1、生物技术制药个论生物技术制药个论 基因工程制药基因工程制药 抗体制药抗体制药 动物细胞制药动物细胞制药 植物细胞制药植物细胞制药 酶工程制药酶工程制药 现代生物技术改造传统制药工业现代生物技术改造传统制药工业一、基因工程药物种类蛋白细胞因子药物蛋白类激素溶血栓药物治疗用酶可溶性受体和黏附分子其它核酸DNA药物反义RNA药物RNAi药物核酶重组蛋白质类药物 细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子 蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。溶血栓药物：组织型纤
2、溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体型 其他：血红蛋白、白蛋白等。核酸类药物 核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。基因工程药物的特点 从根本上解决了某些药物的生物原料 适应证不断延伸 技术含量高 加速疑难病
3、症新药物的开发二、研制基因工程药物的关键技术确定研制基因工程药物的技术路线 基本技术路线基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因 组入表达载体 受体细胞高效表达 动物试验 临床试验 申报新药证书 基本技术路线基本技术路线2：基因组未知功能的人类基因全长cDNA群组入表达载体受体细胞瞬间表达功能初筛功能验证重组蛋白表达体内外药效分析临床前研究临床验证申报新药证书 优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。宏观：在分子水平上，采用类似于工程设计宏观
4、：在分子水平上，采用类似于工程设计的方法，按人类的需要产生不同的基因产物的方法，按人类的需要产生不同的基因产物或定向的创造生物的新性状，使之或定向的创造生物的新性状，使之稳定地遗稳定地遗传给子代。传给子代。微观：将一种或多种生物体（供体）的基因微观：将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并遗传并表达出新性状表达出新性状。供体、受体、载体供体、受体、载体无性繁殖：称之为无性繁殖：称之为“克隆克隆”行使正常功能：称之为行使正常功能：称之为“表达表达”
5、基因工程的定义基因工程的定义在体外，将各种来源的在体外，将各种来源的DNA片段片段与与载体载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。定的基因产物。DNA片段：同源的或异源的、原核的或真片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的核的、天然的或人工合成的 载体载体DNA：病毒、细菌质粒或噬菌体：病毒、细菌质粒或噬菌体 上游技术（上游技术（upstream）-上游技术十分重要上游技术十分重要 重组子的构建重组子的构建 工程菌的构建及高效表达工程菌的构建及
6、高效表达 下游技术（下游技术（downstream）-下游技术更为重要下游技术更为重要 工程菌大规模发酵最佳参数的确定工程菌大规模发酵最佳参数的确定 新型生物反应器的研制新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制分离纯化的优化控制 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 超滤、反渗透技术的应用超滤、反渗透技术的应用我国现代生物技术与国际水平相比我国现代生物技术与国际水平相比上游技术落后上游技术落后35年年下游技术落后下游技术落后15年以上年以上基因工程技术基因工程技术工程菌构建流程工程菌构建流程 选择载体选择
7、载体 获得目的基因获得目的基因 目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组 重组载体的转化重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 质粒（质粒（plasmid）噬菌体（噬菌体（phage）病毒（病毒（virus）载体（载体（vector）载体的条件载体的条件 分子小（分子小（10 Kb）有限制酶酶切位点有限制酶酶切位点 可自主复制可自主复制 有足够的有足够的copy数数 带筛选的标志带筛选的标志 restriction endonuclease 一类能识别双链一类能识别双链DNA分子中分子中特异核苷酸序列特异核苷酸序列的的DNA水解酶水解酶 特异核苷酸序列特异核苷酸序列 大多为大多为
8、 46 bp 回文对称（回文对称（palindrome sequence）5GAATTC 3 5GGATCC 33CTTAAG 5 3CCTAGG 5宿主细胞宿主细胞原核细胞：细菌、枯草杆菌原核细胞：细菌、枯草杆菌酵母：酿酒酵母，必赤酵母酵母：酿酒酵母，必赤酵母植物细胞植物细胞:昆虫细胞：昆虫细胞：哺乳动物细胞：哺乳动物细胞：a melting down of flesh and limbs into urine.and that is the reason why the sickness has been called diabetes,as if it were a wine sipho
9、n,because liquid is not retained in the body.(ca.81-138A.D.)1674 Thomas Willis 發現患者尿液有甜味，稱之“diabetes mellitus”.1776 Matthew Dobson 取患者尿液殘餘物證實為糖。Paul Langerhans(later half of 19th century)described islet cells-secrete glucose lowering substance 1922 Banting and Best discovered insulin.T-J WuDiscovery
10、 of insulin Banting&Best-extracted insulin from dogs&proved that it controls symptoms of diabetes in dogs 19211st patient to receive pancreatic extract-14-yr old Leonard Thompson.First patient to benefit from insulin saved from death.由於首次在人以胰島素成功地由於首次在人以胰島素成功地控制糖尿病控制糖尿病1923 1923 諾貝爾獎頒給諾貝爾獎頒給Banting
11、Banting 與與 Macleod Macleod。1955 Frederick Sanger 1955 Frederick Sanger 闡明闡明胰島素結構胰島素結構 (A(A鍊鍊21 a.a.21 a.a.與與B B 鍊鍊 30 a.a.)30 a.a.)，19581958因此獲得諾因此獲得諾貝爾獎。貝爾獎。1959 Solomon Beson 1959 Solomon Beson 與與 Rosalyn YalowRosalyn Yalow開發出免疫測定開發出免疫測定技術技術(immunoassay technique)(immunoassay technique)，Yalow Yalo
12、w 也於也於1977 1977 獲得諾貝獲得諾貝爾獎。爾獎。B-chainA-chainC-peptides-ss-ss-sManufacture of Insulin 1923-started manufacturing insulin(Eli Lilly,Novo)Most developments in insulin therapy have originated from the laboratories of Novo-Nordisk NPH insulin highly purified insulin monocomponent insulin semisynthetic in
13、sulin biosynthetic human insulin Currently Novo Nordisk manufactures human insulin from bakers yeast using rDNA technology；Eli Lilly produces human insulin using E.coli.Problems with Early Preparations Crude high levels of non-insulin-like impurities Proinsulin,proinsulin intermediate,covalent insul
14、in dimerAcidic pH 4-4.3-pain during injectionHigh incidence of allergic reactions Short duration of action(more no.of injections)Better Purification methodsConventional:isoelectric precipitation and recrystallization,Imp:10000-30000ppmSingle peak:by gel-filtration chromatography,(Imp 300-3000ppm)Imp
15、roved single peak:by ion-exchange chromatography,(50ppm)Highly purified:twice chromatographed insulin,(purified to 10ppm)Monocomponent:Imp1ppmHistory of insulin preparations1922:Isolation of insulin1923:Novo Nordisk starts production of insulin1946:NPH(Neutral Protamine Hagedorn)or Isophane insulin1
16、961:First neutral soluble insulin:Actrapid1964:First premixed insulin:Mixtard1973:Monocomponent(MC)purity1982:Human Monocomponent HM1985:NovoPen with Penfill 1984:Research on analogues 胰岛素是由51个氨基酸组成的双链多肽激素，一种可溶性酸性蛋白，分子量为5734道尔顿；每个胰岛素单体包括两条肽链（A、B链），A链含有21氨基酸；B链含有30氨基酸并分别由两个胱氨酸的二硫键连接，多聚体必须裂解成单体才可吸收；呈酸
17、性，等电点为5.3。胰岛素受pH值、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚。速效胰岛素速效胰岛素-Lispro 赖脯胰岛素赖脯胰岛素Lispro由Lilly公司研发而成，是人胰岛素链上的第28 位的脯氨酸和第29 位的赖氨酸位置互换，其他的氨基酸序列和结构没有变化，以单体的形式存在.速效胰岛素-Aspart门冬胰岛素 1999年，Aspart在欧洲上市；2002年在我国上市，是由诺和诺德公司研发的速效胰岛素类似物，人胰岛素链28 位的脯氨酸被天冬氨酸取代，使该胰岛素类似物不易形成六聚体。与Lispro相比，Aspart的吸收速度更快，对餐后血糖的控制、降低糖化血红蛋白效果更好。这种药代动力学的差异
18、可能与它们的等电点不同有关。Aspart对酸化溶液沉淀蛋白的耐受度较高速效胰岛素速效胰岛素-Glulisine赖谷胰岛素 是Aventis 公司正在研发的一种新型快速作用的胰岛素类似物，链3 位的天冬酰胺被赖氨酸替代，而B链29位的赖氨酸则被谷氨酸取代。长效胰岛素-Glargine甘精胰岛素 由Aventis 公司研发的长效胰岛素类似物，2000 年在美国和欧洲上市，于2003 年在我国上市。和人胰岛素的区别在于A 链羧基端的第21 位天冬氨酸被甘氨酸替代，B链C末端加上2个精氨酸残基，。结构改变的结果是改变了胰岛素的等电点，由pH54升至67，使Glargine在生理pH条件下更难溶解、吸收
19、更为缓慢，六聚体的结合更加稳定，无分泌峰值.1115105510152020Asn2530G l yArg ArgSubst i t ut i onExt ensi on长效胰岛素-Detemir地特胰岛素 由诺和诺德公司研制生产，结构上去除了人胰岛素B链29位赖氨酸E位以共价键结合一个N一16烷酸基的14碳游离脂肪酸，并去掉第30位的苏氨酸残基。与Glargine不同，Detemir 溶液在皮下不会形成沉淀，因此吸收速率恒定 基因诊断基因诊断 gene diagnosis 内在因素（主要是遗传因素）内在因素（主要是遗传因素）外在因素（环境因素）外在因素（环境因素）外在因素外在因素+内在因素内
20、在因素人类的疾病原因人类的疾病原因 临床学诊断临床学诊断 血清学诊断血清学诊断 生化学诊断生化学诊断 狭义的概念狭义的概念 对疾病或与致病相关的核酸片段（对疾病或与致病相关的核酸片段（DNA 或或 RNA）的确定及核苷酸序列的测定）的确定及核苷酸序列的测定 广义的概念广义的概念 对疾病或与致病相关的基因（对疾病或与致病相关的基因（DNA）的表达）的表达产物（产物（mRNA、蛋白质）的确定和序列测定、蛋白质）的确定和序列测定基因诊断的概念基因诊断的概念 基因诊断的特点基因诊断的特点 针对性强针对性强 以探测基因为目标，属于以探测基因为目标，属于“病因诊断病因诊断”特异性高特异性高 以分子杂交技术
21、为基本原理以分子杂交技术为基本原理 灵敏度高灵敏度高 基因探针带有十分敏感的检测标记，待基因探针带有十分敏感的检测标记，待 测标本微量测标本微量 适应性强适应性强 基因探针可为任何来源，任何种类，探基因探针可为任何来源，任何种类，探 针序列可为已知亦可未知，检测目标可针序列可为已知亦可未知，检测目标可 为特定的基因或基因组合，可为内源基为特定的基因或基因组合，可为内源基 因亦可外源基因，诊断范围广因亦可外源基因，诊断范围广 与疾病相关的与疾病相关的DNA分子（片段）及分子（片段）及其核苷酸序列的确定和检测其核苷酸序列的确定和检测 疾病基因疾病基因 疾病相关基因疾病相关基因基因诊断的基础基因诊断
22、的基础及其核心问题及其核心问题基因诊断的途径基因诊断的途径基因突变的检测基因突变的检测 基因连锁分析：基因连锁分析：连锁分析主要是应用限制酶片段长度多连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（态性（RFLP）为遗传标志进行家系分析）为遗传标志进行家系分析在人类基因组中，平均约在人类基因组中，平均约 200 bp可发生一对变异可发生一对变异（称为中（称为中心突变心突变）。中心突变造成了序列上的多态性，不少序列）。中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性的多态性用该限制酶水解用该限制酶水解 DN
23、A就会产生长度不同的片段，称为就会产生长度不同的片段，称为RFLP mRNA的检测：的检测：mRNA检测是基因诊断的重要方面，检测是基因诊断的重要方面，其不仅从基因表达水平提供基因功能是否正常的直接依据，其不仅从基因表达水平提供基因功能是否正常的直接依据，而且在基因诊断上具有以下优点：而且在基因诊断上具有以下优点：mRNA相当于以基因为模板的扩增产物，相当于以基因为模板的扩增产物，因此检测因此检测mRNA 灵敏度比检测灵敏度比检测DNA更高更高 mRNA不含内含子，比不含内含子，比DNA容易检测容易检测 限制性核酸内切酶酶谱分析限制性核酸内切酶酶谱分析 核酸分子杂交核酸分子杂交 限制酶片段长度
24、多态性连锁分析限制酶片段长度多态性连锁分析 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）DNA芯片技术芯片技术基因诊断应用基因诊断应用在遗传性疾病和产前诊断中的应用在遗传性疾病和产前诊断中的应用 血红蛋白病血红蛋白病 杜氏肌营养不良症杜氏肌营养不良症 苯丙酮尿症苯丙酮尿症 脆性脆性X综合症综合症在感染性疾病诊断中的应用在感染性疾病诊断中的应用 病毒病毒 细菌细菌 螺旋体螺旋体 支原体支原体 衣原体衣原体 寄生虫寄生虫基因芯片基因芯片(DNA chip or microarray)DNA芯片（或基因芯片）芯片（或基因芯片）是将许多特定是将许多特定的的DNA寡核苷酸或寡核苷酸或DNA片段（称为探针）片段（
25、称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，通过检测杂交信号并进行计算机分析，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因多少，以及用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面方面基因芯片技术流程基因芯片技术流程 制备方法及点样仪器制备方法及点样仪器探针的制备：探针的制备：标记标记方法方法杂交：杂交：杂交液、杂交温度、杂交液、杂交温度、洗涤条件的选
26、择洗涤条件的选择扫描仪扫描仪:激光激光 CCD分析软件的开发分析软件的开发基因芯片的制备基因芯片的制备杂交杂交检测检测数据分析数据分析一、基因芯片原理及制备方法一、基因芯片原理及制备方法 原位合成：寡核苷酸芯片，原位合成：寡核苷酸芯片，采用光导化学合成和照相平板印采用光导化学合成和照相平板印刷技术，在固相介质表面特定区域合成已知序列的寡核苷酸，刷技术，在固相介质表面特定区域合成已知序列的寡核苷酸，直接点样：寡核苷酸芯片和直接点样：寡核苷酸芯片和cDNA芯片芯片已知基因序列通过已知基因序列通过在液相中化学合成，或通过在液相中化学合成，或通过PCR技术扩增，或克隆的基因组片段，技术扩增，或克隆的基
27、因组片段，经纯化及定量分析后，由点样机器人将靶基因序列直接点到预先经纯化及定量分析后，由点样机器人将靶基因序列直接点到预先经过化学修饰的基片上；然后将未结合的靶基因从基片上洗掉，经过化学修饰的基片上；然后将未结合的靶基因从基片上洗掉，就得到基因芯片。就得到基因芯片。原位合成法原位合成法直接点样法直接点样法直接从直接从DNA数据库得到信息数据库得到信息进行寡核苷酸合成进行寡核苷酸合成预先制备预先制备cDNA样品并进行样品并进行合成合成芯片个体之间差异小芯片个体之间差异小差异大差异大密度高，密度高，400000/1.6cm264 500/6.5cm2合成寡核苷酸长度有限，特合成寡核苷酸长度有限，特
28、异性差异性差靶基因检测特异性高靶基因检测特异性高 成本高成本高成本低成本低数据分析、寻找差异表达的基因数据分析、寻找差异表达的基因Cy3标记标记A组织组织Cy5标记标记B组织组织混合探针混合探针以两种波长的激光扫描以两种波长的激光扫描杂交杂交AB二、样本的制备、标记与芯片杂交二、样本的制备、标记与芯片杂交1.1.实验样本的制备实验样本的制备 常用的基因芯片实验样本是常用的基因芯片实验样本是mRNA(cDNA)mRNA(cDNA)直接从组织或细胞中提取的直接从组织或细胞中提取的mRNAmRNA 利用利用PCRPCR技术扩增出的技术扩增出的cDNAcDNA2.2.探针的标记探针的标记-荧光标记荧光
29、标记 用花青素用花青素(cyanin)Cy3,Cy5(cyanin)Cy3,Cy5进行双色荧光标进行双色荧光标记记,其激发和发射波长分别是其激发和发射波长分别是550/570,550/570,649/670649/670 当用当用mRNAmRNA作模板时作模板时,常用反转录方法进行直接常用反转录方法进行直接标记标记3.3.芯片杂交芯片杂交 扫描仪扫描仪 激光共聚焦扫描激光共聚焦扫描光源：特定波长的光光源：特定波长的光激发面积：激发面积：100100平方微米平方微米如：如：ScanArray 3000ScanArray 3000 CCD(电荷耦合摄像芯片扫描仪电荷耦合摄像芯片扫描仪)光源：连续波
30、长的光（如弧光灯）光源：连续波长的光（如弧光灯）同时对整张芯片表面进行扫描同时对整张芯片表面进行扫描三三 图像与数据处理图像与数据处理四、基因芯片的应用四、基因芯片的应用基因治疗：指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学
31、方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一 1991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因基因缺陷）的女孩体内导入重组的缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功基因，获得成功1994年，中国用导入人凝血因子年，中国用导入人凝血因子基因的方法成功治疗了乙型血友病基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者的患者腺病毒基因组是一个腺病毒基因组是一个线性的双链线性的双链DNA，其，其5端与端与一种末端蛋白（一种末端蛋白（TP）共价结合，）共价结合，5端上还具有末端上还具有末端反向重复序列。
32、病毒端反向重复序列。病毒DNA与核心蛋白与核心蛋白VII和一个和一个称为称为mu的小肽紧密结合的小肽紧密结合腺病毒家族（腺病毒家族（AdenoviridaeAdenoviridae）的成员可感染种类相当广泛）的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者复制，所以腺病毒成
33、为表达和传递治疗基因的主要候选者。腺病毒的一般特性腺病毒的一般特性抗体工程制药 概述单克隆抗体鼠源性单克隆抗体的改造基因工程抗体和抗体工程抗体诊断试剂抗体治疗药物从分子构成来看，抗体药物可分三类：（1）抗体或抗体片段。完整的抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、人源抗体；抗体片段包括Fab等。（2）抗体偶联物，或称免疫偶联物，由抗体或抗体片段与“弹头”药物连接而成，可用作“弹头”的物质有放射性核素、化疗药物与毒素。（3）融合蛋白，由抗体片段和活性蛋白两部分构成。三个高变区共同组成三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，该部位也称为互补性的抗原结合部位，该部位也称为互补性决定区决定区 重链和轻链的C区分别
34、称为CH和CL，不同类Ig的重链CH长度不一，同一种属动物中，同一类别Ig分子C区氨基酸的组成和排列顺序比较恒定。铰链区位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。根据氨基酸排列顺序的不同分为根据氨基酸排列顺序的不同分为可变区（可变区（V）和恒定区（）和恒定区（C）比较不同抗体比较不同抗体V区的氨基酸序列，区的氨基酸序列，发现发现VH和和VL各有各有3个区域的氨基个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，酸组成和排列顺序特别易变化，这些区域称为这些区域称为高变区高变区。单克隆抗体 用于疾病的诊断和治疗用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某
35、些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。单克隆抗体还可作为载体制备导向药物单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度 已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分
36、子质量只有完整抗体分子的1/801/3，而且鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。抗原脾B淋巴细胞融合融合淋巴细胞骨髓瘤细胞克隆1克隆2克隆3克隆4单克单克隆抗隆抗体和体和多克多克隆抗隆抗体的体的制备制备鼠源性单克隆抗体 的改进 改造鼠源性单克隆抗体的目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。如将鼠源性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换，则对人的免疫原性消失。对鼠源性抗体的改造已有很多成果报道，改造后的单抗的类型和特性：鼠源单抗的改造随基因工程的发展经历了人鼠嵌合抗体（人IgC-小
37、鼠IgV，150000）、人源化单克隆抗体及人源性单克隆抗体三个阶段 改形抗体（将小鼠CDRs替换为人CDRs，150000）Fab(完整L链和Fd，50000）FV（VH和VL，25000）单链抗体（SCFV，VH-多肽-VL，27000）单域抗体（VH或VL，12500）最小识别单位（MRU）（一个CDR，2000）。小鼠抗体嵌合抗体重构抗体人源抗体人源化单克隆抗体的设计与开发的技术流程人源化单克隆抗体的设计与开发的技术流程:包括靶分子的挑选、抗体人源化、人抗体制备、抗体基因克隆、抗体库构建、抗体筛选、抗原表位预测、建模分析、动物模型研究、临床试验、抗体表达载体构建、细胞培养等。抗体人源化
38、方法可供选择抗体人源化方法可供选择：一是鼠抗体人源化。具体技术包括嵌合抗体、表面重塑抗体、重构抗体；二是全人源化抗体。包括抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人源化抗体、转染色体牛等。目前抗体药物研发中尚待解决的问题目前抗体药物研发中尚待解决的问题:包括靶分子的挑选，抗体人源化及人抗体制备，抗体基因克隆及抗体库构建，抗体的高通量大规模筛选技术，抗原表位的预测、模建和分析技术，抗原抗体相互作用的立体模型构建，抗体体外亲和力成熟，各种增加抗体效应功能的技术，抗体的高通量大规模筛选技术，动物模型反应与人体反应一致性，抗体高效表达载体构建和动物细胞规模化培养技术等。人源化单克隆抗体的设计、优化和人源化单
39、克隆抗体的设计、优化和临床试验临床试验 抗体设计和优化需要大量应用蛋白质抗体设计和优化需要大量应用蛋白质工程方面的计算机分子结构模拟技术、工程方面的计算机分子结构模拟技术、组合化学技术和分子进化技术组合化学技术和分子进化技术 动物细胞制药与细胞治疗动物细胞改造与蛋白质药物生产人细胞改造与疾病治疗生产用动物细胞要求和获得 原代细胞原代细胞 已建立的二倍体细胞系已建立的二倍体细胞系 可无限期传代的转化细胞系可无限期传代的转化细胞系 基因工程细胞基因工程细胞动物细胞培养的方法和操作方式 为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件：（1）绝对无菌操作；（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量
40、的离子掺入；（3）适量氧气供应；（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等；（6）及时分种，保持合适的细胞密度。动物细胞培养的方法和操作方式 从生产实际来看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。无论是哪种培养，其操作方式与细菌培养一样，一般可分为分批式操作、补料-分批（或流加式）操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作，其中分批式、半连续式和灌流式比较重要。目前生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。贴壁依赖性细胞，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度。植物细胞制药 植物
41、细胞的形态和生理特性 植物细胞培养的基本技术 影响植物次级代谢产物累积的因素 植物细胞培养的生物反应器 进展与展望植物无菌培养技术 高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。目前已经研究过的近300种植物细胞培养物可以生产400多种人们感兴趣的成分。植物无菌培养技术分如下几类：幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（plant culture）；愈伤组织培养能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养”（suspension culture）；离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及
42、未成熟果实的培养，称为“器官培养”（organ culture）；未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为“胚胎培养”（embryo culture）。培养方法 1、成批培养法：植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期，植物细胞的两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。2、半连续培养法 3、连续培养法 4、固定化培养法常见植物次生代谢物 生物碱类：麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素 糖苷类：黄酮苷，大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类可以作为天然色素。挥发油：很多挥发油可作药用，如薄荷
43、油、丁香油、桉油等。有机酸：常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。酶工程制药 概述 酶的来源和生产 酶和细胞的固定化 固定化酶和固定化细胞的反应器 酶工程在医药工业中的应用 酶工程研究的进展酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术科学。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶工程主要有以下几个方面的研究内容：酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（包括酶传感器、反应检测等）；酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究；酶的分子改造与化学修
44、饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；有机相中酶反应的研究；酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。酶和细胞的固定化 酶反应几乎都在水溶液中进行，属均相反应，自然简便，但缺点是游离酶只能一次性一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量；另外溶液酶很不稳定很不稳定，容易变性和失活。将酶制剂制成既能保持其原有的催化活性、性能稳定、又不溶于水的固形物，即固定化酶，则可象一般固定催化剂那样使用和处理，就可以大大提高酶的利用率。与酶类似，细胞也能固定化，固定化细胞既有细胞特性和生物催化的特性，也具有固相催化剂的特点。固相酶还具有以下优点：可多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高。如固定化的葡萄糖异构酶可以在6065条件下连续使用超过1000h；反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高；反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；比水溶性酶更适合于多酶反应。酶和细胞的固定化方法载体结合法交联法包埋法热处理（细胞）物理吸附法共价结合法网格型微囊型离子结合法
