1、S M A R T 技术 1ppt课件背景介绍l真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。l但是由于cDNA的5端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。2ppt课件技术历程l常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头
2、序列进行扩增。l但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。3ppt课件lSMART(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript(SMART)技术的出现是一个新的里程碑。l原理：在合成cDNA的反应中事先加入的3末端带Oligo（dG）的SMART引物，
3、由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。4ppt课件
4、l这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。5ppt课件几个采用SMART技术的产品（Clontech）lSMART PCR cDNA Synthesis Kit lSMART cDNA Library Construction Kit
5、lSMART RACE cDNA Amplification Kit lCreator SMART cDNA Library Construction Kit lAltas SMART Probe Amplification Kit lSuper SMART PCR cDNA Synthesis Kit6ppt课件SMART PCR cDNA Synthesis Kit l功能：l由ng级的RNA的到高质量的cDNA文库l选择性得到新的带5端的全长cDNAl用LD连接介导的PCR产生全长cDNAl可与CreatorTM 表达系统配套使用l这个试剂盒是采用SMART技术将少至25ng的mRNA或
6、者50ng的Total RNA制备成可大量扩增的cDNA。7ppt课件l试剂盒提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一链Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和纯化cDNA用的纯化柱和对照RNA在内的试剂。l首先利用专利的SMARTTM寡聚核苷酸合成第一链，再利用LD PCR技术生产高质量的全长cDNA双链。比较传统的Gubler&Hoffman cDNA合成法，SMART技术能得到更高比例的全长克隆，得到完整的mRNA 5端非编码区。SMART PCR cDNA Synthesis Kit 8ppt课件SMART PCR cDNA
7、Synthesis Kitl在SMART技术中，第一链合成一个经修饰oligo(dT)引物-CDS II primer(Sfi IB),而SMART II 寡核苷酸(Sfi IA)作为mRNA 5端延伸出去的模版。当反转录到达mRNA 5端时，反转录酶跳移并继续反转录至SMART II寡核苷酸的末端，这种跳移常常发生在真核生物mRNA的帽子结构-m7G。这样反转录出的cDNA包含mRNA完整的5端以及SMART III寡核苷酸互补序列，而SMART II 寡核苷酸用作接下来扩增反应的引物，只有含有全长mRNA和SMART II 寡核苷酸的序列才能在PCR反应中扩增出来。l合成过程见下页图片9p
8、pt课件SMART PCR cDNA Synthesis Kit10ppt课件SMART PCR cDNA Synthesis KitlCDS II引物是含有经过修饰的Oligo（dT）的起始引物，能特异结合在mRNA加Poly A的位置，避免结果有过长的Poly A影响后继的测序或者PCR反应，同时也可以作为PCR的3引物。l合成的cDNA可以直接进行对数扩增或者线性扩增，可以作为定量PCR的模板，也可以直接用于Clontech的抑制性消减杂交，构建cDNA文库或者做反向Northern杂交（Virtual Northern Blot），还有用于芯片检测的cDNA探针制备。11ppt课件SM
9、ART cDNA Library Construction Kit l常规建库方法缺陷：l常规的建库需要在合成的cDNA双链两端通过连接加上相同或者不同的adaptor，用相应的酶切后可以插入载体中。由于连接效率低往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的代表性。l在做表达文库时，如果cDNA的两端是同一个酶切位点，由于cDNA可能按两个不同的方向接入载体，反向接入载体的那些cDNA不能正确表达，因而有50%的可能丢失。然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶切是否完全的问题，影响产率。l另外由于表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框
10、架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。12ppt课件SMART cDNA Library Construction Kitl 利用SMART技术建库，可以得到全长的cDNA文库，也不需要Adaptor的连接。l这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同，分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。lSfiI是一个在真核生物基因组中极为稀少的酶，出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。SfiI识别序列为GGCCNNNNNGGCC
11、，中间的5个碱基为任意序列。因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。l这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切，得到的是两端的粘端不同的cDNA，这样就可以定向插入特定的载体中，不会浪费50%的信息。13ppt课件l这个试剂盒提供的载体也很有特色：双链cDNA与噬菌体载体lambda Triplex2 的左右臂连接后再与包装蛋白进行包装反应，进而侵染大肠杆菌形成cDNA文库。llambda Triplex2载体即具有噬菌体载体的优点-高滴度文库，蓝白斑筛选，表达量的调节，又可以通过简单的方法质粒化后进行亚克隆。l该载体的特点：1能极其容易的质粒化2多克隆位点上游包含两个翻译起始位点和（dT）13slip，这种特殊设计可用3个不同的表达框架分别同时表达一段插入的DNA。这样就保证插入的片断的正确的表达产物能被筛选出来而不会漏掉。SMART cDNA Library Construction Kit14ppt课件15ppt课件
