1、第第2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序（第（第3课时）课时）第3章 基因工程新课引入新课引入1基因工程的四个操作步骤是什么？（1）目的基因的筛选与获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。2获取目的基因的方法有哪些？PCR获取和扩增目的基因、基因文库、人工合成。3基因表达载体需要具备哪些成分？目的基因、标记基因、启动子、终止子。新课引入新课引入4导入不同的受体细胞采用的方法分别是什么？（1）植物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法（2）动物细胞：显微注射法（3）原核生物细胞：Ca2+处理法5目的基因的检测和鉴定有哪些水平？（1）分子
2、水平检测：DNA和mRNA用PCR等技术、蛋白质用抗原-抗体杂交（2）个体生物学水平的鉴定一、实验原理一、实验原理 阅读教材84页前两段的内容，了解PCR和电泳鉴定的基本原理。学生活动 基因工程的操作是DNA水平，那如何对DNA片段进行扩增和鉴定呢？一、实验原理一、实验原理1DNA片断的扩增 （1）PCR可以在体外进行DNA片断的扩增。（2）PCR利用了DNA的热变性原理，可以调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。注意：复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量。（3）PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次
3、PCR一般要经过30次循环。一、实验原理一、实验原理2DNA片段的电泳鉴定 （1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH条件下，这些基团可以带上正电荷和负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。DNA分子的迁移速率与其大小成反比二、材料用具二、材料用具1试剂 可直接从公司购买，PCR反应体系的配方见教材或试剂盒的说明书。PCR试剂盒电泳缓冲液凝胶载样缓冲液
4、琼脂糖核酸染料二、材料用具二、材料用具2用具电泳装置制胶用的模具电泳槽连接线黑色阴极红色阳极一次性吸液枪头微量移液器微量离心管梳子二、材料用具二、材料用具2用具PCR仪微量移液器微量离心管推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度0.2 mL微量离心管吸液杆二、材料用具二、材料用具拓展1PCR中几种实验用具的作用名称作用PCR仪自动调控温度，实现DNA的扩增微量离心管 实际上是进行PCR反应的场所微量移液器 用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后，其上的枪头都必须更换三、方法步骤三、方法步骤 阅读教材8485页的方法步骤，按照“DNA片段的扩增”和“DNA片段的电泳鉴定”两个环节，尝
5、试以关键词的形式画出实验流程。学生活动三、方法步骤三、方法步骤1DNA片断的扩增准备移液离心反应（1）准备 按照PCR反应需要的物质和条件，将需要的试剂和仪器准备好。三、方法步骤三、方法步骤1DNA片断的扩增 （2）移液 用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书在微量离心管中依次加入各组分。三、方法步骤三、方法步骤拓展2微量移液器的使用方法容量设定吸液枪头安装预洗吸液枪头吸液放液卸取吸液枪头 吸液枪头安装：应采取旋转安装法，用力不能过猛。吸液：先向下按压推动杆，至第一停点，然后将吸液枪头垂直浸入液面，再平稳松开。三、方法步骤三、方法步骤微量移液器的使用方法 放液：将吸液枪头紧贴容器壁，先向下
6、按压推动杆，至第一停点，稍作停顿后再按至第二停点，确保吸液枪头内没有液体残留。注意：在使用过程中，不能超量程使用微量移液器。使用一次性屏蔽式吸液枪头有助于防止吸取的液体流入微量移液器，从而减少实验过程中的交叉污染。拓展2三、方法步骤三、方法步骤1DNA片断的扩增 （3）离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在离心管底部。三、方法步骤三、方法步骤 （4）反应 参照下表的参数设置，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94，5 min/30次94，30 s55，30 s72，1
7、 min最后1次94，1 min55，30 s72，1 min1DNA片断的扩增三、方法步骤三、方法步骤配置琼脂糖溶液制备凝胶加样电泳观察结果1DNA片断的扩增三、方法步骤三、方法步骤2DNA片断的电泳鉴定配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液 配 制 琼 脂 糖 溶 液（一 般 质 量 体 积 比 为0.8%1.2%）。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后加入适量的核酸染料混匀。三、方法步骤三、方法步骤 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过
8、凝胶1 mm为宜。制备凝胶2DNA片断的电泳鉴定加样三、方法步骤三、方法步骤 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物。2DNA片断的电泳鉴定三、方法步骤三、方法步骤 接通电源，设定电压（一般为15 V/cm），待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。电泳观察结果 在紫外灯下观察和照相，并与核酸分子量标准参照物比较被扩增产物的大小。2DNA片断的电泳鉴定四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1你是否成功扩增出DNA片段，判断的依据是什么？可通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度
9、来评价扩增的结果。2你进行电泳鉴定的结果是几条带，如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。一次成功的DNA片段扩增应产生与预期大小一致的DNA片段。若出现不一致的结果可能的原因两类。四、结果分析与评价四、结果分析与评价 2你进行电泳鉴定的结果是几条带，如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。（1）如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应组分，各反应组分的用量不当，PCR程序设置不当等。（2）扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好。四、结果分析与评价四、结果分析与评价 （1）将
10、凝胶放入电泳槽后，应确保加样孔内充满电泳缓冲液，且没有气泡，否则会影响加样。（2）DNA可发生两性解离，当电泳缓冲液的pH值大于其等电点时，DNA分子带负电；当电泳缓冲液的pH小于其等电点时，DNA分子带正电。一般使用的电泳缓冲液调pH为8，DNA分子带负电，向正极泳动。注意事项四、结果分析与评价四、结果分析与评价 （3）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。（4）该实验所需的材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。（5）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂，移液器的枪头都必须更换。（6）在进行
11、操作时一定要戴好一次性手套。注意事项课堂小结课堂小结实验原理实验用具实验步骤DNA片段的扩增电泳鉴定准备移液离心反应DNA片段的扩增电泳鉴定试剂用具配制琼脂糖溶液制备凝胶加样电泳观察结果1进行PCR反应的具体实验操作顺序应为（）（1）离心使反应液集中在试管底部（2）用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分（3）按配方准备好各组分 （4）进行PCR反应（5）设计好PCR反应的循环流程A（2）（3）（5）（4）（1）B（1）（5）（3）（2）（4）C（4）（2）（5）（3）（1）D（3）（2）（1）（5）（4）课堂检测课堂检测D 2在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶（R1和R2）处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是（）A该载体最可能为环形DNA分子B两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C限制酶R1与限制酶R2的酶切位点最短相距约200bpD限制酶切割会导致作用位点的氢键和肽键断裂课堂检测课堂检测D 再见再见
