1、前前 言言本电子课件依据本电子课件依据生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学第八版设计制作。选择的第八版设计制作。选择的制作软件主要为制作软件主要为Microsoft PowerPointMicrosoft PowerPoint。本课件主要为便于师生的教与学，。本课件主要为便于师生的教与学，使用对象主要为医学院校的生物化学教师和医学类专业的五年制学生，以使用对象主要为医学院校的生物化学教师和医学类专业的五年制学生，以及研究生入学考试准备和各种资格考试时医学生物化学的复习使用。及研究生入学考试准备和各种资格考试时医学生物化学的复习使用。第八版第八版生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学的参编
2、单位有全国的参编单位有全国2121所高等院校。所高等院校。课件光盘由华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系与生物化学课件光盘由华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系与生物化学第八版编委会共同设计制作，由人民卫生出版社出版发行。版权所有，未第八版编委会共同设计制作，由人民卫生出版社出版发行。版权所有，未经许可，不得随便翻刻销售发行，违者必究。经许可，不得随便翻刻销售发行，违者必究。孙军、查锡良、药立波教授负责本课件总体设计；华中科技大学同济孙军、查锡良、药立波教授负责本课件总体设计；华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系陈娟、袁萍、段秋红、尹燕华、卢涛、刘医学院生物化学与分子生
3、物学系陈娟、袁萍、段秋红、尹燕华、卢涛、刘琳、周洁、张颖、田俊、熊宇芳等老师参与了课件设计和制作的具体工作；琳、周洁、张颖、田俊、熊宇芳等老师参与了课件设计和制作的具体工作；教材全体编委在课件制作过程中提出了宝贵的修改意见并进行了审定，在教材全体编委在课件制作过程中提出了宝贵的修改意见并进行了审定，在此一并致谢。此一并致谢。由于我们水平有限，本课件的缺点再所难免，敬请使用者批评指正，由于我们水平有限，本课件的缺点再所难免，敬请使用者批评指正，以便今后修订。以便今后修订。目目 录录 第第01章蛋白质的结构与功能章蛋白质的结构与功能 第第02章核酸的结构与功能章核酸的结构与功能 第第03章酶章酶
4、第第04章聚糖的结构与功能章聚糖的结构与功能 第第05章维生素和无机盐章维生素和无机盐 第第06章糖代谢章糖代谢 第第07章脂类代谢章脂类代谢 第第08章生物氧化章生物氧化 第第09章氨基酸代谢章氨基酸代谢 第第10章核苷酸代谢章核苷酸代谢 第第11章非营养物质代谢章非营养物质代谢 第第12章物质代谢的整合与调节章物质代谢的整合与调节 第第13章真核基因与基因组章真核基因与基因组 第第14章章DNA的生物合成的生物合成 第第15章章DNA损伤与修复损伤与修复 第第16章章RNA的生物合成的生物合成 第第17章蛋白质的生物合成章蛋白质的生物合成 第第18章基因表达调控章基因表达调控 第第19章细
5、胞信号转导的分子机制章细胞信号转导的分子机制 第第20章常用分子生物学技术的原理及其应用章常用分子生物学技术的原理及其应用 第第21章章DNA重组和重组重组和重组DNA技术技术 第第22章基因结构与功能分析技术章基因结构与功能分析技术 第第23章癌基因、肿瘤抑制基因与生长因子章癌基因、肿瘤抑制基因与生长因子 第第24章疾病相关基因的鉴定与基因功能研究章疾病相关基因的鉴定与基因功能研究 第第25章基因诊断与基因治疗章基因诊断与基因治疗 第第26章组学与医学章组学与医学概念、理论、研究、概念、理论、研究、应用应用Conception,theory,research,and applicationC
6、onception,theory,research,and application逻辑和逻辑和自学自学 Logic and LIY(Learn It Yourself)目录目录常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology科学的安全第一！科学的安全第一！目录目录第一节第一节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique目录目录n分子杂交（分子杂交（m
7、olecular hybridization）1.核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放放在一起，只要在在一起，只要在DNA或或RNA的单链分子之的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。2.蛋白质杂交蛋白质杂交抗原抗体抗原抗体反应反应一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目录目录复性复性
8、RNADNA目录目录（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。目录目录用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断
9、是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术目录目录二、印迹技术二、印迹技术的主要类别的主要类别及应用及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Southern blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。（四）蛋白质修饰的（四）蛋白质修饰的印迹印迹(Eas
10、tern blotting)用于用于蛋白质翻译后修饰（比如酯酰化，糖基化，蛋白质翻译后修饰（比如酯酰化，糖基化，磷酸化等）的研究磷酸化等）的研究。目录目录几种印迹几种印迹技术的比较技术的比较分子杂交实验分子杂交实验目录目录放放射射自自显显影影照照片片目录目录n其他：其他：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)目录目录5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的
11、工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 目录目录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目录目录PCR技术原理示意图技术原理示意图 目录目录n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性9595 C C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目录目录 模板模板DNA 特异性引物特异性引物 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分目录目录利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获
12、为模板获得已知目的基因片段得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆文库或基因组文库中克隆基因。基因。二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆目录目录利用利用PCR技术可以随意设计引物在体技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突外对目的基因片段进行嵌和、
13、缺失、点突变等改造。变等改造。PCR技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变目录目录将将PCR技术引入技术引入DNA序列测定，使测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性因突变检
14、测的敏感性。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析目录目录 逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。（一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术目录目录 原位原位PCR(in situ PCR)是在组
15、织切片或细胞涂片是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术目录目录（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCR(real-time PCR)技术通过动态技术通过动态监测反应过程中的产物量，
16、消除了产物堆积监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。目录目录n实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355目录目录n实时实时PCRPCR分类：分类：实时实时PRC非探针类非探针类探针类探针类1.TaqMan1.TaqMan探针法探针法 2.2.分子信标探针法分子信标探针法 3.FRET3.FRET探针法探针法 目录目录图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图A PCR song for better ScientistsA group of craz
17、y scientific nerds from BioRad1.There was a time when to amplify DNA,2.You had to grow tons and tons of tiny cells.3.(Oooh)Then along came a guy named Dr.Kary Mullis,4.Said you can amplify in vitro just as well.5.Just mix your template with a buffer and some primers,6.Nucleotides and polymerases too
18、.7.Denaturing,annealing,and extending,8.Well its amazing what heating and cooling and heating will do.9.PCR when you need to detect mutation(detect mutation)10.PCR when you need to recombine(recombine).11.PCR when you need to find out who the daddy is(whos your daddy?)12.PCR when you need to solve a
19、 crime(solve a crime)总结，这些应用中总结，这些应用中最重要的，恐怕要数最重要的，恐怕要数:“PCR,when you need to find out who the daddy is”目录目录第三节第三节基因文库基因文库Gene Library目录目录 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。目录目录一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADN
20、A文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人工染色体等。目录目录n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选目录目录第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例目录目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNA
21、mRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库目录目录第四节第四节高通量技术高通量技术High Throughput Technique目录目录是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的对芯片进
22、行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)目录目录DNA芯片芯片技术技术目录目录n基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图目录目录是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统应时，可捕获样品中
23、的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理目录目录目录目录NGS vs.microarray1.应用成熟度应用成熟度2.单价单价3.期望的输出数据期望的输出数据4.研究总体目标（如发现新基因还是了解概况）研究总体目标（如发现新基因还是了解概况）目录目录第五节第五节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and
24、 Protein-DNA Interaction Study目录目录一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术目录目录标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要
25、用于证明两种蛋标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。合的未知分子。目录目录标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图目录目录（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途目录目录n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子
26、的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。目录目录电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DN
27、A结合蛋白与相应结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究术也被用于研究RNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定RNA序列间序列间的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定目录目录放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn
28、凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图目录目录染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前可是目前可以研究体内以研究体内DNA与蛋白质相互作用的与蛋白质相互作用的主要方法。主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法目录目录n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图目录目录 DNA重组和重组重组和重组DNA技术技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology目录目录nDNA重组重组（DNA recombination）
29、是指不）是指不同同DNA分子断裂和连接而产生分子断裂和连接而产生DNA片段片段的交换并重新组合形成新的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。分子的过程。n重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以）是指在体外将两个或两个以上上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新形成新DNA分子的过程。分子的过程。目录目录第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature目录目录DNA重组重组同源重组同源重组(homol
30、ogous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)转座重组转座重组(transposition recombination)接合作用接合作用(conjugation)转化作用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transduction)目录目录 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homologous recombination)，又称又称基本重组基本重组（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在
31、重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。段的交换。以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的同源重组为例，了解同源重组机制的的Holliday模型模型一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式目录目录nHolliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤：两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个
32、DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体；中间体；通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：目录目录n参与细菌参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最同源重组的酶有数十种，其中最关键的是关键的是RecA蛋白蛋白、RecBCD复合物复合物和和RuvC蛋蛋白白。nRecBCD复合物复合物具有三种酶活性，即依赖于具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切增强的核酸内切酶活性以及需要酶活性以及需要A
33、TP的解螺旋酶活性。的解螺旋酶活性。nRecA蛋白蛋白可结合单链可结合单链DNA（ssDNA），形成），形成RecA-ssDNA复合物。复合物。nRuvC有内切酶活性，能专一性识别有内切酶活性，能专一性识别Holliday连连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。目录目录二、位点特异重组是发生在特异位点二、位点特异重组是发生在特异位点间的间的DNA整合整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合。位点间发生的整合。目录目录噬
34、菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)。（一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合目录目录（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。目录目录（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L链链)和两
35、条重和两条重链链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族编码，组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链其中两个编码轻链(和和)，一个编码重链。，一个编码重链。轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 目录目录 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基基因的因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧片段的两侧均存在保守的重组信号序列均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequenc
36、e,RSS)。此重排的重组酶基。此重排的重组酶基因因rag(recombination activating gene)共有共有两个，分别产生蛋白质两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段目录目录免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程目录目录三、转座重组三、转座重组可使基因移位可使基因移位 由插入序列和转座子介导的基因移位或重由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为排称为转座转座(transposition)。大多数基因在基因组内的位置是固定的，大多数基因在基因组
37、内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的置。这些可移动的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和转座子。列和转座子。目录目录 插入序列插入序列(insertion sequences,IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列序列 特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因目录目录 转座子转座子(transposons)可从一个染色体可从
38、一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座 转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因目录目录由转座子介导的转座由转座子介导的转座目录目录四、原核细胞可通过接合、转化和转导四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组进行基因转移或重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转从一个细胞（细
39、菌）转移至另一细胞（细菌）的移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为接接合作用合作用(conjugation)。目录目录 可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。质粒质粒目录目录（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外通过自动获取或人为地供给外源源DNA，使细胞或培养的受体细胞，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为获得新的遗传表型，称为转化作用转化作用(transformation)。目录目录例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。目录目录
40、（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移转移及基因重组即为及基因重组即为转导作用转导作用(transduction)。目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)目录目录第二节第二节 重组重组DNA技术技术Recombinant DNA Technology目录目录重组重组DNA技术的发展史技术的
41、发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克
42、隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录目录重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。DNA克隆克隆目录目录 技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)（即（即DNA 克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）目录目录其主要过程包括：在体外将目的其主要过程包括：在体外将目的DNA片段片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，与能自主复制
43、的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。重组重组DNA技术，又称分子克隆（技术，又称分子克隆（molecular cloning）或）或DNA克隆（克隆（DNA cloning）或基因工）或基因工程（程（genetic engineering）技术）技术目录目录 目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）目录目录一、重组一、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常
44、用的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；分子或片段
45、连接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比活探针；活探针；DNA序列分析；序列分析；填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转
46、移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目录目录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是一类核酸内切酶，能识别双链是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子分子内部的特异序列内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。并裂解磷酸二酯键。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定义：定义：目录目录与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源
47、系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：分类：作用：作用：目录目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目录目录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(p
48、alindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目录目录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口目录目录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端伍末端(compatible end)。GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GAT
49、CT A 同尾酶同尾酶目录目录来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶同裂酶或同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同裂酶：同裂酶：名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AG
50、CTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制
