1、第2章 细胞工程 第2节 动物细胞工程二 动物细胞融合技术与单克隆抗体动物细胞融合技术1.概念 使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。红色荧光染料标记膜蛋白绿色荧光染料标记膜蛋白人细胞小鼠细胞细胞融合3740min2.原理细胞膜具有一定的流动性3.结果 融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。融合后的细胞类型：A B AA AB BB4.融合方法PEGPEG融合法、融合法、电融合法电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法。物理方法化学方法生物方法生物方法：灭活病毒诱导法灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一
2、些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片5.融合完成的标志两个或多个细胞核融合为一个细胞核两个或多个细胞核融合为一个细胞核6.意义突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。7.应用研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造
3、单克隆抗体开辟了新途径。比较：植物体细胞杂交技术和动物细胞融合原理步骤诱导方法结果项目项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原理细胞膜的流动性和植物细胞的全能性细胞膜的流动性步骤用纤维素酶和果胶酶去掉细胞壁后，诱导原生质体融合，形成杂种体细胞，再经过植物组织培养形成杂种植株利用胰蛋白酶分散成单个细胞后诱导细胞融合诱导方法物理方法、化学方法物理方法、化学方法、灭活病毒结果形成杂种植株形成杂种细胞单克隆抗体及其应用1克隆不同层次的含义克隆具体是指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。如果克隆当动词用，就表示整个无性繁殖的过程。在生物学
4、中克隆有4个不同层次的含义。分子水平：如DNA复制。细胞水平：如动物细胞培养。器官水平：如利用细胞培育出新器官。个体水平：如克隆动物。单克隆抗体及其应用1.定义：机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。2.抗体的分布：（1）血清（主要）（2）组织液及外分泌液（如乳汁中，为新生儿提供抗体）1.传统抗体的获得注射（1）方法向动物体反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体（2）缺点产量低、纯度低，特异性差科学家发现哺乳动物感染病毒相应的B淋巴细胞抗体抑制病原体增殖形成特异性结合病原体超过百万种每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体要想获得大量的单一
5、抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。但是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：解决抗体骨髓瘤细胞能在体外大量增殖B淋巴细胞产生专一抗体杂交瘤细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体2.单克隆抗体制备过程注射抗原培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合多种杂交细胞诱导融合用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞一共有5中类型：B，瘤，BB,瘤瘤，B瘤注射抗原培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合多种杂交细胞诱导融合用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定
6、抗体的B淋巴细胞用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长杂交瘤细胞第一次筛选 1DNA的合成有D途径和S途径两种途径，其中D途径是在 叶酸的辅助下，由氨基酸等小分子合成核苷酸；S途径是利用酶，催化次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）生成相应的核苷酸。2已知氨基蝶呤（A）是叶酸的拮抗物；实验所用的骨髓瘤细胞缺乏S途径中的酶。B淋巴细胞骨髓瘤细胞（A）合成DNAD途径S途径D途径氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3骨髓瘤细骨髓瘤细胞胞自身融合自身融合B B细胞自细胞自身融合身融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞 1
7、 13 32 2未融合未融合的的B B淋巴淋巴细胞细胞未融合未融合的骨髓的骨髓瘤细胞瘤细胞置于置于选择培养基选择培养基上培养上培养 2 2杂交瘤细胞杂交瘤细胞 1 13 3第一次筛选第一次筛选3 3种融合的细胞种融合的细胞目的：得到杂交瘤细胞方法：用特定的选择培养基进行筛选原理：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长注射抗原培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合多种杂交细胞诱导融合抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞多次的克隆化培养和抗体检测杂交瘤细胞（既能迅速大量增殖，又能产生抗
8、体）第二次筛选克隆化培养、抗体检测？多孔细胞培养板96孔板每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。检测原理？抗原抗体杂交技术克隆化培养克隆化培养专一抗体检专一抗体检验阳性验阳性1 11 1第二次筛选原理：抗原-抗体特异性结合2 21 13 3多种杂交多种杂交瘤细胞瘤细胞阳性细胞阳性细胞目的：得到能分泌所需
9、抗体的杂交瘤细胞方法：克隆化培养和抗体检测注射到腹腔抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养多次的克隆化培养和抗体检测体外大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖从培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体杂交瘤细胞单克隆抗体大量培养杂交瘤细胞的方法总结单克隆抗体相关工程动物细胞培养，动物细胞融合原理细胞增殖，细胞膜具有一定的流动性杂交瘤细胞特点既能迅速大量繁殖，又能产生抗体单克隆抗体的优点与特定抗原发生特异性结合，并且大量制备单克隆抗体的应用1.优点a.能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合b.可以大量制备2.应用a.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”在受精后不久，胎盘滋
10、养层细胞就会分泌在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素人绒毛膜促性腺激素(HCG)(HCG)，是由受孕妇女，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。液中几乎不含有。抗抗（人绒毛膜促性腺激素）（人绒毛膜促性腺激素）单克隆单克隆抗体抗体b.可以运载药物抗体药物接头细胞凋亡ADC被细胞吞噬抗体-药物偶联物（ADC)通过将细胞毒素与特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体，接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。c.利
11、用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤，心血管畸形等疾病d.单克隆抗体自身用于治疗疾病一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株练习与应用C2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体练习与应用A练习与应用二、拓展应用假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。
