1、第三章环境生物工程第三章环境生物工程-基因工程基因工程一、概述一、概述二、基因二、基因三、酶三、酶四、载体四、载体五、基因重组五、基因重组1 1、要点要点基因工程的分子生物学基础、基因工程工具酶、基因基因工程的分子生物学基础、基因工程工具酶、基因工程载体、目的基因的获得、目的基因导入受体细胞、重工程载体、目的基因的获得、目的基因导入受体细胞、重组体的筛选、组体的筛选、DNADNA序列分析、基因工程在环境污染治理中序列分析、基因工程在环境污染治理中的应用的应用2 2、重点、重点基因工程的分子生物学、目的基因的获得、基因工程基因工程的分子生物学、目的基因的获得、基因工程工具酶、基因工程载体、目的基
2、因导入受体细胞、重组体工具酶、基因工程载体、目的基因导入受体细胞、重组体的筛选的筛选教学要点、重点教学要点、重点一、概述一、概述（一）基因组的相关名词（一）基因组的相关名词 1 1、DNADNA：遗传物质脱氧核糖核酸的简称。每个遗传物质脱氧核糖核酸的简称。每个DNADNA分子分子都包含螺旋结构的双股链。都包含螺旋结构的双股链。2 2、基因：、基因：DNADNA上有遗传意义的片段叫基因，基因包含一上有遗传意义的片段叫基因，基因包含一定数量的碱基。基因是基础的遗传单位。定数量的碱基。基因是基础的遗传单位。一、概述一、概述 3 3、测序：确定、测序：确定DNADNA双股链上每个独立结构单元或碱基的双
3、股链上每个独立结构单元或碱基的确切顺序的过程。测序经常被称为确切顺序的过程。测序经常被称为“破译破译”，因为其结果，因为其结果就像解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行就像解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行4 4种字种字母的序列，这些字母表示母的序列，这些字母表示4 4种不同的碱基，它们是腺嘌呤、种不同的碱基，它们是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，分别用它们的首字母鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，分别用它们的首字母A A、T T、C C、G G表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生命指令。命指令。4 4、芯片，又称基因芯片（），、芯片，
4、又称基因芯片（），实质上是一种高密度的寡聚核苷酸（探针）阵列。实质上是一种高密度的寡聚核苷酸（探针）阵列。它采用在位组合合成化学和微电子芯片的光刻技术，或者它采用在位组合合成化学和微电子芯片的光刻技术，或者利用其他方法将大量特定系列的片段（探针）有序利用其他方法将大量特定系列的片段（探针）有序地固化在玻璃或磋衬底上，从而构成储存有大量生命信息地固化在玻璃或磋衬底上，从而构成储存有大量生命信息的芯片。的芯片。5 5、所谓转基因技术就是把外源基因整合到宿主基因组、所谓转基因技术就是把外源基因整合到宿主基因组中去。中去。一、概述一、概述 6 6、基因突变：是指由于、基因突变：是指由于DNADNA碱基
5、对的置换、增添或缺失碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，亦称点突变。而引起的基因结构的变化，亦称点突变。7 7、克隆是英文、克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。的无性繁殖方式。8、基因表达基因表达(gene expression)(gene expression)：是基因的转录、转译：是基因的转录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到蛋白质的传递和实现。过程，也就是遗传信息从核酸到蛋白质的传递和实现。一、概述一、概述 （二）基因工程（二）基因工程1 1、定义：将外源基因体外重组后导入受体细胞内，、定义：将外源基因体外重组后导入
6、受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。2 2、理论和技术支撑、理论和技术支撑（1 1）理论：）理论：4040年代发现了生物的年代发现了生物的遗传物质是遗传物质是DNADNA、5050年代弄清了年代弄清了DNADNA的双螺旋结构的双螺旋结构、6060年代确定了年代确定了遗传信息的遗传信息的传递方式。传递方式。一、概述一、概述 （2 2）技术：工具酶、载体、逆转录酶）技术：工具酶、载体、逆转录酶2 2、基因工程实施至少四个必要条件：工具酶、基因、基因工程实施至少四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞载体、受体细胞3
7、3、基因工程的内容、基因工程的内容4 4、遗传工程、基因工程、遗传工程、基因工程、DNADNA重组技术的区别重组技术的区别5 5、基因工程操作的基本技术、基因工程操作的基本技术一、概述一、概述二、基因二、基因 （一）结构与功能（一）结构与功能（二）（二）DNADNA的变性、复性与杂交的变性、复性与杂交（三）中心法则（三）中心法则二、基因二、基因二、基因二、基因NucleotideNucleotideDNA的双螺旋结构二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因二、基因RNA Ribonucleic AcidmRNA依照依照 DNA D
8、NA 上面的核甘酸序列，可上面的核甘酸序列，可翻译翻译成蛋白成蛋白质质的的氨氨基酸序列，基酸序列，这这是如何做到的？是如何做到的？(1)(1)DNA DNA 的序列可以的序列可以 A=U A=U 及及 C=G C=G 的互的互补关系补关系，转转成成 messenger RNAmessenger RNA。(2)mRNA (2)mRNA 与核糖体结合与核糖体结合，准备开始进行转译蛋白质准备开始进行转译蛋白质。(3)(3)mRNA mRNA 序列以三序列以三个为一组个为一组，称为称为“遗传密码遗传密码”，每组密码每组密码可对应一种氨基酸可对应一种氨基酸。(4)(4)由由 RNA RNA 译成胺基酸序
9、列时，译成胺基酸序列时，需要有需要有“翻译者翻译者”，此此翻译翻译者即为者即为 tRNAtRNA。(5)(5)每个每个 tRNAtRNA可说是一种介面，可说是一种介面，一一边认得特定的边认得特定的 RNARNA密码，密码，一一边携带对应的氨基酸边携带对应的氨基酸。(6)(6)当当 tRNAtRNA 一边认出其特定密码，一边可把所携带的氨基酸一边认出其特定密码，一边可把所携带的氨基酸接上连接上连成蛋白成蛋白质质。三、酶三、酶 （一）限制性内切酶（一）限制性内切酶（二）修饰酶（二）修饰酶（三）连接酶（三）连接酶EcoRGAATTCCTTAAG5533553355G GCTTAACTTAAAATTC
10、AATTCG G333355粘性末端粘性末端SmaCCCGGGGGGCCC5533335555CCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCC333355平头末端平头末端（一）限制性内切酶（一）限制性内切酶史密斯（1931-）内森斯（1928-）相同内切酶切出的两相同内切酶切出的两段粘性末端段粘性末端DNA的互的互补配对补配对同尾酶切出的两段粘同尾酶切出的两段粘性末端性末端DNA的互补的互补配对配对两段平末端两段平末端DNA的互的互补配对补配对四、载体四、载体 （一）定义、分类、要求（一）定义、分类、要求（二）载体因宿主而不同（二）载体因宿主而不同1 1、原核、原核2 2、真核、真核3 3、植
11、物、植物4 4、动物、动物（一）定义、分类、要求（一）定义、分类、要求 1 1、定义、定义能承载外源能承载外源DNADNA片段（基因）并带入受体细胞的传递片段（基因）并带入受体细胞的传递者。者。2 2、分类、分类克隆载体、穿梭载体、表达载体克隆载体、穿梭载体、表达载体3 3、要求、要求（1 1）自主复制能力）自主复制能力（2 2）可利用的限制酶切点）可利用的限制酶切点（二）载体因宿主而不同（二）载体因宿主而不同 1 1、原核、原核（1 1）质粒质粒载体：能装载载体：能装载1010kbkb左右的左右的DNADNA片段片段质粒：是能自主复制的双链环状质粒：是能自主复制的双链环状DNADNA分子，它
12、们在细分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个个DNADNA分子，分子，1 1kb-200kbkb-200kb。a a、pBR322pBR322 b b、pUC18/19(p101)pUC18/19(p101)（二）载体因宿主而不同（二）载体因宿主而不同 1 1、原核、原核（1 1）质粒质粒载体：载体：a a、pBR322pBR322pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIB
13、al IApr（二）载体因宿主而不同（二）载体因宿主而不同 1 1、原核、原核（1 1）b b、pUC18pUC18BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII颜色反应：带有没有插入颜色反应：带有没有插入DNA片段的片段的Puc18/19质柆的质柆的菌落呈蓝色；插入有目的菌落呈蓝色；插入有目的DNA片段，那么就会破坏片段，那么就会破坏lacZ的结构，导致细菌无法产生功能性的的结构，
14、导致细菌无法产生功能性的lacZ蛋白，也就无蛋白，也就无法形成杂合法形成杂合半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。（2 2）噬菌体载体：能装载）噬菌体载体：能装载2424kbkb左右的外源左右的外源DNADNA。噬。噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的多种形式、大小不一的DNADNA，且感染率高。且感染率高。（二）载体因宿主而不同（二）载体因宿主而不同 （3 3）人工载体：大多具有大肠杆菌质粒的抗药性和）人工载体：大多具有大肠杆菌质粒的抗药性和噬菌体强感染力，同时满足携带真核生物的目的基因大
15、噬菌体强感染力，同时满足携带真核生物的目的基因大片段片段DNADNA。柯斯质粒：是将质粒与柯斯质粒：是将质粒与 噬菌体噬菌体DNADNA包装有关的区包装有关的区段（段（coscos序列）相结合构建而成的克隆载体。能装载序列）相结合构建而成的克隆载体。能装载3535kbkb45kb45kb的外源的外源DNADNA。（二）载体因宿主而不同（二）载体因宿主而不同 2 2、真核微生物、真核微生物（1 1）酵母质粒）酵母质粒（2 2）人工染色体载体：）人工染色体载体：a a、YACYACb b、BACBAC（二（二 ）载体因宿主而不同载体因宿主而不同 3 3、植物、植物（1 1）TiTi质粒质粒（2 2
16、）植物）植物DNADNA病毒（很少应用）病毒（很少应用）（3 3）植物转座子（很有前景）植物转座子（很有前景）4 4、动物动物 （1 1）取代型）取代型 （2 2）病毒质粒重组型）病毒质粒重组型（二（二 ）载体因宿主而不同载体因宿主而不同五、基因重组五、基因重组 （一）目的基因的获得（一）目的基因的获得1 1、基因的组成基因的组成：结构基因、调节基因、操纵基因：结构基因、调节基因、操纵基因2 2、目的基因的获得、目的基因的获得（1 1）原核：）原核：基因文库基因文库（2 2）真核：）真核：cDNAcDNA、DNADNA的化学合成、的化学合成、PCRPCR（二）目的基因导入受体细胞（二）目的基因
17、导入受体细胞 1 1、受体细胞及分类受体细胞及分类 （1 1）定义：也称宿主细胸或表达系统，主目的基因）定义：也称宿主细胸或表达系统，主目的基因的表达，名手为复制、转录、翻译、后加工、分泌等提的表达，名手为复制、转录、翻译、后加工、分泌等提供条件。供条件。五、基因重组五、基因重组 （2 2）受体细胞选择的原则（）受体细胞选择的原则（p118)p118)(3)(3)分类：微生物表达系统、植物细胞表达系统、动分类：微生物表达系统、植物细胞表达系统、动物细胞表达系统物细胞表达系统 （4 4）注意区分几个概念）注意区分几个概念a a 融合系统与融合蛋白融合系统与融合蛋白b b 瞬时表达系统与稳定表达系
18、统瞬时表达系统与稳定表达系统c c 导入方法：高等动植物显微注射、电穿孔导入方法：高等动植物显微注射、电穿孔原核细胞转导、转化原核细胞转导、转化 转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的自另一基因型细胞的DNADNA而使它的基因型和表型发生相而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。应变化的现象。转导：是由病毒介导的细胞间进行遗传交换的一种转导：是由病毒介导的细胞间进行遗传交换的一种方式，即一个细胞的方式，即一个细胞的DNADNA或或RNARNA通过病毒载体的感染转移通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。到另一个细胞中。2 2、导
19、入过程、导入过程 （1 1）目的基因导入克隆载体：强启动子、便于连接、）目的基因导入克隆载体：强启动子、便于连接、因细胞不同选用合适的载体因细胞不同选用合适的载体五、基因重组五、基因重组（2 2）重组）重组DNADNA分子导入受体细胞：分子导入受体细胞：转化、高压电穿孔法、多聚物介导法、磷酸钙或转化、高压电穿孔法、多聚物介导法、磷酸钙或DEAEDEAE葡聚糖介导的转染法、原生质体融合法、脂质体介导葡聚糖介导的转染法、原生质体融合法、脂质体介导法、显微注射法、粒子轰击法、激光微束穿孔法法、显微注射法、粒子轰击法、激光微束穿孔法(三）三）重组体的筛选重组体的筛选1 1、物理方法：如电泳、物理方法：
20、如电泳2 2、生物学方法、生物学方法（1 1）遗传学方法：利用抗生素抗性基因、营养缺陷互补）遗传学方法：利用抗生素抗性基因、营养缺陷互补法法（2 2）免疫学方法免疫学方法（3 3）利用噬菌斑筛选利用噬菌斑筛选3 3、核酸杂交核酸杂交基本原理：基本原理：(探针探针probprob)(1)(1)原位杂交原位杂交（2 2）southernsouthern(3)northern(3)northern(四）四）DNADNA序列分析序列分析1 1、MaxamMaxamGilbertGilbert化学降解法化学降解法2 2、SangerSanger双脱氧法双脱氧法Cloning into a Plasmid
21、Cloning into a PlasmidCloning into a Yeast Artificial Chromosome(YAC)Bt毒蛋白基因毒蛋白基因病毒外壳基因和病毒复制酶基因病毒外壳基因和病毒复制酶基因几丁质酶基因和抗毒素合成基因几丁质酶基因和抗毒素合成基因调节细胞渗透压的基因调节细胞渗透压的基因抗冻蛋白基因抗冻蛋白基因抗除草剂基因抗除草剂基因富含赖氨酸的蛋白质编码基因富含赖氨酸的蛋白质编码基因控制番茄果实成熟的基因控制番茄果实成熟的基因植物花青素代谢有关的基因植物花青素代谢有关的基因六、基因工程的环境保护应用六、基因工程的环境保护应用遭到玉米螟侵害和真菌感染的普通玉米遭到玉米
22、螟侵害和真菌感染的普通玉米(左左)与与Bt玉米玉米(右右)富含赖氨酸的转基因玉米富含赖氨酸的转基因玉米l“转基因荧光猪转基因荧光猪”不含胆固醇的转基因小鼠不含胆固醇的转基因小鼠荧光斑马鱼荧光斑马鱼荧光热带鱼荧光热带鱼转基因幼猴和母亲转基因幼猴和母亲 首只转基因猴降生首只转基因猴降生转基因蝴蝶转基因蝴蝶1t1t水中只有水中只有1010个病毒也能被个病毒也能被DNADNA探针检测出来探针检测出来 利用基因工程培育的利用基因工程培育的“指示生物指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。基因工程做成的基因工程做成的“超级细菌超级细菌”能吞食和分能吞食和分解多种污染环境的物质。解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的育成功的“超级细菌超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDT等毒害物质。等毒害物质。下课啦!
