浸润淋巴细胞的实施方案。其结果对病人无害作用。基因治疗逐渐解禁。1990年9月研究人员把线杆脱氢酶基因转入患者体内,其症状明显缓解,治疗获得成功。在1991年中国复旦大学的研究人员进行了“成纤维残暴基因治疗血友病B”项目,此外还开展了针对肿瘤和血液病的基因治疗。2000年9月,一名18岁的男青年因基因治疗而死于美国费城。美国科学杂志曾连续刊登了美国食品和药品管理局(FDA)宣布暂时禁止某大学进行基因治疗试验的报导。截至2005年7月,全世界已获准的基因治疗临床实验方案达1076项,其中,66%是针对癌症的治疗。

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