1、1.2 微生物的培微生物的培养技术及应用养技术及应用微生物的选择培养和计数选择培养基类型适用范围操作方法灭菌强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160170 加热23h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121,1530 min选择培养基类型适用范围操作方法消毒较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100 煮沸56 min巴氏消毒法不耐高温的液体626
2、5 煮30 min或80-90 煮30s-1 min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30 min接种室、接种箱，超净工作台选择培养基学习目标核心素养1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。2概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。1.生命观念：各类微生物都能适应其生活环境。2科学思维：根据微生物的代谢类型配制选择培养基。3科学探究：讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法。思考：如何从自然界中分离出生产所需要的特定微生物？选择培养基 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，
3、尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群该怎么办呢？选择培养基应运而生。选择培养基 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。1.实例：聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。寻找耐高温的DNA聚合酶 筛选原因：水生栖热菌能在70-80高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。美国黄石公园选择培养基2.概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养
4、基称为选择培养基。选择培养基根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原则：耐寒微生物石油分解菌被石油污染的土壤冰川冻土层3.原理：人为提供_ 的条件（包括_、_和_等），同时_。有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长营养温度pH选择培养基4.实验室中微生物的筛选：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养型微生物加高浓度食盐金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物不加含碳有机物的无碳培养基不加氮源的无氮培养基加入青霉素的培养基思考：那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？选择培养基思考讨论：选择培养基配方的设计 尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的
5、农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。尿素的立体结构 土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3选择培养基尿素的立体结构1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。选择培养基2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定
6、容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml配方一：培养细菌配方二：培养可以分解尿素的细菌（1）从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？固体培养基。配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基选择培养基2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1
7、000ml配方一：培养细菌配方二：培养可以分解尿素的细菌（2）此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？成分：碳源、氮源、水、无机盐选择培养基进一步思考：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。项目选择培养基鉴别培养基原理加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应用途培养、分离出目标微生物鉴别目标微
8、生物举例培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽)尿素分解菌大肠杆菌选择培养基选择培养基拓展应用1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养创造无氧环境进行培养选择培养基2.地球上的
9、植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。请回答下列问题。选择培养基（1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌
10、？为什么？（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。微生物的数量测定 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照 方法1：稀释涂布平板法间接计数法微生物的数量测定选择30-300个菌落的平板进
11、行计数；每个稀释度至少取3个平板取其平均值；统计的菌落往往比活菌的实际数目低；统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。计数原则:因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。微生物的数量测定M：代表稀释倍数；C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)每g样品中的菌落数(CV)M例1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积
12、为0.1mL)()A.2.34108 B.2.34109 C.234 D.23.4 B 计算公式：方法1：稀释涂布平板法间接计数法微生物的数量测定 某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学_；原因是_。2.乙同学_；原因是_。实验操作不合理未设置重复实验组结果计算不合理21与另外两组数值相差太
13、大，应舍去微生物的数量测定血细胞计数板：细菌计数板：缺点：不能区分死菌和活菌偏大不适于对运动细菌的计数。个体小的细菌在显微镜下难以观察。优点：快速、直观常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数对细菌等较小的细胞进行观察和计数；方法2：显微镜直接计数法直接计数法微生物的数量测定内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点不能区分死菌与活菌操作较复杂且有一定误差计算公式每毫升原液含菌株数4001 000每小格平均菌株数稀释倍数每毫升原液含菌株数平均菌落数/所用涂布液体积稀释倍数3.比较直接计数法与间
14、接计数法微生物的数量测定微生物的数量测定间接计数法 稀释涂布平板法直接计数 计数板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备实验设计（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察实验设计【课堂小结】微生物的数量测定 1.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是()A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照C.该实验应采用稀释涂布平板法D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红B微生物的数量
15、测定 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是()A.菌落中的细菌数目是固定的 B.平板上的一个菌落就是一个细菌 C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D稀释涂布平板法1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。注意：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。稀释涂布平板法系列梯度稀释涂布平板稀释
16、涂布平板法1.方法：由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行_，然后再将菌液_到制备好的_上。充分稀释涂布选择培养基稀释涂布平板法2.基本操作：和 。梯度稀释涂布平板稀释涂布平板法提出问题:（1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数稀释涂布平板法基础知识:绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_的微生物才能分解尿素，利用_的_培养基，可以从土壤中分离出_的细菌。脲酶以尿素作为唯一氮源选择分解尿素CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2组分含量KH2PO41.4gN
17、a2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0gH2O定容至1000mL常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。稀释涂布平板法（1）土壤取样（2）配制培养基（3）样品的稀释与涂布平板（4）微生物的培养与观察取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤取样过程：铲去表土（一般3cm左右）注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。选择培养基*以尿素为唯一氮源完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用实验过程:稀释涂布平板法90mL无菌水 梯度稀释（3）样品的稀释与涂布平板稀释
18、涂布平板法 涂布平板注意：各浓度分别涂布3个平板及空白平板 （重复实验）（对照实验）（3）样品的稀释与涂布平板稀释涂布平板法（3）样品的稀释与涂布平板选择培养基（平行重复）牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)稀释涂布平板法（4）微生物的培养与观察培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。*细菌一般在30-37的温度下,恒温培养箱中培养1-2d（平板倒置）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取数目稳定时的记录作为结果。*防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对
19、照细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。稀释涂布平板法操作提示:1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。微生物的选择培养1.结合对照组，分析培养物中
20、是否有杂菌污染及选择培养基是否筛选出一些菌落。如果没有接种的选择培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的基础培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。结果分析与评价微生物的选择培养2.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。结果分析与评价微生物的选择培养结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。你是否获得了某一稀释度下菌落数
21、为30300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近?如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。如果得到了两个或多个菌落数为30300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。微生物的选择培养你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少?与其他同学统计的结果接近吗?如果差异很大，可能是什么原因引起的?如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。微生物的选择培养 本活动只是
22、初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2方法：在培养基中加入酚红指示剂呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。鉴别培养基液体培养基可以直接看液体的变色情况；固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。进一步探究微生物的选择培养主要方法稀释涂布平板法平板划线法主要步骤系列梯度稀释操作和涂布平板操作接种环在固体培养基表面连续划线接种工具涂布器接种环菌体获取从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体能否用于计数可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平
23、板不能计数共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。稀释涂布平板法微生物的培养培养基无菌技术消毒与灭菌常用灭菌方法课堂小结选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法稀释涂布平板法的操作过程微生物的选择培养 1.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。请据图分析，下列说法错误的是()AA.号试管的稀释倍数为103B.号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能为号试管的10倍C.号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7109D.将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后，再进行涂布谢 谢 观 看
