1、重庆医科大学重庆医科大学 彭志平彭志平哈尔滨医科大学第一医院哈尔滨医科大学第一医院 杨志杰 以放射性核素或其他非放射性物质标记以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。的微量生物活性物质的检测技术。体外分析技术建立的基础体外分析技术建立的基础:配体配体-结合体结合体 抗原抗原-抗体的免疫结合反应；抗体的免疫结合反应；配基配基-受体的结合反应；受体的结合反应；底物底物-催化酶之间的酶促反应；催化酶之间的酶促反应；激素激素-激素结合球蛋白的结
2、合反应。激素结合球蛋白的结合反应。方法学基础：结合反应动力学规律方法学基础：结合反应动力学规律体外分析技术体外放射分析体外放射分析体外非放射分析体外非放射分析放射性竞争放射性竞争结合分析结合分析放射性非竞放射性非竞争结合分析争结合分析radioimmunoassay,immunoradiometric assay,Dr.Yalow（一）竞争抑制结合反应：（一）竞争抑制结合反应：放射免疫分析是在体外条件下，由足量的放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合的竞争抑制结合
3、反应。反应。Ag-Ab +Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab +*Ag(B)(F)4*Ag与与Ag 免疫活性相同免疫活性相同4*AgAg AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg *Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag *Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag+Ag标准曲线的绘制方法标准曲线的绘制方法用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和和F；
4、分别测量分别测量B和和F的放射性；的放射性；用反应变量（如用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。量反应曲线。Ag2550100 200 400 800*AgAb分离分离B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456浓度浓度B%标标 准准 曲曲 线线未知样品的测量未知样品的测量Ag2550100 200 4
5、00 800*AgAb分离分离B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？B%F%B/FCalibration Curve60I.标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本相同的免疫活性，即质同。相同的免疫活性，即质同。他们的化学结构和化学性质要相同，对特他们的化学结构和化学性质要相同，对特异性抗体的亲和力要相同。并且，标准抗异性抗体的亲和力要相同。并且，标准抗原与待测抗原所处的介质条件要相同。原与待测抗原所处的介质条件要相同。II.标准抗原的定量要准确：标准抗原的定量要准确：整个整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量，分析系统的定量基础就是
6、标准抗原的量，因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的标准品相比有良好的可比性。标准品相比有良好的可比性。只有保证标准抗原的准确定量，才能保证只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析分析系统的准确度和精确度。系统的准确度和精确度。III.标准抗原必须高纯度：标准抗原必须高纯度：标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免杂质对反应和计量的影响。杂质对反应和计量的影响。IV.标准抗原的稳定性要好：标准抗原的稳定性要好：要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应该
7、不发生降解，分离、破坏等。该不发生降解，分离、破坏等。标记抗原的要求标记抗原的要求I.质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。质和免疫活性要相同。II.标记抗原要有适当高的放射性比活度。标记抗原要有适当高的放射性比活度。比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。但过高的比活度，也会引起
8、诸如辐射自分解和免疫活性受损但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损的问题的问题。III.标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免的免疫反应和动力学参数产生影响。疫反应和动力学参数产生影响。由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。原一般要经过重新提纯后才能再次使用。IV.标记抗原的稳定性要好：标记抗原的稳定性要好：和标准抗原相比，标记抗原由
9、于有了放射性核素和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。射线的影响，更容易发生分解。在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。包括多克隆抗体和单克隆抗体。包括多克隆抗体和单克隆抗体。抗体的质量之间关系到抗体的质量之间关系到RIA分析方法的灵敏度分析方法的灵敏度和特异性。和特异性。多克隆抗体一般是用抗原免疫年轻、健康的纯种多克隆抗体一般是用抗原免疫年轻、健康的纯种小动物（一般是羊或兔子）而诱发产生的抗血清。小动物（一般是羊或兔子）而诱发产生的抗血
10、清。制备的方法成熟、简便、生产量大；但是里面成制备的方法成熟、简便、生产量大；但是里面成份复杂，免疫反应的动力学规律复杂。份复杂，免疫反应的动力学规律复杂。单克隆抗体是通过杂交瘤技术筛选制备的，成份单克隆抗体是通过杂交瘤技术筛选制备的，成份单一、稳定、特异性强；但成本较高。单一、稳定、特异性强；但成本较高。抗体的要求（抗体的要求（三高三高）2.交叉反应率：交叉反应率：指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。特异性。在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似的类似物，例如甲状腺素中就有很
11、多相似的类似物，例如甲状腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。异性就越强。常用常用50%置换法来测定交叉反应的百分率。置换法来测定交叉反应的百分率。即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者在其结合率为零管结合率（比较两者在其结合率为零管结合率（B/B0=50%）时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应
12、百分率，时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物的相应活力。也就是该抗体对被测物某种类似物的相应活力。（三）特异性分离方法（三）特异性分离方法（一）误差的分类和来源：（一）误差的分类和来源：（二）质量控制（二）质量控制质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。降低到某一允许水平。具体作用有：具体作用有：1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2识别误差的来源并消除其原因。识别误差
13、的来源并消除其原因。3改进测定方法的设计以提高质量。改进测定方法的设计以提高质量。回收管内加入的已知量对照管测量值回收管测量值回收率（3）健全性评价：）健全性评价：主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。致。用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品稀释曲线，如果样品与标准品免疫活性相同，得到稀释曲线，如果样品与标准品免疫活性相同，得到的曲线应该是一组平行的曲线，所以又称为平行性的曲线应该是一组平行的曲线，所以又称为平行性实验。实验。3.灵敏度（灵敏度（sensitivity）：）：是指是指RIA
14、方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在统计学上区别开来的抗原最低剂量，即该统计学上区别开来的抗原最低剂量，即该RIA方法方法的最小可检测量。的最小可检测量。确定灵敏度的方法主要有：确定灵敏度的方法主要有：同一样品同一样品10次测量结果的次测量结果的B/B090的剂量的平的剂量的平均值作为最小可测量。均值作为最小可测量。以以10次测量结果的次测量结果的B0管结合率均值减去管结合率均值减去2SD（标（标准差）的结合率的剂量对应值为最小可测量。准差）的结合率的剂量对应值为最小可测量。4.特异性：特异性：方法的特异性主要取决于抗体的特异性。方法的特异性主要取决于抗体的
15、特异性。用用抗体的交叉反应率来表示。抗体的交叉反应率来表示。5.稳定性：稳定性：测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各个参数的稳定性来间接反映。个参数的稳定性来间接反映。如标准曲线的斜率和截距，零标准管结合率的如标准曲线的斜率和截距，零标准管结合率的75%、50%、25%处的剂量值处的剂量值(ED75、ED50、ED25等等)。五、五、RIA的方法学的方法学（一）反应方式：（一）反应方式：1.平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、标记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。标记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。优
16、点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体优点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体有相同的反应几率，操作方便，精密度较好，有相同的反应几率，操作方便，精密度较好，稳定性好。稳定性好。缺点：反应时间长，灵敏度较差。缺点：反应时间长，灵敏度较差。2.顺序加样法：先将非标记抗原与抗体温育反应一定顺序加样法：先将非标记抗原与抗体温育反应一定时间（时间（624小时），形成抗原抗体复合物后，然后小时），形成抗原抗体复合物后，然后再加入标记抗原短时间（再加入标记抗原短时间（14小时）温育后中止反小时）温育后中止反应。应。优点：使非标记抗原与抗体结合的几率比标记抗原优点：使非标记抗原与抗体结合的几率比标记抗原高，提高
17、了非标记抗原的竞争能力，提高了方法的高，提高了非标记抗原的竞争能力，提高了方法的灵敏度。灵敏度。3.添加剂：添加剂：0.5牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、抗体的吸附。抗体的吸附。0.01mol/l EDTA钠盐：多功能的螯合剂，可以去除钠盐：多功能的螯合剂，可以去除样品中的钙镁离子。样品中的钙镁离子。0.05叠氮钠：防腐剂。叠氮钠：防腐剂。RIA的操作一般包括加样、孵育、分离、测量和数据处的操作一般包括加样、孵育、分离、测量和数据处理理5个部分。个部分。1.加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所处的介
18、质环境也要一致。处的介质环境也要一致。2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是一般是37。3.分离：选择好的分离方法进行分离。分离：选择好的分离方法进行分离。4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。测量：测量游离或结合物部分的放射性。5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。*Ab+Ag-*Ab +*AbAg（B）（F）在体外条件下在体外条件下,利用利用Ag与过量的与过量的*Ab的非竞争性结合的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag
19、量的量的一种超微量分析技术。一种超微量分析技术。拟合的拟合的标准曲线标准曲线拟合的拟合的NSB拟合的拟合的标准曲线标准曲线拟合的拟合的NSBIRMA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线RIA的标准曲线及的标准曲线及非特异结合曲线非特异结合曲线IRMA与与RIA工作原理的主要区别工作原理的主要区别酶酶标记免疫分析技术标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术荧光免疫分析技术荧光免疫分析技术镧系镧系元素（元素（1515）：铕（）：铕（EuEu），），钐钐（SmSm），），镝（镝（DyDy），），鋱（鋱（TeTe）Eu+EuEu+增强液增强液+Eu“解离增强镧系荧光免疫分析解离增强镧系荧光免疫分析”荧光衰退时间荧光衰退时间铕：铕：730000 ns钐：钐：50000 ns一般荧光物质：一般荧光物质：10 ns铕的铕的荧光荧光
