1、生物工业下游技术全册配套生物工业下游技术全册配套完整课件完整课件3生物工业下游加工技术“意志、工作、成功，是人生的三大要素。意志、工作、成功，是人生的三大要素。意志将为你打开事业的大门；工作是入室意志将为你打开事业的大门；工作是入室的路径；这条路径的尽头，有个成功来庆的路径；这条路径的尽头，有个成功来庆贺你努力的结果贺你努力的结果巴斯德（微生物工程巴斯德（微生物工程学之父）学之父） 关于本门课程的几点说明（1） 李刚，主要研究酶在生物修复和生物能源中的应用。 硕士生招生方向：分子酶学与酶工程，宏基因组与宏转录组。 联系方式： Tel:（o）84110296； Email: 南校区生命科学学院北
2、院310室 讲课内容安排： 讲授16次课程，复习答疑1次，第18周考试（闭卷考试）。关于本门课程的几点说明（2） 希望达到的特点： 1、内容讲解尽可能生动、通俗； 2、幻灯片中尽可能多增加一些图片和故事，便于同学们理 解课程内容和增加兴趣； 3、传道、授业、解惑； 4、加强和同学之间的互动加强和同学之间的互动；（思考题,课后交流，邮件交 流） 5、音乐教学方式。每周上课前会用每周上课前会用3-53-5分钟左右的时间播放分钟左右的时间播放 一首音乐一首音乐，主要是使同学们充分放松、调整好自己的听 课状态，提高上课效果。 个人关于本科教学的看法 心有多大，舞台就有多大！ 没有最好，只有更好！ 每年
3、对教学课件都要进行更新，以反映生物工业下游技术的最新进展！对同学们的几点要求 1、希望同学们多提好的建议； 2、勤学好问； 3、不要缺席，营造一种良好的课堂气氛。 4、我不会每次课都点名，但可能会随机点 名。如果累积点名不到3次，平时成绩会 受到很大影响； 5、No Pains, No Gains!你怎么对待本门课程的，考试成绩就会怎么对待你！一位往届同学的学习经验 她成功的一个重要经验就是：每次课后都把老每次课后都把老师讲过的内容总结到一张纸上，融会贯通。师讲过的内容总结到一张纸上，融会贯通。 其实她的成功经验是很简单的，但又是很难复制的，因为真正有毅力的同学太少了！主要参考书 （1）生物工
4、业下游技术，毛忠贵主编，中国轻工业出版社。 （2）生物工程下游技术实验手册，柯德森主编，科学出版社。考试形式 闭卷考试。 平时成绩占20，考试成绩占80。 平时成绩：取决于点名情况、课堂表现和课后作业。第一章 绪 论 生物工业生物工业：也称生物炼制和生物制造，以生物活体作为反应器进行物质和能源等生产，也可扩展到工业化的生物设计与繁殖等。 生物工程生物工程：一般认为是以生物学生物学(特别是其中的微生物学、遗传学、生物化学和细胞学)的理论理论和技术为基础，结合化工、机械、电子计算机等现结合化工、机械、电子计算机等现代工程技术代工程技术，充分运用分子生物学的最新成就，自觉地操纵遗传物质，定向地改造生
5、物或其功能，短期内创造出创造出具有超远缘性状的新物种新物种，再通过合适的生物反应器对这类“工程菌工程菌”或“工程细工程细胞株胞株”进行大规模的培养，以生产大量有用代谢代谢产物产物或发挥它们独特生理功能一门新兴技术。生物工程研究内容 生物工程包括五大工程，即遗传工程遗传工程(基因工程）基因工程）、细胞工程细胞工程、微生物工程微生物工程(发酵工程发酵工程)、酶工程酶工程(生生化工程化工程)和生物反应器工程生物反应器工程。在这五大领域中，前两者作用是将常规菌(或动植物细胞株)作为特定遗传物质受体，使它们获得外来基因，成为能表达超远缘性状的新物种“工程菌”或“工程细胞株”。后三者的作用则是这一有巨大潜
6、在价值的新物种创造良好的生长与繁殖条件，进行大规模新物种创造良好的生长与繁殖条件，进行大规模的培养的培养，以充分发挥其内在潜力，为人们提供巨大的经济效益和社会效益。 生物工程分为上游技术上游技术和下游技术下游技术两部分。生物工程中的上下游技术 上游技术上游技术（ Upstream Processing ）： 指的是目的基因获得、载体建立、连接、转入合适的宿主细胞、筛选、克隆表达和优良生物物种的选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程（酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养）等。 简而言之，上游技术就是创造工程菌并且大规模繁殖工程菌。生物工程中的上下游技术 下游技术下游技术（Downstream Pr
7、ocessing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，通常称为下游技术，也称下游工程或下游加工过程。简单说简单说，下游技术就是目标产物的分离纯化过程，下游技术就是目标产物的分离纯化过程。 生物工程下游技术的操作对象 操作对象一般指包含目标产物的人工培养包含目标产物的人工培养的动植物细胞或菌体的动植物细胞或菌体，也包括天然的动植物及微生物材料。 目标产物是指具有一定功能的生物分子目标产物是指具有一定功能的生物分子，主要是蛋白质、氨基酸、多肽、糖类及其衍生物、脂类及其
8、衍生物等。 目标产物的存在形式可为菌体菌体、胞内产物胞内产物和胞外产物胞外产物三种形式。常见的生物工程目标产物 （1）氨基酸及其衍生物）氨基酸及其衍生物，如谷氨酸、赖氨酸、精氨酸等。 （2）活性多肽类）活性多肽类，如谷胱甘肽、催产素、促肾上腺皮质激素、脑肽、抗菌肽等。 抗菌肽抗菌肽： 抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质。后来，从其他昆虫以及两栖类动物、哺乳动物中，也分离到结构相似的抗菌多肽。抗菌肽的概念得到了极大的扩展。抗菌肽的功效和抗菌机制 抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用某些耐药性病原菌的杀
9、灭作用更引起了人们的重视。 除此之外，人们还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。 作用机制：目前一般认为,Cecropin类抗菌肽作用类抗菌肽作用于细胞膜，在膜上形成跨膜的离子通道于细胞膜，在膜上形成跨膜的离子通道，破坏了膜的完整性，造成细胞内容物泄漏，从而杀死细胞。常见的生物工程目标产物 （3）蛋白质类）蛋白质类，是最重要的生物工程产品，也是下游技术最主要的分离对象。如生长素、胰岛素、干扰素等。 （4）酶类酶类：酶是具有催化功能的蛋白质或核酸类生物，在医疗、环保、能源、食品和饲料等领域具有重要的作业，是生物工程的主要研究对象和主要应
10、用产品。 2008年世界酶制剂的销售额已经达到30亿美元。世界上最大的8 家酶制剂生产厂商全世界各种酶制剂的销售比例不同工业用酶的销售情况中国各类酶制剂的产量和销售情况常见的生物工程目标产物 （5）核酸及其降解物质）核酸及其降解物质，主要包括碱基、核苷酸及其衍生物等。 （6）糖类）糖类。主要包括常规的单糖、寡糖（低聚寡糖）、多糖及其衍生物等。 （7）脂质类）脂质类。主要包括磷脂类、多价不饱和脂肪酸、固醇、卟啉以及胆酸类等。 （8）小动物制剂小动物制剂，包括蜂王浆、蜂胶、水蛭素等。（9）微生物制剂微生物制剂，包括活菌体、灭活菌体及其提取物制成的药物，如微生物肥料制剂、畜牧业饲料、污水处理用微生物
11、制剂等。生物工程之父巴斯德路易巴斯德（Louis Pasteur，1822.12.27-1895.9.25) ，法国微生物学家、化学家，近代微生物学的奠基人。巴斯德把微生物发酵原理广泛应用于指导工业生产，开创了“微生物工程”，被人们尊称为“微生物工程学之父”。主要贡献：（1）每一种发酵作用都是由于一种微菌的发展， “巴氏杀菌法”已成功应用在各种食物和饮料上。（2）每一种传染病都是一种微菌在生物体内的发展，由于发现并根除了一种侵害蚕卵的细菌，巴斯德拯救了法国的丝绸工业。（3）传染病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，使他们从病菌变成防病的疫苗。生物工程之父巴斯德科学虽然没有国界，科学家却科学虽
12、然没有国界，科学家却有自己的祖国。有自己的祖国。巴斯德巴斯德普法战争爆发后，巴斯德把自己从德国伯恩大学获得的名誉证书退还给伯恩大学。巴斯德与巴氏灭菌法 巴氏灭菌法巴氏灭菌法(pasteurize）又称低温灭菌法，先将）又称低温灭菌法，先将要求灭菌的物质加热到要求灭菌的物质加热到6530分钟或分钟或7215分钟分钟，随后迅速冷却到，随后迅速冷却到10以下。以下。这样既不破坏营养成分，又能杀死细菌的营养体。 巴氏灭菌法的产生来源于巴斯德解决啤酒变酸问题的努力。当时，法国酿酒业面临着一个令人头疼的问题，那就是啤酒在酿出后会变酸，根本无法饮用。巴斯德发现啤酒变酸的罪魁祸首是乳酸杆菌。以5060摄氏度的
13、温度加热啤酒半小时，就可以杀死啤酒里的乳酸杆菌和芽孢，而不必煮沸。这一方法挽救了法国的酿酒业。巴氏灭菌法的原理 巴氏杀菌法将原料加热至6070，并保持此温度30min，以后急速冷却到4-5。因为一般细菌的致死点均为温度68与时间30min以下，所以将混合原料经此法处理后，可杀灭其中的致病性细菌和绝大多数非致病性细菌；原料加热后突然冷却，急剧的热与冷变化也可以促使细菌的死亡。巴氏灭菌法在牛奶中的应用巴氏灭菌法是一种湿热灭菌法。通常有两种做法，一是在巴氏灭菌法是一种湿热灭菌法。通常有两种做法，一是在61.762.8下加热下加热30分钟（低温长时间处理），二是在分钟（低温长时间处理），二是在71.6
14、或或更高温度下加热更高温度下加热15分钟（高温短时间处理）分钟（高温短时间处理）。如果加压，一般效果会更好。通常，我们喝的袋装牛奶(燕塘牛奶)就是采用巴氏灭菌法生产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消毒法进行灭菌。用这用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存种方法生产的袋装牛奶通常可以保存310天，最多天，最多16天。天。因为经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4左右的温度下保存。需要指出的是，喝新鲜牛奶（指刚刚挤出的牛奶）反而是不安全的，因为它可能包含对人身体有害的细菌。另一点是，巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍然要储
15、存在较低的温度下（一般10%）的悬浮液的分离，广泛用于霉菌、放线菌和酵母菌发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。 由于受推动力（真空度）的限制，一般不一般不适合菌体较小、粘度较大的细菌发酵液的适合菌体较小、粘度较大的细菌发酵液的过滤。另外固相的干度不如加压过滤。过滤。另外固相的干度不如加压过滤。原理：在转鼓内维持一定的真空度，施加于转鼓外边的大气压力即为过滤的推动力。过滤时，转鼓下部浸没于待过滤的悬浮液中，当转鼓以低速旋转时，滤液就透过滤布被吸入转鼓内腔，滤渣则滞留于转鼓表面的过滤介质上形成滤饼。当转鼓继续转动，生成的滤饼依次被洗涤、吸干（洗涤吸干区）和刮下卸除（卸渣区）。最后，用压缩空气吹落滤布孔隙
16、中的细微颗粒，使滤布再生。真空转鼓过滤机硅藻土过滤机 硅藻土是一种较纯的二氧化硅矿石，它既是优良的过滤介硅藻土是一种较纯的二氧化硅矿石，它既是优良的过滤介质，也是优良的助滤剂。质，也是优良的助滤剂。 （1）作为深层过滤介质，过滤含少量悬浮固形物的液体。 （2）在支持介质（滤布）的表面上预先涂上硅藻土薄层，以保护介质的毛细孔道不被固体粒子堵塞，提高和稳定过滤速率。 （3）将适当的硅藻土分散在待过滤的悬浮液中，使形成的滤饼具有多孔隙性，降低滤饼的可压缩性，以提高过滤速率和延长过滤操作的周期。 按支撑单元的不同，硅藻土过滤机可分为板框式过滤机、叶片式过滤机和柱式过滤机三种。其他固液分离方法 1、切向
17、流过滤：、切向流过滤： 在一般过滤中，滤液的流动方向与滤饼基本垂直，称为封头过滤。这种方法由于滤饼的阻力，随着过滤的进行，过滤速度迅速下降。 切向流过滤是一种维持恒压下高速过滤的切向流过滤是一种维持恒压下高速过滤的技术，其操作特点是使悬浮液在过滤介质技术，其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。过滤介质表面的固体（滤饼）移走。切向流过滤 （1）用泵循环使悬浮液流经过滤介质。此法适合大规模生产，缺点是悬浮液在流动缺点是悬浮液在流动过程中有压力损失，流路中固体积累程度过程中有压力损失，流路中固体积累程度不
18、一，且能耗较大。不一，且能耗较大。 （2）在过滤介质表面加以搅拌造成流动，产生切向流。这种方式适合于实验室规模，处理量较小，过滤面积小，剪切力不均匀。切向流过滤的缺点 （1）切向流产生的剪切力使滤液中的目标蛋白失活。 （2）能耗比一般过滤高。 （3）固相的含水量较高，主要起浓缩作用。 （4）不能避免过滤介质的污染和堵塞。双水相萃取 是向水中加入溶于水的某种高分子化合物是向水中加入溶于水的某种高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一种高分子化合物，重相中富含
19、盐类或另一种高分子化合物，物，从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。 优点：投资小、能耗低，没有膜过滤中的堵塞问题。吸附法 向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。 优点：设备简单、能耗低。 缺点：难以选择合适的吸附剂，以保证目的产物不被吸附而损失。思考题 1、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？ 2、除去发酵液中杂蛋白质的常用方法有哪些？ 3、试述生物工业中常用固液分离设备的原理、特点及适用范围。
20、生物工业下游加工技术生物工业下游加工技术李刚 副教授第四章第四章 微生物细胞破碎微生物细胞破碎 第一节第一节 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构 第二节第二节 常用破碎方法常用破碎方法 第三节第三节 破碎率的测定与破碎技术的研究方向破碎率的测定与破碎技术的研究方向 第一节第一节 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构细胞壁（cellwall）是细胞的外层，在细胞膜的外面，细胞壁之厚薄常因组织、功能不同而异。植物、植物、真菌、藻类和原核生物（除了支真菌、藻类和原核生物（除了支原体与原体与L形细菌（缺壁细菌）形细菌（缺壁细菌）都具有细胞壁，而动物细胞不具都具有细胞壁，而动物细胞不具有细胞壁有细胞壁
21、。细胞壁本身结构疏松，外界可通过细胞壁进入细胞中，细胞壁具有全透性。细胞壁分为细胞壁分为3层，即胞间层（中层）、初生层，即胞间层（中层）、初生壁和次生壁。壁和次生壁。胞间层把相邻细胞粘在一起形成组织。细菌的细胞壁结构图 根据细菌细胞壁的构造和化学组成不同，可将其分为G+细菌与G-细菌。G+细菌的细胞壁较厚（2080nm），但化学组成比较单一，只含有90的肽聚糖和10的磷壁酸；但G-细菌的细胞壁较薄（1015nm），却有多层构造（肽聚糖和脂多糖层等），其化学成分中除含有肽聚糖以外，还含有一定量的类脂质和蛋白质等成分。此外，两者在表面结构上也有显著不同。革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁的比较细菌破碎的主
22、要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽健数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。各种微生物细胞壁的结构与组成微生物微生物革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1%-4%）肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖（11%-22%）磷脂蛋白质葡聚糖（30%-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质(6%-8%)脂类（8.5%-13.5%）多聚糖（80-90%）脂类蛋白质酵母菌细胞酵
23、母菌形态酵母菌形态酵母菌细胞结构酵母菌细胞结构周质空间原生质膜多糖甘露糖蛋白周质蛋白酵母细胞壁破碎的阻力主要取决于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。霉菌霉菌的细胞壁结构霉菌的细胞壁主要由多糖组成，其次含有少量的蛋白质和脂类。其中绝大多数的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成的，几丁质与纤维素结构很类似。由于由于霉菌细胞壁中含有纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。霉菌细胞壁中含有纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。细胞壁结构与细胞破碎 为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。接细胞壁网状结构的共价键。 了解细胞壁的组成和
24、结构，就可以用合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶活化学试剂相结合时确定其使用的顺序。第二节 常用破碎方法 分类分类 作用机理作用机理 适应性适应性机珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难。械高压匀浆法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作法X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感的目的产物不适应非酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差机 化学渗透法改变细胞膜的渗透性械 渗透压法反复冻
25、结-融化破碎率较低，常与其他方法结合使用法 冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感的目的产物 干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活珠磨法 珠磨法是一种有效的细胞破碎法。其工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径Al3+Ca2+Mg2+Na+ 阴离子顺序为： 柠檬酸根硫酸根硝酸根 2. 溶液浓度的影响：溶液浓度的影响： 树脂对离子交换吸附的选择性，在稀溶液中比较大。树脂对离子交换吸附的选择性，在稀溶液中比较大。因此可将溶液稀释，树脂选择吸附高价离子。 3. 离子的水化半径：离子的水化半径： 水化半径较小的离子优先吸附。水化
26、半径较小的离子优先吸附。影响离子交换树脂的选择性因素 4. 树脂物理结构的影响： 通常，交联度高的树脂对离子的选择性较强。通常，交联度高的树脂对离子的选择性较强。大孔型树脂的选择性低于凝胶型树脂。 5. 有机溶剂的影响： 当有机溶剂存在时，常会使树脂对有机离子的选择性降低当有机溶剂存在时，常会使树脂对有机离子的选择性降低，而容易吸附无机离子。，而容易吸附无机离子。基于这个性质，可利用有机溶剂从树脂上洗脱难洗脱的有机物质。 6. 树脂与交换离子间的辅助力： 凡是能与树脂间形成辅助力，如氢键、范德华力等辅助力的离子，树脂对其吸附力就大；反之，能破坏这些辅助力的溶液就能容易地将离子从树脂上洗脱下来。
27、三、离子交换过程和速度（1）溶液中的谷氨酸离子从溶液通过液膜扩散到树脂表面；（2）穿过树脂表面向树脂孔内部扩散，到达有效交换位置；（3）谷氨酸离子与树脂中的H+进行离子交换；（4）H+从树脂内部向树脂表面扩散。（5）H+穿过树脂表面的液膜进入水溶液。影响离子交换速度的因素 1.树脂颗粒树脂颗粒：树脂粒度减小，交换速度加快。 2. 树脂的交联度树脂的交联度：降低交联度，能提高交换速度。 3. 溶液流速溶液流速：外扩散随溶液过柱流速的增加而增加，内扩散基本不受流速的影响。 4. 溶液浓度溶液浓度：当溶液中的离子浓度较低时，对外扩散速度影响较大；当溶液中的离子浓度较高时，对内扩散影响较大。 5. 温
28、度温度：溶液的温度提高，扩散速度加快，因而交换速度也增加。 6. 离子的大小离子的大小： 小离子的交换速度比较快。大分子由于在扩散过程中受到空间的阻碍，在树脂内的扩散速度特别慢。 7. 离子的化合价：离子的化合价越高，扩散速度越小。第四节 离子交换的应用 一、离子交换装置： 离子交换法按操作方式可分为间歇式分批间歇式分批操作及柱式操作两种操作及柱式操作两种。 间歇操作：又叫静态处理，将离子交换剂浸泡于工作液中，达到平衡后，滤出介质进行洗脱。 柱式操作：又称动态法，交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行。工业生产中一般工业生产中一般采用柱式操作。采用柱式操作。离子交换柱结构图 离子交换的主要装置是离
29、子交换柱。它是圆柱形，上下封头球形或锥形。 离子交换柱有开放式和密离子交换柱有开放式和密闭式两种。闭式两种。 开放式便于树脂的装入和吸出，柱子的反洗河清除树脂层表面的污垢。但容易混入外界杂质。 密闭式上下全封闭，能克服开放式的缺点，但清污和装柱较麻烦。离子交换的操作方法 （1）树脂预处理及装柱 （2）离子交换吸附 （3）洗脱 （4）树脂再生1. 树脂的预处理应用最多的为强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂。应用最多的为强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂。生产上出厂的交换树脂颗粒大小往往不够均匀，故使用时应当先过筛以除去太大和太小的颗粒，也可以用水泡胀后用筛子在水中选取大小一定的颗
30、粒备用。一般商品树脂都含有一定量的杂质，所以在使用前必须进行净化处理一般商品树脂都含有一定量的杂质，所以在使用前必须进行净化处理。对强碱性和强酸性阴离子交换树脂，通常用。对强碱性和强酸性阴离子交换树脂，通常用4M HCl溶液浸泡溶液浸泡1-2天天，以溶解各种杂质，然后用蒸馏水洗涤至中性。这样就得到在活性基，以溶解各种杂质，然后用蒸馏水洗涤至中性。这样就得到在活性基团上含有可被交换的团上含有可被交换的H+或或Cl-的氢型阳离子交换树脂或氯型阴离子交的氢型阳离子交换树脂或氯型阴离子交换树脂。换树脂。如果需要钠型阳离子交换树脂，则用NaCl处理氢型阳离子交换树脂。物理处理：水洗、过筛、去杂，以获得粒
31、度均匀的树脂颗粒；化学处理：转型（氢型或钠型）：阳离子树脂：酸碱酸；阴离子树脂：碱酸碱；最后以去离子水或缓冲液平衡。2. 上柱交换 上柱交换是离子交换的关键，要求将所需上柱交换是离子交换的关键，要求将所需要吸附的离子吸附完全，且比较集中。要吸附的离子吸附完全，且比较集中。 交换可以采用顺流进行（原液自上向下流过树脂层）或逆流（原液自下向上流过树脂层）进行。2. 上柱交换 随着含离子（随着含离子（B）溶液不）溶液不断流入，交换带逐渐向下断流入，交换带逐渐向下移动，最后到达底部，使移动，最后到达底部，使B离子漏出，这点称为漏离子漏出，这点称为漏出点（目标产物挂不上柱出点（目标产物挂不上柱子了）。子
32、了）。 交换至漏出点时，应停止交换，进行洗脱或者再生。 实际应用中要求交换带宽实际应用中要求交换带宽度越窄越好，这样树脂的度越窄越好，这样树脂的有效交换容量大，柱子的有效交换容量大，柱子的利用率高。利用率高。3. 洗脱 对生物大分子进行分离纯化可采用两种方式：一是将目的一是将目的产物离子化，被交换到介质上，杂质不被吸附，从柱子中产物离子化，被交换到介质上，杂质不被吸附，从柱子中流出，目的产物经洗脱收集，称为正吸附。流出，目的产物经洗脱收集，称为正吸附。 这种方法的优点是目的产物纯度高，而且可达到浓缩目的，适宜处理目的产物浓度低且工作液量大的溶液。 另一方法是将杂质离子化后被交换，而目的产物不被
33、交换另一方法是将杂质离子化后被交换，而目的产物不被交换直接流出收集，这种方式称为负吸附。直接流出收集，这种方式称为负吸附。采用这种方法可除去大部分的杂质，适用于目的产物浓度高的工作液，但此方法的产物纯度不高。 洗脱：就是用亲和力更强的同性离子取代树脂上吸附的目洗脱：就是用亲和力更强的同性离子取代树脂上吸附的目的产物。的产物。4. 树脂的再生 离子交换树脂在工作过程中逐渐吸附被处理液中的杂质，经过一段时间后就接近“饱和”状态，离子交换能力降低，需要进行再生处理。 再生反应是交换吸附的逆反应。再生反应是交换吸附的逆反应。树脂使用失效之后，要先用清水洗涤，然后用再生剂再生，最后用清水洗至所需pH值。
34、 再生剂的种类应根据树脂的离子类型来选择。例如钠型强再生剂的种类应根据树脂的离子类型来选择。例如钠型强酸性树脂用酸性树脂用NaCl溶液再生。溶液再生。 在实际生产中，树脂的恢复程度通常为70-80%，再要提高，再生剂的消耗量大大增加，很不经济。 离子交换树脂使用一段时间后，性能逐渐下降，知道不符合要求，此时就需要更新。三、树脂和操作条件的选择 树脂的选择： 对于离子型产品（或杂质），可以采用离子交换法来提取或脱除。首先是要选择合适的树脂，一般来说，对强碱性离子宜采一般来说，对强碱性离子宜采用弱酸性树脂，这样吸附比较容易。吸附用弱酸性树脂，这样吸附比较容易。吸附大分子离子，应选择交联度较低的树脂
35、，大分子离子，应选择交联度较低的树脂，便于大分子扩散到树脂内部。但交联度也不能过低，否则会影响树脂的选择性和机械强度。操作条件的选择 （1）交换时的）交换时的pH：pH值应在产物稳定范围内，使产物离子化，使树脂能解离。 （2）树脂的型式：）树脂的型式：一般来说，对弱酸性和弱碱性树脂，应采用钠型或氯型，而对强酸性和强碱性树脂，可以采用任何形式。 （3）溶液中产物浓度）溶液中产物浓度：低价离子增加浓度有利于交换上树脂，高价离子在稀释时容易被吸附。 （4）洗脱条件）洗脱条件：洗脱条件一般应和吸附条件相反。如吸附在碱性下进行，解吸应在酸性下进行。另外，为使在解吸过程中，pH变化不致过大，有时宜选用缓冲
36、液作洗脱变化不致过大，有时宜选用缓冲液作洗脱剂。剂。软水和无盐水的制备 天然水中都不同程度含有硬度离子（Ca2+、Mg2+），这些硬度离子是锅炉结垢的主要成分。利用钠型离子交换树脂利用钠型离子交换树脂去除钙镁离子后的水称为软水。去除钙镁离子后的水称为软水。软水主要是给锅炉给水。 无盐水是将原水中的所有溶解性盐类、游离的酸、碱离子无盐水是将原水中的所有溶解性盐类、游离的酸、碱离子除去。除去。 无盐水的用途十分广泛，如高压锅炉的补给水、实验室用实验室用的去离子水，的去离子水，制药、食品行业的无盐纯水等。 离子交换法制备无盐水是将原水通过氢型阳离子交换树脂和羟型阴离子交换树脂，经过离子交换反应，将水
37、中的阴、阳离子除去，从而制得纯度很高的无盐纯水。 阳离子交换树脂失效后，一般用一定浓度的盐酸或硫酸再生。阴离子交换树脂失效后，一般采用5%-8%的氢氧化钠再生。软水和无盐水的制备原水经过阴、阳树脂一次交换，称为一级交换。原水经过阴、阳树脂一次交换，称为一级交换。交换过程是由一个阳离子交换树脂床和一个阴离子交换树脂床来完成，所以这种系统称为一级复床系统。为了制备纯度较高的无盐纯水，常常把几个阳离子交换器和几个阴离几个阳离子交换器和几个阴离子交换器串联起来，组成多床多塔除盐系统子交换器串联起来，组成多床多塔除盐系统，但再多的复床也是有限的，因此发展了混合床离子交换系统。将阴、阳离子交换树脂装在同一
38、个交换器内直接进行离子交换除盐的将阴、阳离子交换树脂装在同一个交换器内直接进行离子交换除盐的系统称为混合床离子交换系统。系统称为混合床离子交换系统。在混合床中的阴阳离子交换树脂均匀地混合在一起，好像无数对阳、在混合床中的阴阳离子交换树脂均匀地混合在一起，好像无数对阳、阴离子树脂串联一样。阴离子树脂串联一样。此时，H+型阳树脂交换反应游离出的H+和OH-型阴离子树脂交换反应游离出来的OH-在交换器内立即得到中和，所以混合床的反应完全，脱盐效果很好。混合床的反应完全，脱盐效果很好。离子交换技术在生物工程的应用 使用离子交换树脂可以从发酵液中富集和纯化产物。 氨基酸是一类含有氨基和羧基的两性化合物，
39、在不同的pH条件下能以正离子、负离子或两性离子的形式存在。因此，应用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂可以富集分离氨基酸。离子交换技术在生物工程的应用 利用离子交换树脂可以选择性地吸附分离多种离子型抗生素，不仅回收率较高，而且得到的产品纯度较好。 一些抗生素具有酸性基团，如苄基青霉素和新生霉素等，在中性或弱碱条件下以负离子的形式存在，故能以阴离子交换树脂提取分离。 应用阴离子交换树脂，可从动物、植物和微生物发酵液中提取分离天然有机酸、核苷酸和脱氧核苷酸、维生素、酶、辅酶等。第五节 生化用离子交换剂的特点和种类 一、生化用离子交换剂的特点：一、生化用离子交换剂的特点： 1.亲水性及生物相容性：亲水性
40、及生物相容性： 亲水性树脂在水中充分溶胀后成为水溶胶类物质，为活性大分子提供适宜的为缓解，这类离子交换剂与生物大分子具有良好的生物相容性。 2. 孔结构：孔结构：生化用离子交换剂在分离中兼有分子筛与离子交换的双重作用，要求孔径分布更加均匀。 3. 电荷密度：电荷密度：电荷密度应该适当，这样才有利于生物大分子的分离纯化。 4. 粒度：粒度：粒径小，一般在20-30微米范围内。生物大分子扩散速率小，运动阻力大，要提高交换速度只能减少粒径。第五节 生化用离子交换剂的特点和种类 5. 纯度。纯度。生化用介质分以下几个等级（1）工业级；（2）分析级；（3）生物技术级；（4）分子生物级。 最高的是分子生物
41、级最高的是分子生物级。这类介质的物化性能与一般离子交换剂无明显差异，但要求介质中无核酸内切酶、外切酶，也无连接酶抑制剂，也叫DNA级。二、生化用离子交换剂的种类 常用的有两大类：常用的有两大类： （1）纤维素类）纤维素类：离子交换纤维是最早用于生物大分子分离的介质，具有松散的亲水网络、大孔、大的表面积等优点。 （2）葡聚糖系）葡聚糖系Sephadex离子交换剂离子交换剂。这种离子交换剂不溶于水及各种溶剂。使用时要避免强酸强碱溶液。中性pH值时可用。有两种孔度，具有较高的容量。 另外，还有琼脂糖系离子交换剂，Momo beads系离子交换剂，聚丙烯酸羟乙基酯系离子交换剂等。不是很常用。思考题 1
42、、简述离子交换原理。 2、对有实用意义的离子交换树脂有什么要求？ 3、有哪些因素影响离子交换反应速度？ 4、如何制备软水和无盐水？生物工业下游加工技术生物工业下游加工技术李刚 副教授第十二章第十二章 色谱分离色谱分离 第一节第一节 概论概论 第二节第二节 色谱分离的分类色谱分离的分类 第三节第三节 生物工业中的色谱分离生物工业中的色谱分离 第四节第四节 色谱分离的基本原理色谱分离的基本原理 第五节第五节 柱色谱分离法柱色谱分离法 第六节第六节 亲和色谱亲和色谱知识要点 （1）掌握各种色谱分离技术的特点特点及适应适应范围范围。 （2）理解色谱分离方法的基本原理基本原理。 （3）了解色谱分离方法的
43、分类分类。第一节 概述 色谱分离色谱分离（Chromatographic Resolution， CR）：也称色层分离或层析分离（蛋白质层析仪）层析分离（蛋白质层析仪），在分析检测中常称为色谱分析。它是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学利用多组分混合物中各组分物理化学性质性质（吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不的差别，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。当同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使
44、之分化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。离。色谱分离法的发展历史 1903年俄国植物学家茨维特用菊根粉研究植物色素的提取植物色素的提取物物，以石油醚作为洗脱剂，得到分离的黄色、绿色区带，得到分离的黄色、绿色区带，故称为色谱分离法。故称为色谱分离法。 1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了本方法具有极高的分辨率。 50年代气象色谱的出现，为色谱分离仪器化奠定了雄厚的物质基础。 60年度高效液相色谱的发展，使高效固定相填料获得了突破性的进展。 在此后的20多年中，气相色谱和液相色谱在分析化学领域内，尤其是对多组分复杂体系的分析占了绝对的统治地位。色谱分离法的发展历
45、史 随着生物技术的发展，对生物产品的分离往往达不到所需的纯度要求，色谱分离成色谱分离成为分离技术的研究重点，并在理论上从线为分离技术的研究重点，并在理论上从线性色谱发展到非线性色谱性色谱发展到非线性色谱。 近年来，陆续出现了全色谱分离和纯化治全色谱分离和纯化治疗蛋白的工艺疗蛋白的工艺，使人们对加宽色谱分离应用范围的研究更趋活跃。色谱分离的基本特点 （1）分离效率高：色谱分离的效率是所有分离纯化技术分离效率高：色谱分离的效率是所有分离纯化技术中最高的。中最高的。由于分离效率高，通常使用的色谱柱长只有几厘米到几十厘米。这种高效的分离尤其适合于极复杂混合这种高效的分离尤其适合于极复杂混合物的分离。物
46、的分离。 （2）应用范围广：色谱分离的应用范围之广也是其他分色谱分离的应用范围之广也是其他分离技术无法相比的，离技术无法相比的，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子等都可用色谱方法分离，尤其对生物大尤其对生物大分子样品的分离，是其他方法无法取代的。分子样品的分离，是其他方法无法取代的。 （3）选择性强。选择性强。色谱分离技术的可变参数之多可变参数之多也是其他分离技术无法相比的。因而具有很强的选择性。在色谱分离中，可通过多种途径选择不同的操作参数，以适应各种适应各种不同样品的分离要求不同样品的分离要求。色谱分离的基本特点 （4）高灵敏度的在线检测高灵敏度的在线检测：与其他分离方法相比
47、，色谱分离具有高灵敏度在线检测的特性。在分离与纯化过程中，可根据不同的物理与化学原理，采用不同的高灵敏度检采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在线检测测器进行连续的在线检测，以保证在要求的纯度下得到最高的产率。 （5）快速分离快速分离：高效细颗粒层析剂和高压液相色谱分离技术的采用，保证了在高分离效率前提下的高分离速率，从而可以提高单位时间的产量。 （6）过程自动化操作过程自动化操作。计算机的应用计算机的应用使色谱分离过程自分离过程自动化动化，可按预先设置的程序进行完全自动化的操作，保证保证了产品的质量，提高了产率，节省了劳动力，降低了生产了产品的质量，提高了产率，节省了劳动力，降低了生产成本。成
48、本。色谱分离的缺点 （1）仪器设备昂贵仪器设备昂贵，一次性投入比较大。 （2）要消耗溶剂用于分离，有时消耗的溶消耗的溶剂量比较大。剂量比较大。 （3）有些能与分离介质反应的物质不能用色谱法分离。第二节 色谱分离的分类 一、按分离机理分离机理分类： （1）吸附色谱分离； （2）分配色谱分离； （3）离子交换色谱； （4）凝胶色谱； （5）亲和色谱；吸附色谱 吸附色谱（Adsorption Chromatography, AC）是指混合物随流动相通过固定相（吸是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。力不同而
49、使混合物分离的方法。 吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，所用吸附剂一般为有机基质并通过化学修饰后制成。它们都有比较明确的作用机理作用机理，即疏水作用疏水作用，螯合作用螯合作用和共价共价作用作用。分配色谱 分配色谱（Distribution Chromatography, DC）:因流动相和固定相都是液体，因此又称为液液色谱。其原理是利用其原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。 根据分配原理进行色谱分离的操作方法有两种：一种是柱一种是柱（纸或板）色谱分离法，（纸或板）色谱分离法，其固定相是将与流动相互不相溶的液体涂渍到载体上形成的；另一种是逆流分配法另一种是逆流分配法，其固定相和流动相都放在一组特别的分配管中，用来完成这种操作的仪器称为逆流分配仪。 根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱又根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱又可分为正向色谱和反相色谱。可分为正向色谱和反相色谱。正向色谱的固定相与极性，流动相为非极性。而反相色谱则相反。离子交换色谱 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography, IEC）:是基于离子交换树脂上可电离的离子与流是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混
