1、药代动力学实验药代动力学实验1.1.加深理解加深理解药代动力学实验中药代动力学实验中体内体内药物分析的药物分析的理论知识、定量分析方法及原理。理论知识、定量分析方法及原理。2.2.掌握血浆生物样本前处理方法。掌握血浆生物样本前处理方法。3.3.掌握高效液相色谱法（掌握高效液相色谱法（HPLCHPLC）的操作方法和）的操作方法和注意事项。注意事项。4.4.掌握标准曲线的制作方法及绘制注意事项。掌握标准曲线的制作方法及绘制注意事项。5.5.熟悉生物样本分析方法验证的流程。熟悉生物样本分析方法验证的流程。头孢呋辛酯在体内水解后释出头孢呋辛酯在体内水解后释出头孢呋辛头孢呋辛而发挥而发挥其抗菌活性其抗菌
2、活性。头孢呋辛酯脂溶性强，口服吸收良好，吸收后头孢呋辛酯脂溶性强，口服吸收良好，吸收后迅速在肠粘膜和门脉循环中被非特异性酯酶水迅速在肠粘膜和门脉循环中被非特异性酯酶水解为解为头孢呋辛头孢呋辛，因此，建立，因此，建立HPLCHPLC法测定血浆中法测定血浆中头孢呋辛的浓度。头孢呋辛的浓度。内标法内标法根据根据SFDASFDA对生物样本分析方法确证的指导原则，对生物样本分析方法确证的指导原则，对本方法的专属性、准确度、精密度及回收率、对本方法的专属性、准确度、精密度及回收率、线性和稳定性等指标进行了考察线性和稳定性等指标进行了考察本次实验主要考察本次实验主要考察线性线性和和准确度准确度一、溶液配制一
3、、溶液配制1、头孢呋辛标准储备液：、头孢呋辛标准储备液：精密称取头孢呋辛精密称取头孢呋辛10 mg，加入溶液，加入溶液10 mL（甲醇：水（甲醇：水=1:1）溶解，得）溶解，得头孢呋辛浓度为头孢呋辛浓度为1.0 mg/mL的储备液的储备液，放，放4冰箱储存冰箱储存。2、内标物标准液内标物标准液：精密称取对乙酰氨基酚精密称取对乙酰氨基酚15 mg，加入溶液，加入溶液10 mL（甲醇：（甲醇：水水=1:1）溶解，得浓度为）溶解，得浓度为1.5 mg/mL的储备液，放的储备液，放4冰冰箱储存。取对乙酰氨基酚储备液箱储存。取对乙酰氨基酚储备液100 L，加入溶液，加入溶液900 L（甲醇：水（甲醇：水
4、=1:1），得浓度为），得浓度为150 g/mL的内标液的内标液。按下表取不同体积头孢呋辛储备液于按下表取不同体积头孢呋辛储备液于EPEP管中，用稀释液溶液（甲管中，用稀释液溶液（甲醇：水醇：水=1=1：1 1）进行梯度稀释，制备一系列不同浓度的）进行梯度稀释，制备一系列不同浓度的标准工作液标准工作液（5000 L5000 L）。）。取取6 6份空白血浆（份空白血浆（80 L80 L），加入不同浓度的头孢呋辛），加入不同浓度的头孢呋辛标准工作液标准工作液20 L20 L，对乙酰氨基酚，对乙酰氨基酚内标液内标液（150 g/mL150 g/mL）10 L10 L，涡旋，涡旋10s10s混混匀。匀
5、。标准曲线血浆样本制备标准曲线血浆样本制备按照以下表格制备低、中、高三个浓度的质控标按照以下表格制备低、中、高三个浓度的质控标准液。取不同浓度的质控标准液准液。取不同浓度的质控标准液20 L20 L，分别加，分别加入入80 L80 L空白血浆中，加入乙酰氨基酚内标液空白血浆中，加入乙酰氨基酚内标液（150 g/mL150 g/mL）10 L10 L，涡旋，涡旋10s10s混匀。混匀。每个浓度每个浓度制备两份质控样本。制备两份质控样本。质控血浆样本制备质控血浆样本制备（1 1）待测样本（标准曲线和质控血浆样本）涡旋）待测样本（标准曲线和质控血浆样本）涡旋10 s10 s，加入加入甲醇甲醇300
6、L300 L，涡旋，涡旋1min1min，静置，静置3 min3 min。（2 2）12000 rpm12000 rpm离心离心5 min5 min，取上清液，取上清液200 L200 L常温真常温真空干燥空干燥1212小时。小时。（3 3）待溶剂挥干后，加入）待溶剂挥干后，加入100 L100 L甲醇水溶液甲醇水溶液（水：（水：甲醇甲醇 = 8= 8：2 2）溶解，涡旋）溶解，涡旋1min1min，12000 rpm12000 rpm离心离心5 5 minmin。（4 4）取）取上清液上清液60 L60 L至有内称管的进样瓶（需检查内至有内称管的进样瓶（需检查内称管底部是否有气泡，否则底部有
7、气泡影响进样，称管底部是否有气泡，否则底部有气泡影响进样，有气泡需甩一下），进样有气泡需甩一下），进样20 L20 L。血浆样本预处理血浆样本预处理 流动相：流动相：0.05M0.05M磷酸二氢钾：甲醇梯度洗脱，磷酸二氢钾：甲醇梯度洗脱，设置如下：设置如下： 检测波长：检测波长：271 nm 271 nm 结果记录结果记录：1.1.分别分别记录记录各各浓度浓度标准标准样品及内标样品及内标峰峰的的面积。面积。2.2.绘制标准曲线。绘制标准曲线。3.3.数据处理：完成数据处理：完成计算获得标准曲线和质控样计算获得标准曲线和质控样本的相应数据。本的相应数据。注意有机溶剂的安全使用。注意有机溶剂的安全
8、使用。注意注意对对EPEP管进行编号管进行编号，避免不同浓度的样品混，避免不同浓度的样品混淆。淆。操作过程中，注意操作过程中，注意枪头的更换枪头的更换，避免样品之间，避免样品之间的污染。的污染。高效液相色谱仪的使用：高效液相色谱仪的使用：详见教材详见教材需注意标准曲线的作图规范性。需注意标准曲线的作图规范性。2017.5.162017.5.16生物药剂学与药代动力学实验李嘉丽药物代谢与药动学实验室1. 掌握家兔静脉注射和灌胃口服的给药方法。2. 掌握样本的采集、处理方法。3. 加深理解药代动力学研究采血时间点设计原则和给药剂量的选择原则。 头孢呋辛酯药代动力学特征 头孢呋辛酯是头孢呋辛的乙酰乙
9、酯，是前体药。头孢呋辛酯化后增加了分子的脂溶性，可供口服。口服给药后，头孢呋辛酯被胃肠道吸收，并迅速被肠粘膜和血液中的非特异性酯酶水解，释放出头孢呋辛进入体循环。 健康成人空腹单次口服头孢呋辛酯0.5 g0.5 g后，头孢呋辛约2 h2 h血浆药物浓度达到峰值，其浓度约为4 4 gg/ml/ml，消除半衰期约为1.21.6 h1.21.6 h左右。预实验，家兔给药1 h左右达到峰值。 头孢呋辛钠药代动力学特征 头孢呋辛钠在胃肠道吸收不佳，故临床常采用肌肉注射、静脉注射或静脉滴注的方式给药。给药后头孢呋辛在体内分布良好，可分布至全身细胞外液，其消除半衰期（t1/2）为1.11.5 h，血浆蛋白结
10、合率约为33%。血清蛋白结合率约为50%。 药代动力学研究采血时间点设计原则 为获得给药后的一个完整的血药浓度- -时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和消除相。一般在吸收相至少需要2323个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（C Cmaxmax）；在C Cmaxmax附近至少需要3 3个采样点；消除相需要4646个采样点。整个采样时间至少应持续到3535个半衰期，或持续到血药浓度为C Cmaxmax的1/101/201/101/20。 给药途径与给药剂量的选择原则 所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致，也要兼顾药效学研究和毒
11、理研究的给药途径。 动物体内药代动力学研究应设置至少三个剂量组，不同物种之间可根据体表面积或药物暴露量进行剂量换算。成人临床推荐剂量500 mg/500 mg/日 家兔给药剂量=500500* *0.07/1.5=23 mg/kg0.07/1.5=23 mg/kg实验动物的选择原则 一般采用成年和健康的动物。常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬、小型猪和猴等。动物选择的一般原则如下：1. 首选动物：在考虑与人体药代动力学性质相关性的前提下，尽可能选择与毒理学和药效学研究相同的动物。2. 尽量在动物清醒状态下进行试验，最好从同一动物多次采样获取药代动力学参数。3. 创新性药物应选用两种或两种以上的
12、动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物（如犬、小型猪或猴等）。其他药物，可选用一种动物，建议首选非啮齿类动物。在动物选择上，建议采用体外模型比较动物与人代谢的种属差异性，包括代谢反应类型的差异和代谢产物种类及量的差异。通过比较，选取与人代谢性质相近的动物进行非临床药代评价；同时尽可能明确药物代谢的研究对象（如：原形药物、原形药物与代谢产物、或几个代谢产物同时作为药代动力学研究观察的对象）。4.经口给药不宜选用兔等食草类动物。本实验仍选择家兔作为实验动物的原因是：温顺、体型较大便于操作。1. 药液配制(已配制）（1）头孢呋辛酯灌胃液2.5 mg/mL头孢呋辛酯灌胃液：取头孢呋辛酯片 (
13、0.25 g/片)2片置于研钵中，研成粉末，全部转移至烧杯中，加入200 mL水，在磁力搅拌器搅拌状态下，按25 mg/kg体重（即10 mL/kg，灌胃液体积（mL）/动物体重（kg）量取药液。该浓度药液适用于25 mg/kg剂量组灌胃给药。（2）头孢呋辛钠注射液 12.5 mg/mL头孢呋辛钠注射液：取注射用头孢呋辛钠粉针1瓶（1.5 g/瓶），用120 mL生理盐水溶解并全部转移至烧杯中，按25 mg/kg体重（即2 mL/kg，注射液体积（mL）/动物体重（kg）量取药液。该浓度药液适用于25 mg/kg剂量组注射给药。2. 动物实验（1）抓持（2）编号（3）称重（4）动脉留置针的放置
14、（5）给药与血样采集（6）血液样本处理给药与血样采集给药途径给药部位药物药量采血时间i.v.耳缘静脉缓慢注射头孢呋辛钠溶液25 mg/kg0 min、5 min、10 min、 15 min、30 min、45 min、1.00 h、1.50 h、2.00 h、3.00 h、5.00 hp.o.灌胃口服头孢呋辛酯溶液各时间点于留置针取血，每次约0.5 mL0.5 mL，每次取血需更换注射器。每次取完用适量肝素（0.2 mL0.2 mL）以防留置针管凝固，但下次取血时需回推两次。注意：对EPEP管进行编号。 耳缘静脉给药将家兔置于固定箱内；兔耳剃毛，使血管显露；以手捏在耳根部压住静脉，使其充血；
15、将头皮针穿刺入血管；缓慢注入药液，勿将药物注入留置针中。 灌胃给药将免置于固定箱内；另一只手开口器插入兔口，而后翻转几下，使兔舌伸直并固定之；另一人将导尿管从开口器中央孔插入口内，再慢慢插入食管和胃，深15 18 cm15 18 cm。插管时感觉顺利，动物不挣扎也无呼吸困难出现，表示导尿管在胃内，为慎重起见，将导尿管外端插入水中，如有气泡吹出，表示已误入气管内，应拔出重插，如未见气泡出现即证实在胃内；将药液注入。3. 血液样本预处理（1）将血液样本置于肝素化试管中；（2） 15000 rpm离心5 min分离出血浆，将分离出的全部血浆分两份放入新EP管中保存，其中一份100 ul，余下的血浆放
16、入另一EP管中，-20 避光保存至测定。 注意：对EP管进行编号。1. 分组，A-G组做静注、H-N组做灌胃；2. 给药后需更换手套，以防污染血样；3. 注意对三套EP管进行编号，避免不同时间点的样品混淆；4. 第一套EP管要用肝素化管（已分发）；5. 记好采血时间，组内成员注意分工；6. 每次取血要更换注射器，取完血用适量肝素以防留置针管凝固，每次取完用适量肝素（0.2 mL）以防留置针管凝固，但下次取血时需回推两次；7. 药物稳定性较差，取血后适时离心分离血浆放冰箱；8. 注意注射器使用的安全；9. 注意动物实验操作的安全；10. 注射器使用后需套上针帽并与针管分离分别放到锐器箱中，勿丢弃
17、于垃圾桶；11. 实验结束处死兔子。2017.5.272017.5.27药代动力学实验李嘉丽药物代谢与药动学实验室1. 掌握血浆生物样本前处理方法。2. 掌握高效液相色谱法（HPLC）的操作方法和注意事项。3. 加深理解如何保证生物样本分析结果的可靠性、重现性。 生物样品分析质量的保证 应在生物样品分析方法验证完成之后开始测试未知样品。每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。药代动力学比较试验中，来自同一个体的生物样品最好在同一分析批中测定。 每个分析批应建立标准曲线，随行测定高、中、低3 3个浓度的质控样品，每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目
18、较多时，应增加各浓度质控样品数，使质控样品数大于未知样品总数的5%5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%15%，最多允许1/31/3质控样品的结果超限，但不能在同一浓度中出现。 浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白基质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，在达到Cmax以前取样的样品应以零值计算，在达到Cmax以后取样的样品应以无法定量（Not detectable, ND）计算，以减小零值对AUC计算的影响。1. 溶液配制(已配制） 精密称取对乙酰氨基酚15 mg，加入溶液10 mL（甲醇：水=1:1）溶解，得浓度为1.5 mg/mL的储备液，放4冰箱
19、储存。取对乙酰氨基酚储备液100 L，加入溶液900 L（甲醇：水=1:1），得浓度为150 g/mL的内标液。2. 血浆样本预处理（1）待血样（100 L） 完全解冻后，加入乙酰氨基酚内标液（150 g/mL）10 L，涡旋10s混匀。（2）加入甲醇300 L，涡旋1min，静置3 min。（3）12000 rpm离心5 min，取上清液200 L常温真空干燥12小时。（4）待溶剂挥干后，加入100 L甲醇水溶液（水：甲醇 = 8：2）溶解，涡旋1min，12000 rpm离心5 min。（5）取上清液60 L至有内趁管的进样瓶（需检查内趁管底部是否有气泡，否则底部有气泡影响进样，有气泡需甩
20、一下），进样20 L。实验重复性及准确性最差的环节，影响实验结果好坏的最重要的因素，是决定性的步骤。3. 色谱条件 流动相：0.05M磷酸二氢钾：甲醇梯度洗脱，设置如下：检测波长：271 nm 时间（min）0.05M 磷酸二氢钾：甲醇0-690:106-1275:2512-1590:104. 数据记录与参数计算（1）分别记录各时间点待测物及内标峰的面积。（2）将其代入标准曲线中（实验一）计算浓度。（3）参数计算：采用非房室模型计算主要的药代动力学参数，参见实验四。1. 注意有机溶剂（甲醇）的安全使用。2. 血样从冰箱取出后须充分解冻再进行实验，以免药物分布不均匀。3.仔细核对时间点，注意对E
21、P管进行编号，避免不同时间点的样品混淆。4. 由于加入的内标体积小（仅10 L），需加到液面以下并每次更换枪头，避免样品之间的污染。空白样本不加内标。5. 真空干燥箱的规范使用：箱门关上，并关闭放气阀，开启真空阀，接通真空泵电源开始抽气；使用结束，应先关闭真空阀，再关闭真空泵电源，最后开启放气阀。6. 紫外检测器是双波长检测的，请确认是271 nm波长检测的数据方可拷贝。7. 数据拷贝时间：下下周二（6月6日）下午8. 在Excel表中进行相关参数计算，并将原始数据及该Excel文件于下下周六（6月10日）前由班长或学委统一发送至 （钟老师）（李老师）单个文件命名方式“动物实验时间+组号”比如“20170516A”
