1、第一章第一章 微生物菌种选育微生物菌种选育v菌种选育菌种选育：利用微生物的遗传变异的特性，：利用微生物的遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状。采用各种手段，改变菌种的遗传性状。自然选育自然选育：根据菌种自然变异的特点进行选：根据菌种自然变异的特点进行选育的过程。育的过程。人工选育人工选育：人为方式改变微生物菌株遗传物：人为方式改变微生物菌株遗传物质选育过程，包括诱变育种、杂交育种、原质选育过程，包括诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程育种等高新技术。生质体融合、基因工程育种等高新技术。第一节第一节 菌种的来源菌种的来源 一、工业发酵常见微生物种类一、工业发酵常见微生物种类v细
2、菌细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌乳酸杆菌枯草杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌最常用的工业微生物最常用的工业微生物v酵母菌酵母菌酿酒酵母酿酒酵母假丝酵母属假丝酵母属v产朊假丝酵母产朊假丝酵母v解脂假丝酵母解脂假丝酵母v热带假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属毕赤酵母属、汉逊酵母属最常用的工业微生物最常用的工业微生物v霉菌霉菌曲霉属曲霉属v米曲霉米曲霉v黑曲霉黑曲霉青霉属青霉属v青霉菌：点青霉、产黄青霉青霉菌：点青霉、产黄青霉v桔青霉桔青霉根霉属根霉属v德氏根霉德氏根霉v米根霉、小麦曲根霉米根霉
3、、小麦曲根霉红曲霉属红曲霉属v紫红曲霉紫红曲霉最常用的工业微生物最常用的工业微生物v放线菌放线菌链霉菌属链霉菌属小单孢菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌米苏里游动放线菌v担子菌担子菌菇类菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。v藻类藻类自养微生物自养微生物人类的保健食品和饲料。人类的保健食品和饲料。v担子菌担子菌菇类菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。v藻类藻类自养微生物自养微生物人类的保健食品和饲料。人类的保健食品和饲料。v担子菌担子菌菇类菇类多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。v
4、藻类藻类自养微生物自养微生物人类的保健食品和饲料。人类的保健食品和饲料。二、工业微生物的来源二、工业微生物的来源v根据资料直接向有关科研单位、高等院校、根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；工厂或菌种保藏部门索取或购买；v从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。v从一些发酵制品中分离目的菌，如从酱油中从一些发酵制品中分离目的菌，如从酱油中分离蛋白酶产生菌；从酒醪中分离淀粉酶或分离蛋白酶产生菌；从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌。糖化酶产生菌。三、微生物菌种的选择性分离三、微生物菌种的选择性分离v菌株分离就是将一个混杂着各种微生物的样菌株分
5、离就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，进而得到所需微生品通过分离技术区分开，进而得到所需微生物的过程。物的过程。v工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需菌株；二是把分离的一是从自然界分离所需菌株；二是把分离的菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。v菌株的分离和筛选：采样、富集、目的菌筛菌株的分离和筛选：采样、富集、目的菌筛选等。选等。1.采样采样v以采集土壤为主以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化泽土中，以细菌和放线菌为主；
6、富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。如一些野果生长区和果园内。v纤维素酶产生菌纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的选择枯枝落叶富含纤维素的森林土；森林土；v淀粉酶产生菌淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的土壤；场所的土壤；v蛋白酶和脂肪酶产生菌蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附可选择肉类加工厂附近污泥等。近污泥等。从自然界筛选从自然界筛选v采样季节采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初：以温度适中，雨量不多的秋初为好。为好。v采土方式采土方式：在选好适当地点后，用小萨子：在选好适当
7、地点后，用小萨子除去表土，取离地面除去表土，取离地面5-15cm处的土约处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。以便及时分离。2.富集培养富集培养v富集培养可增加待分离菌的数量，增加分离的成功富集培养可增加待分离菌的数量，增加分离的成功率。率。v为了容易分离到所需的菌种，可以通过配制选择性为了容易分离到所需的菌种，可
8、以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。培养基，选择一定的培养条件来控制。v例如碳源利用的控制，可选定糖、淀粉、纤维素，例如碳源利用的控制，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。离就会顺利得多。v为提高分离的效率为提高分离的效率,常以常以投其所好和取其所投其所好和取其所抗的抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌原则在培养基
9、中添加特殊的养分或抗菌物质物质,使所需菌种的数量相对增加使所需菌种的数量相对增加,这种方这种方法称为法称为增殖培养或富集培养增殖培养或富集培养,其实质是使天其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌菌,便于将它们从样品中分离便于将它们从样品中分离。v例如分离放线菌时，在土壤样品悬液中加入例如分离放线菌时，在土壤样品悬液中加入数滴数滴1010的酚，可抑制霉菌和细菌的生长。的酚，可抑制霉菌和细菌的生长。富集的主要方案：富集的主要方案：q 定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。控制营养和
10、培养条件增加目的微生物数量，进行培养。控制营养和培养条件增加目的微生物数量，也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量。也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量。目的微生物富集的一些基本方法目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：富集的目的：q 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。定向培养的富集方法定向培养的富集方法 1.1.底物底物 2.pH2.pH条件条件 3.3.培养时间培养时间 4.4.培养温度培养温度 等一切能提高目的微生物相对生长速等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批、度的手段，培养（固体
11、、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优连续）后使目的微生物在种群中占优势。势。菌落的选出菌落的选出 q 从产物角度出发从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 q 从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌
12、的筛选采样（造纸采样（造纸 厂）厂）80、30min处理处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5、培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型 3.培养分离培养分离v尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化，混杂生长状态。因此还必须分离，纯化，在固体培在固体
13、培养基平板上获得单菌落养基平板上获得单菌落。v纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。v分离的效率取决于培养基养分、分离的效率取决于培养基养分、pH、温度和、温度和加入的选择性抑制剂。加入的选择性抑制剂。v嗜中性放线菌分离培养基嗜中性放线菌分离培养基pH常在常在6.77.5，嗜酸性放线菌嗜酸性放线菌pH降至降至4.55.0。v放线菌筛选时，可加入真菌抗生素，对放线放线菌筛选时，可加入真菌抗生素，对放线菌无作用。菌无作用。v分离放线菌分离平板通常在分离放线菌分离平板通常在2530培养。培养。嗜热菌嗜热菌4555 ，嗜冷菌，嗜冷菌410 。4.筛筛 选选v平
14、板上单菌落，通过菌落形态观察，进行菌落鉴定，平板上单菌落，通过菌落形态观察，进行菌落鉴定，符合要求，转移到试管斜面进行纯培养。符合要求，转移到试管斜面进行纯培养。v采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。用菌种。5.毒性试验毒性试验v自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。的菌种，更应慎重。v据有的国
15、家规定，微生物中除据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。毒性试验。第二节第二节 菌种的选育菌种的选育一、菌种选育意义：发酵产品的种类、产量和质量有较大的一、菌种选育意义：发酵产品的种类、产量和质量有较大的改善改善二、二、菌种选育的定义：菌种选育的定义：根据微生物遗传物质极易发生变异特性，用人工方法根据微生物遗传物质极易发生变异特性，用人工方法造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过
16、程。造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。三、三、常用菌种的选育方法：常用菌种的选育方法：1 1）自然选育；）自然选育；2 2）诱变育种；）诱变育种；3 3）杂交育种；）杂交育种；4 4）分子育种）分子育种四、自然选育四、自然选育1.1.自然选育自然选育 在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。2.2.自然突变的两种可能自然突变的两种可能 菌种衰退，生产能力下降；菌种衰退，生产能力下降；代谢更加旺盛，生产性能提高。代谢更加旺盛，生产性能提高。3.3.自然选
17、育的方法自然选育的方法单菌落纯种分离单菌落纯种分离五、诱变育种（五、诱变育种（Mutation breeding）1.1.诱变育种的含义诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，应用微生物遗传和变异理论，用物理或用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,促进其突变率大幅度提高促进其突变率大幅度提高,然后采用简便、然后采用简便、快速和高效的筛选方法快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合从中挑选少数符合育种目的的突变株育种目的的突变株,以供生产实践或科学研以供生产实践或科学研究用。究用。v诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等诱变育种具有方法简单、快速和收效
18、显著等特点特点，仍是目前被广泛使用的主要育种仍是目前被广泛使用的主要育种手段。手段。v当前发酵工业中使用的高产菌株当前发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外诱变育种除能提高产量外,还可达到改善产还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。2.2.诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤1）出发菌株的选择2）单细胞（或单孢子）悬液制备3）诱变剂和使用剂量的选择4）变异株的初筛5）变异株的复筛6）变异株稳定性试验7）菌种特性考察8）中试验证9）大型投产试验
19、1 1）出发菌株的选择）出发菌株的选择 用来育种处理的起始菌株称为用来育种处理的起始菌株称为出发菌株出发菌株。出发菌株的来源主要有以下三方面出发菌株的来源主要有以下三方面：自然界直接分离到的野生型菌株自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整这些菌株的特点是它们的酶系统完整,染色体染色体或或DNADNA未损伤未损伤，但它们的生产性能通常很差但它们的生产性能通常很差(这正是这正是它们能在大自然中生存的原因它们能在大自然中生存的原因),),通过诱变育种通过诱变育种,它们它们正突变正突变(即产量或质量性状向好的方向改变即产量或质量性状向好的方向改变)的的可能性大可能性大。经历过生
20、产条件考验的菌株经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状这些菌株已有一定的生产性状,对生产环境有对生产环境有较好的适应性较好的适应性,正突变的可能性也很大。正突变的可能性也很大。经历多次育种处理的菌株经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤这些菌株的染色体已有较大的损伤,某些生理某些生理功能或酶系统有缺损功能或酶系统有缺损,产量性状已经达到了一定水产量性状已经达到了一定水平平，它们它们负突变负突变(即产量或质量性状向差的方向改即产量或质量性状向差的方向改变变)的可能性很大的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用可以正突变的位点已经被利用了了，继续诱变处理很可能导致产量
21、下降甚至死亡。继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。因此，在实际生产中，因此，在实际生产中，一般可选择一般可选择或或类菌类菌株株,尤以尤以第第类类最最佳佳,因为它可以向好的方向发展。因为它可以向好的方向发展。在抗生素生产菌育种中在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次最好选择已通过几次诱变并诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株株，在选择产核在选择产核苷苷酸或氨基酸的出发菌株时酸或氨基酸的出发菌株时，最好最好考虑至少能积累少量产品或其前体的菌株。考虑至少能积累少量产品或其前体的菌株。2 2）单细胞（或单孢子）悬液制备）单细胞（或单孢子）悬液制备
22、诱变诱变处理的菌处理的菌株株应考虑微生物的应考虑微生物的生理状态生理状态、菌菌株株的均一性的均一性和和环境条件环境条件。适合用于诱变育种的适合用于诱变育种的微生物生理状态微生物生理状态：一一般要求般要求细菌和酵母细菌和酵母菌体菌体处于对数生长期处于对数生长期,并并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。采取一定的措施促使细胞处于同步生长。对产对产孢孢子或芽子或芽孢孢的的微微生物最好采用其生物最好采用其孢孢子或芽子或芽孢，因此，孢，因此，霉菌和放线菌应处于单细胞状态，即霉菌和放线菌应处于单细胞状态，即形成孢子的时期，对孢子进行诱变形成孢子的时期，对孢子进行诱变。为什么霉菌和放线菌为什么霉菌和放线菌用
23、用孢孢子进行诱变处理子进行诱变处理？1.1.能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂；2.2.它尽可能地避免出现表型延迟现象它尽可能地避免出现表型延迟现象 表型延迟表型延迟(Phenotypic lag)是指某一突变在是指某一突变在 DNADNA复制和细胞分裂后复制和细胞分裂后,才在细胞表型上显示才在细胞表型上显示出来出来,造成不纯的菌落造成不纯的菌落的现象的现象。出现这种现象出现这种现象的原因是诱变对象处于的原因是诱变对象处于多核时期造成的多核时期造成的。霉菌和放线菌霉菌和放线菌对数期细胞往往是多核的,很可能一个核发生突变,而另一个核未突变,若突变性状是隐性的,在当代
24、并不表现出来,在筛选时就会被淘汰;若突变性状是显性的,那么,在当代就表现出来,但在进一步传代后,就会出现分离现象,造成生产性状衰退,因此，应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。即使如此,有时也会出现表型延迟现象,这是因为诱变剂往往只作用于DNA分子的一条单链，DNA 进一步复制后,同样会出现不纯的菌落。这类表型延迟称为分离性延迟现象。菌株菌株的均一性的均一性 菌菌悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞 机会均等并充分地接触机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌避免细胞团中变异菌 株与非变异菌株混杂株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落出现不纯的菌落，给后给后
25、续的筛选工作续的筛选工作造造成成困困难。难。为避免细胞团出现为避免细胞团出现,可用玻璃珠振荡打散可用玻璃珠振荡打散 细胞团细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤再用脱脂棉花或滤纸过滤,得到分散得到分散 的菌体。的菌体。菌悬液的细胞浓度一般控制为菌悬液的细胞浓度一般控制为:真菌真菌孢孢子或酵母细胞子或酵母细胞 10106 610107 7 个个/ml/ml；放线菌或细菌放线菌或细菌 10108 8个个/ml/ml。菌悬液一般用生理盐水菌悬液一般用生理盐水(0.85%(0.85%NaCl NaCl)稀释。稀释。有时有时用用化学诱变剂处理时化学诱变剂处理时，需需要要0.1mol/L 0.1mol/L 磷酸缓
26、冲液稀释磷酸缓冲液稀释,因为有些化学诱变剂处理时因为有些化学诱变剂处理时,常常常常会改变反应液的会改变反应液的pHpH值。值。3 3）菌种诱变剂和使用剂量的选择）菌种诱变剂和使用剂量的选择 诱变剂的含义诱变剂的含义：凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称为诱变因素或诱变剂。统称为诱变因素或诱变剂。分类分类：物理诱变物理诱变，如紫外线、，如紫外线、-射线、射线、X-X-射线、射线、快中子、激光、等离子体、高压等快中子、激光、等离子体、高压等 化学诱变化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝酸、碱基类、吖啶类物质等酸、碱基类、吖
27、啶类物质等 诱变剂量的选择诱变剂量的选择：一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，因此，通常诱变剂量采用致死率因此，通常诱变剂量采用致死率90%90%99%99%的剂量，的剂量，但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低得多（致死率在得多（致死率在90%90%99%99%）。）。诱变处理的方法诱变处理的方法：单一处理单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这种处理方法通常较单一处理的
28、效果好。种处理方法通常较单一处理的效果好。诱变剂复合处理及协同效应诱变剂复合处理及协同效应 单独处理单独处理 复合处理复合处理菌种菌种 诱变剂诱变剂 突变率突变率 诱变剂诱变剂 突变率突变率土曲霉土曲霉 紫外线紫外线 21.7 21.7 紫外线紫外线 +X+X射线射线 42.842.8 X X射线射线 19.719.7黑曲霉黑曲霉 氮芥氮芥0.10.1 不明显不明显 氮芥氮芥 +紫外线紫外线 11.011.0 紫外线紫外线 4.74.7链霉菌链霉菌 二乙烯三胺二乙烯三胺 6.06 6.06 二乙烯三胺二乙烯三胺 +紫外线紫外线 26.626.6 硫酸二乙酯硫酸二乙酯 1.78 1.78 硫酸二
29、乙酯硫酸二乙酯 +紫外线紫外线 35.8635.86 紫外线紫外线 12.512.5某些化学诱变剂常用浓度及处理时间某些化学诱变剂常用浓度及处理时间诱变剂诱变剂 浓度浓度 处理时间处理时间(min)(min)中止方法中止方法二乙酯二乙酯 0.10.11%181%1824 24 硫代硫酸钠或稀释硫代硫酸钠或稀释亚硝基胍亚硝基胍 0.10.13 3/ml 60/ml 60120 120 大量稀释大量稀释4 4）突变株的筛选突变株的筛选 菌体细胞经诱变剂处理后菌体细胞经诱变剂处理后,要从大量的变异菌要从大量的变异菌株中株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来把一些具有优良性状的突变株挑选出来,这这需
30、要有明确的筛选目标和筛选方法需要有明确的筛选目标和筛选方法,需要进行认真需要进行认真细致的筛选工作。细致的筛选工作。育种工作中常采用育种工作中常采用随机筛选随机筛选和和理性化筛选理性化筛选这两这两种筛选方法。种筛选方法。随机筛选随机筛选：菌种经诱变处理后菌种经诱变处理后，进行平板分离进行平板分离，随机挑选单随机挑选单菌落菌落，在，在随机挑选单菌落中筛选随机挑选单菌落中筛选出出高产菌株。高产菌株。该方该方法工作量极大。法工作量极大。为了提高筛选效率为了提高筛选效率,可采用下列方可采用下列方法增大筛选量。法增大筛选量。（1 1）摇瓶筛选法摇瓶筛选法；（2 2）琼脂块筛选法；）琼脂块筛选法；（3 3
31、）筛选自动化；）筛选自动化；（4 4）筛选工具微型化）筛选工具微型化。（1 1）摇瓶筛选法摇瓶筛选法 这是生产上一直使用的传统方法。这是生产上一直使用的传统方法。将挑出的单菌落传种将挑出的单菌落传种到到斜面后斜面后,由斜面接由斜面接入入模拟模拟发酵工艺的摇瓶中培养发酵工艺的摇瓶中培养,然后测定其发酵然后测定其发酵生生产能力。产能力。选育高产菌株的目的是要在生产发酵罐中推广应选育高产菌株的目的是要在生产发酵罐中推广应用用，因此摇瓶的培养条件要尽可能和发酵生产的培养因此摇瓶的培养条件要尽可能和发酵生产的培养条件相近。条件相近。摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件相接摇瓶筛选的优点是培养条件与生产
32、培养条件相接近近 ,但工作量大、时间长、操作复但工作量大、时间长、操作复杂。杂。（2 2）琼脂块筛选法）琼脂块筛选法 这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同其生长培养基其生长培养基(琼脂块琼脂块)用打孔器取出用打孔器取出,培养一段时间培养一段时间后后,置于鉴定平板以测定其发酵产量。置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快，但是琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快，但是固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛加以验证。此法所取得的初筛结果必
33、须经摇瓶复筛加以验证。（3 3）筛选自动化和筛选工具微型化）筛选自动化和筛选工具微型化 近年来,在研究筛选自动化方面有很大进展,筛选实验实现了自动化和半自动化,省去了繁琐的劳动,大大提高了筛选效率。特别是筛选工具的微型化很有意义。例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。随机筛选的方法的局限性随机筛选的方法的局限性 传统的菌种选育采用随机筛选的方法。传统的菌种选育采用随机筛选的方法。由于正变株出现的几率小由于正变株出现的几率小,产量提高的范围往往在生物产量提高的范围往往在生物学波动的范围内学波动的范围内,因而选出一株高产菌株需要耗费大量的人因而选出
34、一株高产菌株需要耗费大量的人力、物力。而且力、物力。而且,随着发酵产量不断提高随着发酵产量不断提高,用随机筛选方法用随机筛选方法获得高产菌株的几率越来越小。获得高产菌株的几率越来越小。近年来近年来,随着遗传学、生物化学知识的积累随着遗传学、生物化学知识的积累,人们对于人们对于代谢途径、代谢调控机制了解得更多了解代谢途径、代谢调控机制了解得更多了解,因而筛选方法逐因而筛选方法逐渐从随机筛选方法转向渐从随机筛选方法转向理性化筛选理性化筛选方法。方法。理性化筛选理性化筛选 理性化筛选理性化筛选是指运用遗传学、生物化学的原理是指运用遗传学、生物化学的原理,根据产根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢
35、调控机制和产物分子物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法结构来进行设计和采用一些筛选方法,以打破微生物原有的以打破微生物原有的代谢调控机制代谢调控机制,获得能大量形成产物的高产突变株的筛选方获得能大量形成产物的高产突变株的筛选方法。法。根据微生物的代谢产物不同，理性化筛选的方法也有所根据微生物的代谢产物不同，理性化筛选的方法也有所不同，它包括：不同，它包括：（1 1）初级代谢产物高产菌株的筛选）初级代谢产物高产菌株的筛选 （2 2）次级代谢产物高产菌株的筛选）次级代谢产物高产菌株的筛选（1 1）初级代谢产物高产菌株的筛选）初级代谢产物高产菌株的筛选
36、 根据代谢调控的机理根据代谢调控的机理,氨基酸、核苷酸、有机酸、氨基酸、核苷酸、有机酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在着反馈阻遏或反馈抑制。着反馈阻遏或反馈抑制。育种工作的目的就是要打破微生物原有的这种反育种工作的目的就是要打破微生物原有的这种反馈调节系统。馈调节系统。可从以下两个方面着手可达到目的可从以下两个方面着手可达到目的：降低终产物浓度降低终产物浓度；筛选抗反馈突变株筛选抗反馈突变株。（2 2）次级代谢产物高产菌株的筛选）次级代谢产物高产菌株的筛选 次级代谢产物次级代谢产物是微生物为了避免在次级代谢过是微生物为了避免在次级代
37、谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢产物。一类有利于生存的代谢产物。因此，可筛选某些因此，可筛选某些营养缺陷型营养缺陷型或初级代谢产物或初级代谢产物结构类似物抗性突变株结构类似物抗性突变株以消除初级代谢产物对那些以消除初级代谢产物对那些初级代谢和次级代谢所需的共同中间产物的反馈调初级代谢和次级代谢所需的共同中间产物的反馈调节，使其大量积累，有利于次级代谢产物的合成。节，使其大量积累，有利于次级代谢产物的合成。v营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株：由于发生了丧失某种酶：由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，末端产物不能积累，
38、因此合成能力的突变，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节被解除。只要在培养基末端产物的反馈调节被解除。只要在培养基中限量加入所要求末端产物，克服生长障碍，中限量加入所要求末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。就能使中间产物积累。v结构类似物抗性突变株结构类似物抗性突变株：对末端代谢物及其：对末端代谢物及其结构类似物的反馈抑制不明显，或对其反馈结构类似物的反馈抑制不明显，或对其反馈阻遏有抗性，或两者兼而有之的菌株。这种阻遏有抗性，或两者兼而有之的菌株。这种菌株由于末端代谢物反馈调节的功能丧失，菌株由于末端代谢物反馈调节的功能丧失，故而能大量积累末端代谢产物。故而能大量积累末端代谢产物。
39、从以下几方面着手可达到目的：从以下几方面着手可达到目的：筛选营养缺陷型突变株筛选营养缺陷型突变株筛选负变株的回复突变株筛选负变株的回复突变株筛选去磷酸盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身所产抗生素抗性突变株筛选自身所产抗生素抗性突变株3.3.诱变育种的基本步骤和原则诱变育种的基本步骤和原则诱变处理诱变处理出发菌株出发菌株菌株性能考察菌株性能考察摇瓶筛选摇瓶
40、筛选中间试验中间试验工业性试验工业性试验重复数轮重复数轮 基本步骤基本步骤诱变育种的基本步骤总结：诱变育种的基本步骤总结：1 1）选择出发菌）选择出发菌：分离纯化获得活化菌株分离纯化获得活化菌株1-21-2株（先平板分离，株（先平板分离，然后斜面培养：一般细菌培养然后斜面培养：一般细菌培养1 12 2天，真菌形天，真菌形成大量的孢子）成大量的孢子）2 2）第一轮）第一轮诱变处理和突变株的筛选诱变处理和突变株的筛选细胞或孢子悬液进行活菌计数；细胞或孢子悬液进行活菌计数；进行单一或复合处理诱变剂处理；进行单一或复合处理诱变剂处理；对处理后的菌悬液进行平板分离，活菌计数确定诱对处理后的菌悬液进行平板
41、分离，活菌计数确定诱变处理致死剂量；挑选单菌株接种到斜面（变处理致死剂量；挑选单菌株接种到斜面（200200株）。株）。摇瓶初筛，以出发菌株为对照，选出正突变株摇瓶初筛，以出发菌株为对照，选出正突变株5050株）株）摇瓶复筛（最终确定稳定的突变株摇瓶复筛（最终确定稳定的突变株5 5株，作为第二轮株，作为第二轮诱变育种的出发菌株）诱变育种的出发菌株）第二轮诱变（第一轮的五株菌株）：第二轮诱变（第一轮的五株菌株）：方法和步骤与第一轮相同，将初筛出的方法和步骤与第一轮相同，将初筛出的5 5株株菌株全部进行诱变处理。菌株全部进行诱变处理。每一菌株第二轮诱变后，平板分离，挑取每一菌株第二轮诱变后，平板分
42、离，挑取4040个单菌落，共挑取菌落个单菌落，共挑取菌落40405 5个；个；摇瓶初筛选出摇瓶初筛选出5050株；株；摇瓶复筛选出摇瓶复筛选出5 5株；株；若产率不高，还必须进行第三轮诱变育种。若产率不高，还必须进行第三轮诱变育种。3)3)菌种特性考察菌种特性考察菌株稳定性试验菌株稳定性试验:传代传代1010代以上。考察变异株产代以上。考察变异株产率是否发生较大的变化。率是否发生较大的变化。菌种其他特性考察菌种其他特性考察4 4）中试验证）中试验证 5 5）大型投产试验）大型投产试验 经过上述实验，获得的高产菌株，方才可用于经过上述实验，获得的高产菌株，方才可用于工业上大规模生产。工业上大规模
43、生产。菌种育种举例菌种育种举例 从土壤中分离、诱变及随机筛选柠檬酸高产从土壤中分离、诱变及随机筛选柠檬酸高产菌种选育过程。菌种选育过程。一、从土壤中筛选产柠檬酸的黑曲霉菌株一、从土壤中筛选产柠檬酸的黑曲霉菌株1.1.确定筛选产柠檬酸的菌种种类，采集样品：确定筛选产柠檬酸的菌种种类，采集样品：取霉腐土层，筛选黑曲霉菌株。取霉腐土层，筛选黑曲霉菌株。2.2.选择合适的培养和纯种分离的方法：选择合适的培养和纯种分离的方法：固体稀释平皿倾注法分离土壤中的黑曲霉，在固体稀释平皿倾注法分离土壤中的黑曲霉，在平板培养基中添加碳酸钙，待培养长出菌落后，平板培养基中添加碳酸钙，待培养长出菌落后，挑取透明圈大的菌
44、落于斜面。挑取透明圈大的菌落于斜面。3.3.挑选产酸的单菌落斜面菌种，进行生产性能的挑选产酸的单菌落斜面菌种，进行生产性能的测定：即确定所筛选的黑曲霉菌株产的是测定：即确定所筛选的黑曲霉菌株产的是柠檬柠檬酸。酸。二、菌种的诱变育种二、菌种的诱变育种1.1.将黑曲霉接种于斜面活化；将黑曲霉接种于斜面活化；2.2.制备出发菌孢子悬液并进行活菌计数；制备出发菌孢子悬液并进行活菌计数；3.3.诱变剂处理：诱变剂处理：可可先单一，后复合处理：先单一，后复合处理：1 1）物理因子）物理因子：紫外线诱变和：紫外线诱变和射线诱变射线诱变处理；处理；2 2）化学因子：硫酸二乙酯、亚硝基胍）化学因子：硫酸二乙酯、
45、亚硝基胍处理；处理；3.3.用加用加碳酸钙的平板分离诱变处理后的孢子，待碳酸钙的平板分离诱变处理后的孢子，待菌落长出后，挑取平板上透明圈较大的单菌落菌落长出后，挑取平板上透明圈较大的单菌落200200个于斜面培养基，个于斜面培养基，30300 0C C培养长出孢子后，进培养长出孢子后，进行摇瓶初筛。行摇瓶初筛。4.4.摇瓶初筛：摇瓶初筛：5.5.摇瓶复筛：摇瓶复筛：若产率不高，还必须进行第二轮诱变育种。若产率不高，还必须进行第二轮诱变育种。三、变异株稳定性试验：三、变异株稳定性试验：转接转接1010代，考察传代后，各代菌株柠檬代，考察传代后，各代菌株柠檬酸生产率是否有较大的变化；酸生产率是否有
46、较大的变化；四、菌种特性考察，菌落特征、菌丝形态及产四、菌种特性考察，菌落特征、菌丝形态及产生孢子的情况进行考察；生孢子的情况进行考察；五、中试验证菌种是否适合工业化生产；五、中试验证菌种是否适合工业化生产；六、大型投产试验，进行工业化生产六、大型投产试验，进行工业化生产。六、杂交育种（六、杂交育种（Hybridization breedingHybridization breeding）1.杂交育种杂交育种 指两个不同基因型的生物通过结合或原生质体融合，指两个不同基因型的生物通过结合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选到具有新形状使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选到具有新形
47、状的菌株。的菌株。人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、微生物的接合、F F因子转导、转导和转化等过程因子转导、转导和转化等过程,使两使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组个具不同遗传性状的菌株发生基因重组,以获得性能优以获得性能优良的生产菌株。这也是一类重要的微生物育种手段良的生产菌株。这也是一类重要的微生物育种手段,比比起诱变育种起诱变育种,它具有更强的方向性和目的性。它具有更强的方向性和目的性。细菌杂交育种细菌杂交育种 在细菌中实现杂交的种类主要是大肠杆菌，鼠伤寒沙门在细菌中实现杂交的种类主要是大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌、铜绿
48、假单胞菌、淋病奈氏球菌等。氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。大肠杆菌中存着致育因子大肠杆菌中存着致育因子F F，有，有F F因子为因子为F+F+，没有，没有F F因子因子称称F-F-。F F因子存在于细胞中形式：游离状态因子存在于细胞中形式：游离状态(F+(F+细胞细胞)；整合状；整合状态，即态，即F F因子插入胞核质的一定位置上因子插入胞核质的一定位置上(Hfr(Hfr细胞细胞)。F F因子有明显感染性，大肠杆菌的接合，实质上是因子有明显感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F F因子因子的转移，所以的转移，所以F+F+和和HfrHfr称供体菌，而称供体菌，而F-F-称受体菌。称受体菌。酵母杂交
49、酵母杂交 运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。果。2.2.原生质体融合育种原生质体融合育种 用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶
50、，酵母和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用牛酶和纤维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合原生质体融合。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是原生质体融合作为一种新的基因重组手段是19781978年第三年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。原生质体融合育种的特点原生质体融合育种的特点 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件
