1、生化分离工程生化分离工程破碎缓冲液破碎缓冲液 一般为一般为0.1-0.2mol/L，pH为为78的磷酸盐缓冲液或的磷酸盐缓冲液或Tris缓缓冲液（与细胞内环境相似）冲液（与细胞内环境相似）抗氧化剂：抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外界氧化环境。界氧化环境。eg.二硫苏糖醇二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇巯基乙醇 2-BME，半胱氨酸半胱氨酸Cys、谷胱甘肽、谷胱甘肽GSH（还原型）（还原型）酶抑制剂：酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯、巯基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋
2、白酶EDTA，etcPVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）细胞破碎（细胞破碎（Cell disruption）G+：典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型典型E.Coli，肽聚糖，肽聚糖10%不同类型不同类型细菌细菌的的细胞壁结构细胞壁结构成分：成分：细胞壁组成细胞壁组成G+G-肽聚糖肽聚糖60-95%10%磷壁酸磷壁酸有有0类脂质类脂质一般无一般无约约20%蛋白质蛋白质0较高较高 酵母菌：酵母菌：由由甘露聚糖甘
3、露聚糖、蛋白质蛋白质和和葡聚糖葡聚糖组成的组成的“三明三明治治”结构，其中结构，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度葡聚糖主要维持细胞壁强度4.1 细胞破碎技术细胞破碎技术机械法机械法非机械法非机械法珠磨法、珠磨法、压榨法压榨法高压匀浆、超声破碎、高压匀浆、超声破碎、撞击法撞击法固体剪切作用固体剪切作用液体剪切作用液体剪切作用1）酶溶法）酶溶法2）化学法）化学法3）物理法）物理法干燥处理干燥处理溶胞作用溶胞作用超临界细胞破碎超临界细胞破碎1、机械方法破碎、机械方法破碎 1）珠磨法）珠磨法（bead milling）：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，
4、细胞与研磨剂之间相互璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物2）高压匀浆法）高压匀浆法（）阀座阀座阀阀撞击环撞击环2、细胞物理破碎方法、细胞物理破碎方法3、化学法破碎、化学法破碎4、4、自溶：自溶：通过调节温度、通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生溶解自身酶的方法使细胞产生溶解自身酶的方法 溶菌酶溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法是酶法溶胞中最常用的方法 但其但其高成本高成本和和有限的适用性有限的适用性使该法不可能实现大规模应用，使该法不可能实现大规模应
5、用，esp.G-的酶溶更受到了限制的酶溶更受到了限制5、超临界细胞破碎技术、超临界细胞破碎技术 超临界流体：超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有温度和压力处于临界条件之上的流体，具有类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具有较好的流动性能、传质性能和溶解性能有较好的流动性能、传质性能和溶解性能 利用超临界利用超临界CO2做介质，高压做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突易于渗透到细胞内。突然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生破裂生破裂 可可破碎细胞壁较厚的细胞
6、破碎细胞壁较厚的细胞如酵母如酵母 甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果破碎方法的选择破碎方法的选择4.2 Buffers What is buffer？Why use buffer？pH=pKa 0.5时，作为时，作为buffer，其缓冲能力最强，其缓冲能力最强补充补充1磷酸盐缓冲体系磷酸盐缓冲体系For most biochemical purposes,pKa2 is of greatest interestWhy？How to making a buffer？溶液：溶液：1/15 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4、pH7.5缓冲液缓冲液 含含
7、1 mmol/L EDTA 0.15 mol/L NaCl 2mol/L尿素尿素 3mmol/L GSH和和0.6mmol/L GSSG 1L方案方案1 1 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（1/15 mol/L，pH7.5）：）：600mL 1/15mol/L磷酸氢二钠（磷酸氢二钠（Na2HPO4）与）与400mL 1/15 mol/L磷酸二氢钠（磷酸二氢钠（NaH2PO4）混匀。）混匀。1L 1/15 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液缓冲液、pH7.5 buffer A另取一烧杯，分别称取另取一烧杯，分别称取1 mmol EDTA；0.15 mol NaCl；2mol 尿素；尿素
8、；3mmol GSH和和0.6mmol GSSG用用buffer A溶解溶解并定容至并定容至1L 方案方案1 1 Tris-HCl缓冲液（缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）：）：50mL 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与）溶液与29.2mL 0.1 mol/L盐酸混盐酸混匀后，用去离子水定容至匀后，用去离子水定容至100mL。“x”ml solution of A“y”ml solution of BWhy?The presence of extra salts may change the pH or molarity of the buffer
9、 due to common ion effectsInvolves extra work（making up two solutions）Waste（The unused volumes of A and B are discarded）Usually inaccurate缺点缺点方案方案2Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH）Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buffer由哪由哪种酸或碱构成？）种酸或碱构成？
10、）Choose the species that gives no-products when titrated（选择一种，使得（选择一种，使得其用其用HCl或或NaOH滴定时无副产物出现）滴定时无副产物出现）Calculate the mass required to give the required molarity计算并称量配制溶液所需的质量计算并称量配制溶液所需的质量Add all components,titrate to the pH and make up the volume（加入所有其它组分，用（加入所有其它组分，用HCl或或NaOH 调至所需调至所需pH并定容）并定容）p
11、H计工作原理及使用注意事项计工作原理及使用注意事项描述缓冲液的两个指标：描述缓冲液的两个指标：缓冲液的摩尔浓度缓冲液的摩尔浓度 缓冲液缓冲液pH小结小结 缓冲液的缓冲液的pKa值尽可能接近预期值尽可能接近预期pH（pH0.5）温度改变、溶液稀释及添加中性盐的情况下，缓冲液温度改变、溶液稀释及添加中性盐的情况下，缓冲液pH变化尽可能小变化尽可能小 缓冲物质不与实验中其他物质发生反应，不干扰实验的检缓冲物质不与实验中其他物质发生反应，不干扰实验的检测（测（eg.硼酸盐硼酸盐/糖蛋白，糖蛋白，280nm处有光吸收）处有光吸收）一般常用的一般常用的缓冲液缓冲液都有都有现成现成的的配方配方，可，可查阅相
12、关参考书查阅相关参考书利用特定的缓冲液计算软件或者网上缓冲液计算软件：利用特定的缓冲液计算软件或者网上缓冲液计算软件：http:/www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp4.3 Assays for activity and concentration Most proteins have some form of unique functional activity（具有一种活性）（具有一种活性）,which defines the specific protein.Before the protein can be isolat
13、ed,it is necessary to conceive of(确定确定)an activity and to devise（设计）（设计）an appropriate assay.补充补充2 The activity assay should be:specific,to define the protein of interest and distinguish it from all others quantitative,so that the success of the purification can be monitored economical in terms of t
14、ime and material.干扰素含量测定干扰素含量测定（MTT法生物学活性测定）法生物学活性测定）原理：原理：干扰素能刺激某些指示细胞干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株株、人喉癌细胞株Hep-2等等)产生抗病毒蛋白，从而使产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。材料：材料：VSV、Wish细胞、细胞、MTT、二甲亚砜、二甲亚砜(DMSO)、10FCS RPMI164
15、0、培养板、培养瓶、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、孵箱、超净台、酶标检测仪。酶标检测仪。活性定义：活性定义：以保护半数以保护半数(50)Wish细胞免受病毒细胞免受病毒VSV损害损害的最高干扰素稀释度为的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。个干扰素活性单位。尿激酶活性测定尿激酶活性测定 尿激酶尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，是专一性很强的蛋白水解酶，血纤蛋白溶酶原血纤蛋白溶酶原是唯是唯一的天然蛋白底物，在生物体内，它作用于精氨酸一的天然蛋白底物，在生物体内，它作用于精氨酸-缬氨缬氨酸键，使酸键，使纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。对对合成底物合成底物的活性与的活
16、性与胰蛋白酶胰蛋白酶和和纤溶酶纤溶酶近似，也具有近似，也具有酯酶酯酶的活力，可作用于的活力，可作用于N-乙酰甘氨酰乙酰甘氨酰-L-赖氨酸甲酯。赖氨酸甲酯。对对血纤维蛋白血纤维蛋白、血纤维蛋白原等都有溶解作用，从而达到、血纤维蛋白原等都有溶解作用，从而达到溶血栓、抗凝血作用，所以是一种十分有效的溶血剂。溶血栓、抗凝血作用，所以是一种十分有效的溶血剂。在临床上，尿激酶已广泛应用于治疗各种新血栓的形成或在临床上，尿激酶已广泛应用于治疗各种新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。血栓梗塞性疾病。尿激酶活性测定尿激酶活性测定 取琼脂糖取琼脂糖10mL，纤维蛋白原溶液，纤维蛋白原溶液5.0mL，在，在40-60oC
17、迅速迅速加入（牛纤维蛋白溶酶原溶液加入（牛纤维蛋白溶酶原溶液0.2ml）、凝血酶溶液）、凝血酶溶液0.5mL，立即混匀，倒入平皿（直径，立即混匀，倒入平皿（直径9cm），制成厚度约），制成厚度约0.2cm的纤维膜。的纤维膜。分别加入不同浓度的标准液及供试品液各分别加入不同浓度的标准液及供试品液各10mL于膜上，于膜上，盖上盖，于盖上盖，于37oC培养箱保温培养箱保温18h后取出，分别量出每个溶后取出，分别量出每个溶圈垂直的两直径。以溶圈直径（平均）为纵坐标，标准品圈垂直的两直径。以溶圈直径（平均）为纵坐标，标准品效价为横坐标，做标准曲线效价为横坐标，做标准曲线胰蛋白酶胰蛋白酶 活性测定胰蛋白酶
18、能催化蛋白质的水解，对于由胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸碱性氨基酸（精氨酸、赖（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键敏感性次序为：酯键 酰胺键酰胺键 肽键。肽键。可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作
19、为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸精氨酸-对硝基苯胺（简称对硝基苯胺（简称BAPA）和）和苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸精氨酸-萘酰胺（简称萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。）测定酰胺酶活力。用苯甲酰用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲精氨酸甲酯（简称酯（简称TAME）测定酯酶活力。）测定酯酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。Concentration assays A number of methods are available for m
20、easuring protein concentration Each being based on a specific property of proteins Each having certain advantages and disadvantages.1、Absorption of ultraviolet light The extinction coefficients(消光系数消光系数)of proteins differ UV-absorption is useful as a qualitative（定性）（定性）measure,for detecting the pres
21、ence of protein（检测蛋白质是否存在）（检测蛋白质是否存在）But is less useful for accurate quantitative measurements（准（准确定量测定）确定量测定）Except for pure proteins of known extinction coefficient.Because of its simplicity,UV absorption is the method favored for continuous(semi-quantitative)monitoring of the protein concentratio
22、n in the eluate from chromatography columns.One of the limitations of UV-absorbance UV-absorbing,non-protein,compounds（具有紫外吸收的（具有紫外吸收的非蛋白质物质）非蛋白质物质）may interfere with（干扰）（干扰）the measurement.An elegant method for eliminating the absorption due to nucleic acids,thus allowing a measurement of protein m
23、ust be taken Nucleic acids,which are ubiquitously（无所不在的）（无所不在的）present in biological material,absorb UV radiation strongly,with a profile overlapping that of protein,but with a maximum at 260 nm.2、The biuret assay In alkaline solution,proteins（with peptide bonds）reduce Cu2+to Cu+to give a blue colou
24、red complex.Because the reaction is with peptide bonds,there is little variation in the colour intensity given by different proteins（不同蛋白质的光吸收强度差别不大）（不同蛋白质的光吸收强度差别不大）.The biuret method can be used for the measurement of protein concentration A disadvantage of the biuret method：It is relatively insen
25、sitive(灵敏度低灵敏度低),so that large amounts of protein are required for the assay（每次蛋白质含量测（每次蛋白质含量测定时所需蛋白质量要很大）定时所需蛋白质量要很大）.Another limitation is that amino buffers,such as Tris,which are commonly used in the pH range 8-10,can interfere with the reaction.3、The Lowry assay May be considered as an extensio
26、n of the biuret assay.Initially,a Cu+-protein complex is formed,as in the biuret assay.Cu+（or protein 中中Phe、Tyr）then reduce the so-called Folin-Ciocalteureagent(福林福林-酚试剂酚试剂),to yield an intense blue colour.An advantage of the Lowry over the biuret assay：much more sensitive,and thus consumes much les
27、s of the protein sample.Disadvantage：more sensitive to interference对很多干扰对很多干扰试剂敏感试剂敏感,a consequence of the more complicated chemistry involved需要配置很多种复杂试剂需要配置很多种复杂试剂.4、The bicinchoninic acid(BCA)assay Bicinchoninic acid（二喹啉甲酸二喹啉甲酸）forms a 2:1 complex with Cu+formed in the biuret reaction resulting in
28、 a stable,highly coloured chromophore（高吸收（高吸收特性的生色团）特性的生色团）with an absorbance maximum at 562 nm.The BCA assay is more sensitive than the Lowry method and is also less subject to interference by a number of commonly encountered substances.Sensitive to interference by strong reducing agents（强还（强还原剂原剂W
29、hy？）？）,e.g.ascorbic acid（抗坏血酸）（抗坏血酸）.5、The Bradford assaythe dye-binding method Coomassie blue G-250,dissolved in acid solution（酸性溶（酸性溶液中）液中）,below pH 1,is a red-brown colour（红褐色）（红褐色）regains its characteristic blue colour when it becomes bound to a protein（与蛋白质形成复合物后）（与蛋白质形成复合物后）.The concentration
30、of protein can therefore be measured by the extent to which the blue colour,measured at 595 nm,is restored.Advantages:Simplicity,sensitivity and resistance to interference.5）The Bradford assaythe dye-binding method G-250 binds largely to basic and aromatic amino acids.Different proteins will differ
31、in their content of these amino acids and so,ideally,a standard curve should be elaborated for each specific protein.Disadvantage：the reagent tends to stick to glass and plasticware塑料器材塑料器材.For this reason,the use of disposable cuvettes一次性试管一次性试管 is recommended.Or the dye can be removed from surface
32、s by using SDS.蛋白质分析作业蛋白质分析作业 若想分析破胞后所得粗酶液（或发酵液离心后上清液）的若想分析破胞后所得粗酶液（或发酵液离心后上清液）的蛋白质含量，可采用哪些分析方法？蛋白质含量，可采用哪些分析方法？实验室在分离纯化基因重组实验室在分离纯化基因重组E.coli所表达的所表达的-干扰素干扰素含量时，含量时，当当分离的初级阶段分离的初级阶段，测定蛋白质浓度时建议采用哪种？，测定蛋白质浓度时建议采用哪种？当进行多步色谱法纯化之后，当进行多步色谱法纯化之后，电泳检验为单一条带电泳检验为单一条带，此时建，此时建议采用哪种蛋白质分析方法来确定含量？议采用哪种蛋白质分析方法来确定含量？蛋白质含量的诸多分析方法中，哪种适用于蛋白质含量的诸多分析方法中，哪种适用于混合蛋白质混合蛋白质含含量的测定？量的测定？各有何优缺点各有何优缺点？哪种适用于哪种适用于纯度较高的蛋白质纯度较高的蛋白质含量测定？含量测定？各有何优缺点各有何优缺点？
