1、第第8 8章章 高效液相色谱法高效液相色谱法 HPLCHigh Performance Liquid Chromatography 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。8.1 8.1 高效液相色谱仪高效液相色谱仪四大部分组成：四大部分组成：溶剂输送系统（贮液器，高压泵）溶剂输送系统（贮液器，高压泵）进样系统（进样阀等）进样系统（进样阀等）分离系统（色谱柱等）分离系统（色谱柱等）检测记录系统（检测器，记录仪等）检测记录系统（检测器，记录仪等）1.高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主
2、要部件之一，压力：150350105 Pa为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价阳离子：二价阳离子：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+强碱性强碱性阴离子交换树脂阴离子交换树脂,保留值大小顺序保留值大小顺序:PO43-SO42-C2O42-I-HSO4-NO3-CN-NO2-Cl-HCOO-OH-F-CH3COO-流动相流动相 H2O、H2O+乙醇、乙醇、H2O+pH 缓冲剂缓冲剂 应用应用 无机离子无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等
3、4.4.尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法 size exclusion chromatography SEC凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱:水为流动相水为流动相 gel filtration chromatgraphy GFC凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱:非水流动相非水流动相 gel permeation chromatography GPC 1959年年 Porath和和Flodin发明发明 分离原理分离原理:试样分子的尺寸和形状不同来实现分离试样分子的尺寸和形状不同来实现分离GPC流动相流动相:水、四氢呋喃水、四氢呋喃 应应 用用:聚合物的分级聚合物的分级 生物聚合体（蛋白质，核酸，低聚糖生物聚合体（蛋
4、白质，核酸，低聚糖,多肽）的分离多肽）的分离8.3 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择l了解样品的有关性质了解样品的有关性质 样品的相对分子质量的大小样品的相对分子质量的大小 在水中和有机溶剂中的溶解度、极性和稳定程度在水中和有机溶剂中的溶解度、极性和稳定程度 化学结构化学结构l 熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围1.流动相种类与极性流动相种类与极性 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 它可显著改变组分分离状况它可显著改变组分分离状况 选择流动相在液相色谱中特别重要选择流动相在液相色谱中特别重要 按组成可分为
5、：按组成可分为：单组分和多组分；单组分和多组分；按极性可分为：按极性可分为：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按使用方式按使用方式可分为：可分为：固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微
6、量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫
7、外吸收。8.4 8.4 应用实例应用实例 方针：方针：要解决一个分析问题，先试反相色谱法要解决一个分析问题，先试反相色谱法 C18C18标准柱，改变流动相调节标准柱，改变流动相调节k（保留行为）和（保留行为）和（选择性（选择性）反相色谱法反相色谱法优点：优点：a.a.色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱 b.b.流动相主体为水，甲醇为有机改性剂，价廉易纯化流动相主体为水，甲醇为有机改性剂，价廉易纯化 c.c.tR 随溶质的疏水性增加而增大，可预计出峰顺序随溶质的疏水性增加而增大，可预计出峰顺序 d.d.改变基本流动相的改变基本流动相的pHpH，添加盐缓冲剂，金属螯和物，添加盐缓
8、冲剂，金属螯和物，手性试剂等，可分离非电离、弱电离、金属离子、手性异构手性试剂等，可分离非电离、弱电离、金属离子、手性异构体体多环芳香烃的分析多环芳香烃的分析:反相分配色谱法反相分配色谱法固定相：固定相：十八烷基十八烷基SiOSiO2 2,薄壳型薄壳型流动相：流动相：20%CH3OH/H2O 100%CH3OH,2%/min流速：流速：1mL/min 柱温：柱温：50紫外光度检测器紫外光度检测器（=254nm）镇痛剂的分析镇痛剂的分析阴离子交换色谱法阴离子交换色谱法固定相：强阴离子交换剂固定相：强阴离子交换剂流动相：流动相：pH 9.2+0.005mol/L NaNO3水溶液水溶液流速：流速：
9、1 1.2mL/min紫外光度检测器紫外光度检测器8.4 8.4 进展进展 柱微型化柱微型化 高柱效高柱效 高分辨率高分辨率 高选择性高选择性 快速分离快速分离High efficiency pCEC separation(500,000plates/m)of 14 explosives in 7 min,See ref.C.Baliey,C.Yan,Anal.Chem.,1998,70,3275 联用技术联用技术 HPLC-AAS HPLC-AFS HPLC-ICP-AES HPLC-UV-Vis HPLC-ICP-MS HPLC-IRHPLC联用技术在元素的化学形态分析中的应用联用技术在元
10、素的化学形态分析中的应用 元素的化学形态元素的化学形态:元素的生理学毒性大小元素的生理学毒性大小 对环境的污染程度对环境的污染程度 在生命过程中所起的作用在生命过程中所起的作用 如砷化合物毒性大小如砷化合物毒性大小 砷酸砷酸As(V)、亚砷酸、亚砷酸AS（III)、甲砷酸、二甲砷酸、甲砷酸、二甲砷酸 它们对实验大鼠的半数致死量分别为它们对实验大鼠的半数致死量分别为:1.5、5、50、500mg/kg 而砷甜菜碱和砷胆碱而砷甜菜碱和砷胆碱(AsC)并未发现对大鼠有毒并未发现对大鼠有毒 仅仅知道元素的总量是不够的，而需要了解它们的形态。仅仅知道元素的总量是不够的，而需要了解它们的形态。作作 业：业
11、：试从分离的基本原理、基本理论、检测方式以及试从分离的基本原理、基本理论、检测方式以及应用范应用范围等多方面，对围等多方面，对液相色谱与气相色谱进行全面比较。液相色谱与气相色谱进行全面比较。温温 度：度：10103030；相对湿度：相对湿度：8080；最好是恒温、恒湿最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施8.5 HPLC的日常维护与保养的日常维护与保养HPLC的日常操作条件：的日常操作条件：工作原理：工作原理：手柄位在手柄位在LoadLoad位置时，用微量进样针将样品从位置时，用微量进样针将样品从进样孔注射进入定量环中进样孔注射
12、进入定量环中(定量环充满后，多定量环充满后，多余样品从放空孔排出余样品从放空孔排出)手柄转动至手柄转动至InjectInject位置时，阀与液相流路接通，位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色谱柱中进行分析谱柱中进行分析 手柄转动要快速手柄转动要快速：手柄处于手柄处于Load和和Inject之间时，由之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留中途停留 部分装液法
13、部分装液法：进样量最多为定量环体积的：进样量最多为定量环体积的75 要求每次进样体积准确、相同要求每次进样体积准确、相同 完全装液法完全装液法：进样量最少为定量环体积的：进样量最少为定量环体积的3至至5倍倍 将定量环内残留的溶液完全置换样品，达到所要求的精将定量环内残留的溶液完全置换样品，达到所要求的精密度及重现性密度及重现性两种装液方法两种装液方法:样品必须过滤样品必须过滤：用用0.45(0.22)m的滤膜过滤的滤膜过滤 防止微粒阻塞进样阀防止微粒阻塞进样阀 减少对进样阀的磨损减少对进样阀的磨损 进样结束冲洗进样器进样结束冲洗进样器：用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，用不含盐的稀释剂
14、、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的在进样阀的Load和和Inject位置反复冲洗位置反复冲洗 再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧2.泵的保养泵的保养 使用流动相尽量要清洁使用流动相尽量要清洁 进液处的砂芯过滤头要经常清洗进液处的砂芯过滤头要经常清洗 流动相交换时要防止沉淀流动相交换时要防止沉淀 避免泵内堵塞或有气泡避免泵内堵塞或有气泡 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染防止样品的交叉污染 在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱 当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定
15、要清洗干净当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净 要注意流动相的脱气要注意流动相的脱气 避免使用高粘度的溶剂作为流动相避免使用高粘度的溶剂作为流动相 进样样品要提纯；严格控制进样量进样样品要提纯；严格控制进样量2.色谱柱的保养色谱柱的保养 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭3.3.紫外灯的保养紫外灯的保养 在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器；在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器；在分析完成后马上关闭检测器在分析完成后马上关闭检测器
