1、20102010级本科分子生物学实验设计级本科分子生物学实验设计案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（
2、+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。阅读下列案例，根据要求回答问题并设计实验进一步明确诊断。阅读下列案例，根据要求回答问题并设计实验进一步明确诊断。一、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病 蚕豆病恶心、呕吐、面色苍白恶心、呕吐、面色苍白 皮肤及巩膜黄染皮肤及巩膜黄染 红细胞红细胞 1.981012/L 血红蛋白血红蛋白53g/L 血清总胆红素血清总胆红素85.5mol/L 尿蛋白（尿蛋白（+）尿胆红素尿胆红素()尿胆素原尿胆素原(+)尿液镜下未见红细胞尿液镜下未见红细胞 黄疸黄疸红细胞膜不完整，已破裂红细胞膜不完整，已破裂红细胞含量少红细胞
3、含量少含量明显增加含量明显增加血红蛋白量减少血红蛋白量减少排尿呈酱油样色排尿呈酱油样色游离胆红素增加游离胆红素增加溶血性黄疸溶血性黄疸蚕豆病蚕豆病肠肝循环增多肠肝循环增多蚕豆病简介n蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。易发人群n多见于儿童，男性患者约占90%以上。临床表现临床表现n早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛
4、加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于12日内死亡。二、设计实验进一步明确诊断 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定（紫外法）（一）实验器材和试剂1.实验器材 恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。2.试剂（1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（pH8.0）：称取Tris12.1g,MgCl26H2O 4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用HCl调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。（2）2 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)：称取NADP 21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4
5、 可保存20天左右。（3）6mmol/L葡萄糖6磷酸二钠(G6PNa2)：称取21.5mg G6PNa22H2O，溶于10mL蒸馏水中。4 可保存20天左右。（4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10%EDTA 2.0mL，6mmol/L NADP 0.4mL，加蒸馏水至总体积200mL。（5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g，加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶内避光保存，可保存20天。（6）0.9%NaCl，ACD抗凝剂。（二）实验操作流程n1、洗涤红细胞 取静脉血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝剂的试管中
6、，混匀。吸取0.2mL抗凝血放入试管中，加入4mL预冷的生理盐水，轻轻摇匀，2500r/min离心5min,倾去上清，重复三次。n2、溶血液的制备 向红细胞沉淀中加入溶血剂2.0mL，震荡1min，4放置10min以上。3、NADPH的测定 取石英比色杯两只，标为“测定”及“空白”，按下表操作：试剂体积蒸馏水（uL）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（uL）6mmol/L G6P-Na2(uL)2mmol/L NADP+(uL)2040300300300混匀后放入带恒温水循环（25）的紫外分光 光度计中，预热10min然后在“测定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入溶血剂
7、60uL，混匀以“空白”调“0”,1min后开始测340nm吸光度（A340），每2min纪录吸光度一次，至10min止，比较每2minA值的变化情况，若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（A340）计算NADPH的产量。4.溶血液中血红蛋白含量的测定 取试管一支，按下表操作：试剂体积Drabkin(mL)溶血液(mL)0.33.0混匀，室温放置15min，以Drabkin试剂调零，读取540nm的吸光度（A540）。（三）注意事项n1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。n2.测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。（四）结果分析n1.NADPH产量的计算 NADPH在340nm
8、处，其每微摩尔的吸光系数（）为6.220，故10min内NADPH的产量计算公式为：nNADPH产量（mol）=n2.血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处，其毫摩尔吸光细数（）为44，故溶血液中血红蛋白的含量计算公式为：n血红蛋白含量（mmol）=22.6340A44540A3.G6PD比活性（U/g Hb）的计算G6PD比活性单位（U/g Hb）=11645001000101004402.0110122.6540340AA85.49540340AA【参考范围】正常值：大于2.8U/gHb三、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 n红细胞膜的破坏红细胞膜的
9、破坏n胆色素代谢异常胆色素代谢异常 红细胞膜的破坏红细胞膜的破坏n葡萄糖磷酸戊糖途径葡萄糖磷酸戊糖途径葡萄糖葡萄糖 6 磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH+H+磷酸化磷酸化5 磷酸核糖磷酸核糖磷酸磷酸戊糖途径戊糖途径NADPH+H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH+H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH+H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH+H+NADPH维持维持GSH(谷胱甘肽）的正常含量和还原状态谷胱甘肽）的正常含量和还原状态G6PD(6 磷酸葡萄糖脱氢酶）磷酸葡萄糖脱氢酶）起关键作用起关键作用n还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性 红细胞膜的破坏红细胞膜
10、的破坏单核吞噬细胞识别吞噬血红蛋白珠蛋白氧化破坏红细胞氧化破坏红细胞单核吞噬细胞识别吞噬氧化破坏红细胞血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬氧化破坏红细胞珠蛋白血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬氧化破坏红细胞血红素血红素珠蛋白珠蛋白血红蛋白血红蛋白单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬氧化破坏氧化破坏红细胞红细胞 单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬血红蛋白血红蛋白珠蛋白珠蛋白氧化破坏氧化破坏红细胞红细胞氧化破坏氧化破坏红细胞红细胞单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬红细胞红细胞珠蛋白珠蛋白血红蛋白血红蛋白单核吞噬细单核吞噬细胞识别
11、吞噬胞识别吞噬红细胞红细胞血红素血红素珠蛋白珠蛋白血红蛋白血红蛋白单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬红细胞红细胞胆色素代谢异常胆色素代谢异常血红素血红素运送到肝运送到肝与血清蛋白结合与血清蛋白结合游离胆红素游离胆红素结合胆红素结合胆红素排出体外排出体外 进入肠道胆素原胆素原胆素胆素肠肝循环胆红素胆红素扩散进入组织扩散进入组织 组织黄染组织黄染 黄疸黄疸排尿呈酱油样色排尿呈酱油样色溶血性贫血溶血性贫血 面色苍白面色苍白说明n1720为一个版本n2231为另一个版本n 参考一下看哪个你比较容易理解然后就用哪个实验室检查检查项目检查值正常值红细胞 1.981012/L 4.05.01012/L
12、血红蛋白 53g/L 120160g/L血清总胆红素 85.5mol/L 3.417.1mol/L结合胆红素 13.7mol/L 总量的20%未结合胆红素 71.8mol/L 总量的80%G6PD磷酸戊糖途径NADPH磷酸戊糖维持谷胱甘肽的还原性核酸生物合成原料红细胞90%95%糖酵解通路 2.3二磷酸甘油酸旁路5%10%磷酸戊糖途径NADPH 唯一谷胱甘肽阻止氧化血红蛋白，从而保护红细胞膜的完整性，如若缺乏，此时的红细胞易于破裂 Hb 具有携氧能力MHb 高铁血红蛋白 Fe3+不具有携氧能力 NADPH高铁血红蛋白还原酶 GSHMHbHb胆红素铁卟啉类化合物的降解产物80%以上来自衰老红细胞
13、破坏所释放的血红蛋白的分解自由通过生物膜产生毒性作用血红蛋白珠蛋白AA再利用血红素胆红素胆红素分类项目项目游离胆红素游离胆红素结合胆红素结合胆红素别名别名间接胆红素血胆红素直接胆红素肝胆红素与葡萄糖醛酸结合与葡萄糖醛酸结合未结合结合与重氮试剂反应与重氮试剂反应慢或间接反应迅速直接反应水中溶解度水中溶解度小大经肾随尿排出经肾随尿排出不能能通透细胞膜对脑的通透细胞膜对脑的毒性作用毒性作用大无G6PD缺乏NADPH严重缺乏谷胱甘肽难以保持还原状态NADPH高铁血红蛋白还原酶活性低 红细胞膜完整性破坏红细胞裂解血红蛋白大量溢出胆红素生成量增加Hb大量氧化成MHb，Hb含量减少黄疸n皮肤，巩膜及黏膜等组
14、织黄染n恶心，呕吐n全身无力n面色苍白溶血性黄疸 由于红细胞的大量破坏，在单核吞噬细胞系统产生胆红素过多，超过了肝细胞的摄取，转化和排泄胆红素的能力，造成血液中未结合胆红素浓度显著增高所致。高未结合胆红素血症由于肝对胆红素的摄取，转化，排泄增多，过多的胆红素进入胆道系统，肠肝循环增多，使得 尿中的尿素原和尿胆素含量增多，粪胆素与粪胆原也增加。溶血性黄疸大量红细胞破裂血中未结合胆红素增加肠肝循环增多大量血红蛋白溢出尿蛋白（+）潜血(+)尿胆红素()尿胆素原(+)尿液镜下未见红细胞 恶心、呕吐、面色苍白 排尿呈酱油样色 粪胆素原项目检查值正常值体温3837.5脉搏150次/分80次/分呼吸40次/
15、分20次/分血压80/60mmHg120/90mmHg红细胞大量破裂四、要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答）基因结构分析法我组讨论认为：要想探讨该病发生的分子基础，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNA序列检测DNA序列测定方法直接法间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同双脱氧末端终止法（Sanger法）化学裂解法（Maxam-Gilbert法）DNA的自动化测序DNA序列测定方法DNA链的方向是链的方向是5 5 3 3 交替的交替的磷酸磷酸基团基团和戊和戊糖糖构成
16、了构成了DNA的骨架的骨架 (backbone)。（构成（构成DNA）OHOCH2OHOH脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)双脱氧末端终止法（双脱氧末端终止法（Sanger法）法）nSanger法是根据双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)在DNA合成过程中不能形成3,5-磷磷酸二酯键酸二酯键而导致链延伸终止的原理，利用四种ddNTP代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，结合高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对DNA序列进行分析。TAATCTGCAGGC35加入引物；32P-dATP,dGTP,dTTP；DNA聚合酶3TAAT
17、CTGCAGGC553primerddGTPddATPddTTPddCTPATTAGATTAGACGAATTAATTAGAATATTATTAGACGTATTAGACATTAGACGTCATTAGACGTCCATTAGACGTCCGATTAGATTAGACGAATTAATTAGAATTATTAGACGTATTAGACGTCATTAGACGTCCATATTAGAC聚丙烯酰胺凝胶电泳GATCGCCTGCAGATTA35ATTAGACGTCCG五、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）患者体型瘦小与该病症患者体型瘦小与该病症有有关关 蚕豆病是因为体内缺乏蚕豆病是因为体内缺乏G6PD，G6PD主
18、要影响主要影响体内的磷酸戊糖途径体内的磷酸戊糖途径 该途径主要生成两种重要的该途径主要生成两种重要的物质即物质即5-磷酸核糖磷酸核糖和和NADPH5-磷酸核糖影响：磷酸核糖影响：1：核酸的合成：核酸的合成 2：体内己糖和戊糖的代谢：体内己糖和戊糖的代谢 3：37碳原子糖类物质的相互转化碳原子糖类物质的相互转化NADPH影响：影响：1：体内以体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇 脂脂肪酸肪酸 和一些非必需氨基酸和一些非必需氨基酸2：NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化作用可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化作用3：NADPH参与吞噬细胞的
19、杀菌作用参与吞噬细胞的杀菌作用4：维持：维持GSH的正常水平的正常水平 GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化氧化 使蛋白质或酶处于活性状态使蛋白质或酶处于活性状态磷酸戊糖途径中生成多余的核糖转变为6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，G6PD缺乏使得糖代谢受到影响。脂酸可以合成甘油三酯，其主要功能是储存和氧化能量，机体难以合成甘油三酯则消耗原有储备的甘油三酯，使得机体消瘦。同时体内的一些生物活性物质功能发生障碍，如胆固醇不能直接氧化但能转化为胆汁酸，类固醇激素 维生素D3参与物质代谢调节，胆汁酸具有促进脂类消化和吸收的作用。维生素D3主要参与体内血钙和血磷的调节
20、。生物转化作用可以对体内大部分非营养物质尽心代谢转化，或使有毒物质的毒性减低或消除，增强这些非营养物质的水溶性和极性，从而易于从胆汁或尿液中排除。GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化 使蛋白质或酶处于活性状态，蛋白质一方面可以作为营养物质提供能量一方面又发挥着其它重要的生物功能，而酶使得生物体内的化学反应有条不紊的进行。41写在最后写在最后成功的基础在于好的学习习惯成功的基础在于好的学习习惯The foundation of success lies in good habits谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
