1、食品微生物检验技术食品微生物检验技术2011年2月发布人：吴兆华发布人：吴兆华入门篇入门篇SHF QA&QC课程目录课程目录一一. .认识微生物认识微生物二二. .消毒与灭菌消毒与灭菌三三. .微生物实验室微生物实验室四四. .食品微生物检验技术食品微生物检验技术五五. .相关标准相关标准一一 ：认识微生物：认识微生物食物、食品、食品工业食物、食品、食品工业食物食物是人体生长发育、细胞更新、调节机是人体生长发育、细胞更新、调节机能必不可少的营养物质，也是产生热量保持体能必不可少的营养物质，也是产生热量保持体温、体力的能量来源。温、体力的能量来源。食品食品经过加工制作的食物统称为食品经过加工制作
2、的食物统称为食品食品工业食品工业包括农业、食品制造、市场包括农业、食品制造、市场三个方面，广义上讲，食品工业是国民经三个方面，广义上讲，食品工业是国民经济的基础和支柱之一。是一个永不衰弱的济的基础和支柱之一。是一个永不衰弱的行业。行业。微生物从不知到知的过程微生物从不知到知的过程酿酒、天花，列文虎克、巴斯德、酿酒、天花，列文虎克、巴斯德、 科赫科赫 远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料人类最早发明的酒酒 天花天花是感染是感染痘病毒痘病毒引起的，引起的，无药可治，每无药可治，每4名天花病人当名天花病人当中便有一人死亡，而剩余的中便有一人死亡，而剩余的3人却要留下丑陋的痘痕。人却要留
3、下丑陋的痘痕。 明代以后，明代以后，人痘接种法人痘接种法盛行起盛行起来。到目前为止，天花是在在来。到目前为止，天花是在在世界范围被人类消灭或控制的世界范围被人类消灭或控制的第一个传染病。第一个传染病。天花病毒安东安东列文虎克列文虎克 荷兰荷兰格拉夫格拉夫 霍霍夫利特霍霍夫利特微生物的鼻祖微生物的鼻祖 无孔不入的微生物，何时何地不在与无孔不入的微生物，何时何地不在与人们打交道。人们打交道。甚至在我们体内到处安营甚至在我们体内到处安营扎寨，自由出扎寨，自由出入入。可是，人们不肉眼看。可是，人们不肉眼看见它们，因而几千年来，人类竟不知道见它们，因而几千年来，人类竟不知道世界上还有微生物这东西存在。世
4、界上还有微生物这东西存在。 直到直到16731673年列文虎克用自制显微镜发现了年列文虎克用自制显微镜发现了“小动物小动物”的微生物世界！他一生当中的微生物世界！他一生当中磨制磨制500500多多个镜片，制造个镜片，制造400400多多种显微镜，种显微镜，其中只有其中只有9 9种至今仍有人使用。虽然他活种至今仍有人使用。虽然他活着的时候就看到人们承认了他的发现，着的时候就看到人们承认了他的发现，但要等到但要等到100100多年以后，当人们在用效率多年以后，当人们在用效率更高的显微镜重新观察列文虎克描述的更高的显微镜重新观察列文虎克描述的 “小动物小动物”，并知道他们会引起人类严，并知道他们会引
5、起人类严重疾病和产生许多有用物质时，才真正重疾病和产生许多有用物质时，才真正认识到列文虎克对人类认识世界所作出认识到列文虎克对人类认识世界所作出的伟大贡献。的伟大贡献。法国科学家路易斯法国科学家路易斯巴斯德巴斯德(1822-1895)被后人誉为被后人誉为“微生物学之父微生物学之父”。证实发酵由微生物引起证实发酵由微生物引起免疫学免疫学预防接种预防接种鹅颈烧瓶实验也创造了一种有鹅颈烧瓶实验也创造了一种有效的灭菌方法效的灭菌方法巴氏灭菌法。巴氏灭菌法。 反驳微生物自然发生说反驳微生物自然发生说鹅颈烧瓶实验鹅颈烧瓶实验科学虽没有国界，但科学家却有自己的祖国德国的波恩大学 普法战争爆发 传染病是人类健
6、康的大敌。从古至今，鼠疫、伤寒、霍乱、肺结核等许多可怕的病魔夺去了人类无数的生命。人类要战胜这些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一个发现传染病是由病原细菌感染造成的人就是罗伯特科赫。 罗伯特罗伯特科赫（科赫（18431910）-德国医学家德国医学家罗伯特.科赫发现结核杆菌一百周年 被后人尊为细菌学鼻祖，传染病的克星，细菌学的奠基人和开拓者被后人尊为细菌学鼻祖，传染病的克星，细菌学的奠基人和开拓者2003年，经过全球10个国家的科学家的共同努力，终于确认了冠状病毒是SARS的病原体。最终判定这种冠状病毒是否真正的元凶，依靠的是100多年前德国伟大的细菌学家科赫提出的“科赫原则”。1870结婚-
7、1873年30岁生日-1910腐败腐败-食品因变质而产生臭气、刺激味和毒性物质的现象。食品因变质而产生臭气、刺激味和毒性物质的现象。变质变质凡引起食品理化性质发生改变的现象。凡引起食品理化性质发生改变的现象。防腐防腐-防止或阻止微生物生长繁殖的方法。防止或阻止微生物生长繁殖的方法。防腐剂防腐剂-能杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质能杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质消毒剂消毒剂-用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。 灭菌剂灭菌剂 -可杀灭一切微生物可杀灭一切微生物( (包括细菌芽孢包括细菌芽孢) )使其达到灭菌要求的制
8、使其达到灭菌要求的制剂。剂。无菌无菌-不含有活的微生物的意思不含有活的微生物的意思。商业无菌商业无菌-杀灭在正常的商品管理条件下的贮运销售期间有碍人类健杀灭在正常的商品管理条件下的贮运销售期间有碍人类健康的细菌。康的细菌。无菌技术无菌技术（无菌操作）：防止微生物进入机体或物体的方法。（无菌操作）：防止微生物进入机体或物体的方法。术语术语概论概论 微生物概念：微生物概念：微生物是一个通称，微生物是一个通称， 形体微小，结构简单的低等生物。形体微小，结构简单的低等生物。 微生物类别：微生物类别：包括细菌、霉菌、酵母包括细菌、霉菌、酵母菌、支原体、衣原体、立克次氏体、菌、支原体、衣原体、立克次氏体、
9、微藻及原生动物类等。微藻及原生动物类等。 细菌细菌 单细胞原核生物单细胞原核生物：光学显微镜（油镜）下：光学显微镜（油镜）下放大一千倍以上并染色才能清楚看见其个放大一千倍以上并染色才能清楚看见其个体。如人体肠道内的大肠杆菌、粪链球菌，体。如人体肠道内的大肠杆菌、粪链球菌，用于酿醋的醋酸杆菌，使牛奶变酸的乳酸用于酿醋的醋酸杆菌，使牛奶变酸的乳酸杆菌，生产味精的谷氨酸短杆菌，生产淀杆菌，生产味精的谷氨酸短杆菌，生产淀粉酶的枯草杆菌等。粉酶的枯草杆菌等。 细胞壁细胞壁主要成分是肽聚糖，功能包括：保持细胞外形；抑制机械和渗透损伤；介导细胞间相互作用；防止大分子入侵；协助细胞运动和分裂。细胞膜细胞膜主要
10、成分是磷脂，蛋白质糖脂组成。功能包括：使细胞维持稳定代谢的胞内环境，调节和选择物质进出细胞。细胞质细胞质主要成分是可溶性酶、糖、无机盐和水等。功能包括：进行新陈代谢的主要场所，绝大多数的化学反应都在细胞质中进行。同时它对细胞核也有调控作用。 细胞核细胞核含有DNA是细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用。功能：控制细胞的遗传，生长和发育。荚膜荚膜是某些细菌在细胞壁外包围的一层粘液性物质，一般由糖和多肽组成。功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物质的损伤作用抗干燥作用等鞭毛鞭毛在某些细菌菌体上具有细长而弯曲的丝状物，是细菌的运动器官。霉菌霉菌 真核生物，单细胞或多细胞丝状真菌真核生物，
11、单细胞或多细胞丝状真菌 可用低倍或高倍镜观察其形态。如酿制小曲酒可用低倍或高倍镜观察其形态。如酿制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生产葡萄糖的曲霉的根霉、制豆腐乳的毛霉、生产葡萄糖的曲霉菌、生产青霉素的青霉等。菌、生产青霉素的青霉等。 。酵母菌酵母菌 单细胞真菌，最低等的真核生物。单细胞真菌，最低等的真核生物。一般用高倍镜（一般用高倍镜（401600倍）观倍）观察其个体细胞形态。如面包酵母、察其个体细胞形态。如面包酵母、酿酒酵母、红酵母等。酿酒酵母、红酵母等。 支原体、衣原体、立克次氏体支原体、衣原体、立克次氏体 单细胞，介于细菌与病毒之间的一类原始而小型的单细胞，介于细菌与病毒之间的一类原始而
12、小型的原核微生物。原核微生物。 衣原体模型衣原体模型微细藻类微细藻类单细胞藻类：单细胞藻类：如红藻、绿藻、小球如红藻、绿藻、小球藻等藻等。 原生动物原生动物 单细胞，无真正细胞壁。单细胞，无真正细胞壁。 如变形虫、吸管虫、草履虫等。如变形虫、吸管虫、草履虫等。 种类多种类多- -到目前为止，人们已认识的微生物已有到目前为止，人们已认识的微生物已有1010多万种。多万种。 分布广分布广- -微生物因其形体微小，重量轻，故可以随着风和水微生物因其形体微小，重量轻，故可以随着风和水流到处传播。流到处传播。 繁殖快繁殖快- -微生物惊人的生长繁殖速度是其他任何生物都望尘微生物惊人的生长繁殖速度是其他任
13、何生物都望尘莫及的。一般细菌的世代时间为几十分钟到一百多分钟。在莫及的。一般细菌的世代时间为几十分钟到一百多分钟。在最适宜的条件下，人们最熟悉的大肠杆菌每最适宜的条件下，人们最熟悉的大肠杆菌每131320min20min就可就可分裂出新的一代。分裂出新的一代。 代谢强代谢强- -微生物的代谢强度比起高等生物要高出几百到几万微生物的代谢强度比起高等生物要高出几百到几万倍，主要表现在吸收多转化快。倍，主要表现在吸收多转化快。 易变异易变异- -微生物结构简单微生物结构简单, ,因而在受到外界物理或化学因素因而在受到外界物理或化学因素影响后，很容易引起细胞内的遗传物质发生突变，结果导致影响后，很容易
14、引起细胞内的遗传物质发生突变，结果导致变异。另一个原因是细胞增殖速度快。变异。另一个原因是细胞增殖速度快。微生物的特性微生物的特性来自来自土壤土壤 水水 空气空气 人体人体食品中微生物来源食品中微生物来源来自来自-土壤土壤 土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育所必须的一切条件。含有大量的微生物，细菌来自天所必须的一切条件。含有大量的微生物，细菌来自天然生活在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排然生活在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体进入土壤的细菌。泄物及其尸体进入土壤的细菌。来自来自-水水 水也是微生物存在的天然环境，
15、水中的细菌来自土壤、水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。来自来自-空气空气 在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空气的传播。气的传播。来自来自-人体人体 人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种通道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）粘膜及外界相通的各种通道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，都存在着微生物群。等部位，都存在着微生物群。微生物引起食品腐败变质微生物引起食品腐败
16、变质 食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。环境物的生长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。环境中无处不存在微生物，食物在生产、加工、运输、储存、中无处不存在微生物，食物在生产、加工、运输、储存、销售过程中，很容易被微生物污染。只要温度适宜，微生销售过程中，很容易被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖，分解食物中的营养素。这时食物中的蛋物就会生长繁殖，分解食物中的营养素。这时食物中的蛋白质就被破坏了，食物会发出臭味和酸味，颜色也会发生白质就被破坏了，食物会发出臭味和酸味，颜色也
17、会发生变化从而造成食品变质。变化从而造成食品变质。 乳及乳制品的营养成分比较完全，都含有丰富的蛋白质、乳及乳制品的营养成分比较完全，都含有丰富的蛋白质、极易吸收的钙等。因此极易为微生物所腐败变质。极易吸收的钙等。因此极易为微生物所腐败变质。二：消毒和灭菌二：消毒和灭菌概念概念 消毒消毒 -杀灭或清除传播媒介上病原微生物杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的使其达到无害化的FF。 灭菌灭菌 -用物理和化学方法杀灭或清除传播用物理和化学方法杀灭或清除传播媒介上一切微生物的方法。媒介上一切微生物的方法。温度温度 利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。利用温度进行灭菌、消
18、毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温高温可可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用. .低温低温通常起抑菌作用。通常起抑菌作用。 嗜冷嗜冷微生物适合于微生物适合于1010生活的细菌，最适生长温度在生活的细菌，最适生长温度在2020左右。左右。 嗜温嗜温微生物生长温度在微生物生长温度在15154545之间，最适生长温度在之间，最适生长温度在3737左右的细菌。左右的细菌。 嗜热嗜热微生物生长温度在微生物生长温度在30307575之间，最适生长温度在之间，最适生长温度在5555，在，在100100以上以上温度生长，
19、称为温度生长，称为嗜高热嗜高热微生物。微生物。微 生 物 热 死温 度 ( )时 间时 间 ( 分 )金 黄 色 葡 萄 球 菌6 37大 肠 杆 菌6 05 3 0沙 门 氏 菌6 05酵 母 菌5 0 6 01 0 1 5霉 菌6 05 1 0消毒与灭菌方法消毒与灭菌方法 一、干热灭菌法一、干热灭菌法 1.火焰灭菌（酒精灯）火焰灭菌（酒精灯） 2.干热灭菌（电热干燥箱）干热灭菌（电热干燥箱） 二、湿热灭菌法二、湿热灭菌法 1.巴氏消毒巴氏消毒 2.煮沸消毒煮沸消毒 3.间歇灭菌法间歇灭菌法 4.加热蒸汽灭菌法（高压灭菌锅）加热蒸汽灭菌法（高压灭菌锅） 三、辐射三、辐射 四、过滤四、过滤 五
20、、化学方法五、化学方法干热灭菌法干热灭菌法a.a.灼烧灭菌法：灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。b.b.干热空气灭菌法：干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。湿热灭菌法湿热灭菌法在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好a.巴氏消毒法：有些食物因高温破坏营养成分，如牛奶、酱油、啤酒等，只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持营养和风味，又进行消毒。该
21、法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。b.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。c.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将物品加热至100C，1530分钟。然后冷却，放入37恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。 d. 加压蒸汽灭菌法：在蒸汽压达到1.055公斤时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15-20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。 辐射及过滤
22、辐射及过滤 辐射辐射：利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。）应用射线作食品表面杀菌，射线用于食品内部杀菌。 过滤过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，从而达到除菌的目的。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内。 超高温杀菌超高温杀菌： 135-150C和2-8s对液态食品进行。可保持食品价值和营养成分。化学方法化学方法 一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以
23、是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。 一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消毒一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌。由于消毒防腐剂不仅能杀死或剂在低浓度时也能杀菌。由于消毒防腐剂不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和环境的消毒。常用所以只能用于体表、器械、排泄物和环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。汞、碘酒、酒精等。
24、 三：食品微生物实验室三：食品微生物实验室 生物实验室级别生物实验室级别 管理制度管理制度 建设布局建设布局 常用仪器及用途常用仪器及用途生物安全水平分级生物安全水平分级 生物安全防护水平（biosafety level，BSL）分为4级，以表示实验室的相应生物安全防护水平。 BSL1：防护水平最低,普通建筑物即可，每个实验室应设洗手池。 BSL-2：实验室的门有可视窗。在实验室工作区域外还应当有供长期使用的存储空间。在实验室内使用专门的工作服；应戴乳胶手套。配备高压蒸汽灭菌器，在实验室内配备生物安全柜。BSL-2生物安全水平分级生物安全水平分级 BSL3实验室实验室：自成隔离区（有出入控制）
25、或为独立建筑物。 BSL4 防护水平最高。实验室应建造在独立的建筑物内或建筑物中独立的完全隔离区域内，该建筑物应远离城区。 实验室管理制度实验室管理制度 1 1实验室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻实验室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作璃器皿管理使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。人员应严格掌握，认真执行。2 2进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安
26、全操作规程。好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。3 3实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修期检查、保养、检修, , 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。严禁在冰箱内存放和加工私人食品。4 4各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出。不得私自拿出。5 5禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实
27、验室内不得带入禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。检验室建设布局图检验室建设布局图 1.办公台 2.文件柜 3.样品柜 4.通风橱 5.实验边台 6，7.无菌台 8.天平台9.在落地仪器区再加个高温仪器台，放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等无菌室建设无菌室建设 检验环境要求检验环境要求 微生物学检验室要求操作区域与办公区域微生物学检验室要求操作
28、区域与办公区域分开。分开。 洗涤室、培养室、消毒间、无菌室应分开。洗涤室、培养室、消毒间、无菌室应分开。 无菌室要设有套间或缓冲间，最好设推拉无菌室要设有套间或缓冲间，最好设推拉门，以防空气振荡过大。门，以防空气振荡过大。 微生物检验室应备有自动或脚踩式洗手池微生物检验室应备有自动或脚踩式洗手池和固定的消毒设施。和固定的消毒设施。 食品微生物实验室食品微生物实验室 常用仪器及用途常用仪器及用途洁净工作台（超净工作台、无菌台）洁净工作台（超净工作台、无菌台）是一种供人操作的通用型局部净化设是一种供人操作的通用型局部净化设备，通过风机将空气吸入，经由静压备，通过风机将空气吸入，经由静压箱通过高效过
29、滤器过滤，将过滤后的箱通过高效过滤器过滤，将过滤后的洁净空气以垂直或水平气流的状态送洁净空气以垂直或水平气流的状态送出，使操作区域持续在洁净空气的控出，使操作区域持续在洁净空气的控制下达到百级洁净度它可造就局部高制下达到百级洁净度它可造就局部高清洁度空气环境。清洁度空气环境。生物安全柜生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染
30、性气溶胶和溅出物而设计的。性气溶胶和溅出物而设计的。高压灭菌锅高压灭菌锅烘箱烘箱培养箱培养箱水浴锅水浴锅显微镜显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜显微镜被用来放大微小物体的图像。一般应用于对生物、医药、微观粒子等观测。分光光度计分光光度计分光光度计已经成分光光度计已经成为现代分子生物实为现代分子生物实验室常规仪器。常验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓量以及细菌生长浓度的定量度的定量pHpH计计离心机离心机PCRPCR仪仪原理：原理：采用实时荧光采用实时荧光PCR技术检测食技术检测食品中是否有致病菌；品中是否有致病菌；灵敏度：灵敏度：对目标菌检测灵敏度为对目标菌检测灵
31、敏度为1个个/g效率：效率：检测过程用时检测过程用时2-4H主要耗材：主要耗材：各菌种试剂盒各菌种试剂盒 真空泵真空泵 冰箱冰箱 纯水机纯水机 振荡器振荡器/均质机均质机 移液器移液器其它仪器其它仪器四：食品微生物检验技术四：食品微生物检验技术主要内容主要内容1.微生物检测作业规范微生物检测作业规范2.微生物检验流程微生物检验流程3.常见卫生指标及致病菌常见卫生指标及致病菌4.测定微生物的大小测定微生物的大小5.测定微生物的数量测定微生物的数量6.菌落总数的测定菌落总数的测定7.大肠菌群的测定大肠菌群的测定8.生产环境检测生产环境检测无菌操作基本技术无菌操作基本技术用于防止用于防止微生物微生物
32、进入人体组织或其它进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌范围的操作技术称为无菌操作。无菌操作。如外科手术需防止细菌进入伤口及各种微生物实验中,为了防止其它微生物影响实验的进行,也要在无菌的环境下进行. 无菌操作的要求是无菌操作的要求是: 1操作前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭 2操作过程中是界面与外界隔离,避免微生物的侵入 一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。 二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。 三、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。 四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 五、无菌物品
33、必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。 六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期。七、在操作前2030分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。无菌操作原则无菌操作原则1.微生物检测
34、作业规范微生物检测作业规范 培养液配制完成后，杀菌前放入冰箱冷藏保存，但必须在48小时内对其进行分装杀菌使用。l已杀菌未开封的培养液在24小时内可直接使用；已杀菌未开封超过24小时或者已杀菌但开封而未用完的培养液都必须重新杀菌后使用。同一培养液反复杀菌不超过2次。l进入无菌间作业时必须做到：缓冲间、无菌间的紫外灯开启时间超过半小时；关闭紫外灯后，微检员把作业过程中将用到的所有物品放在缓冲间，同时在缓冲间更换专用的工作衣，同时佩戴口罩和卫生帽，然后再将物品转移到无菌间；作业时关闭紫外灯、空调、和无菌操作台风机；l完成作业后，立即做好相关标识、填写实验记录，然后清理无菌间。清理结束后，开启紫外灯杀
35、菌30分钟。l无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上只允许摆放以下物品： 物物 品品数数 量量物物 品品数数 量量酒精灯1个灭菌平皿10块打火机1个试管架2副接种针1个灭菌吸管根据需要消毒棉球1瓶电子称1台洗耳球1个250ml灭菌三角瓶2个镊子1个培养基根据需要油性笔1支混匀器1台 样品的采集样品的采集 1 所用接触样品的用具经过灭菌（所用接触样品的用具经过灭菌（不能用消毒不能用消毒剂消毒）剂消毒） 2 取样要均匀、特殊样品要控制温度取样要均匀、特殊样品要控制温度 3 样品采好后要贴上标签（注明：样品名称、样品采好后要贴上标签（注明：样品名称、来源、数量、采样人、地点及时来源、
36、数量、采样人、地点及时间）间）一般可保一般可保存在存在0-50-5的环境中，如果样品是冷冻食品，的环境中，如果样品是冷冻食品，应保持在冷冻状态，并及时送检。应保持在冷冻状态，并及时送检。 4 采好的样品送检不要超过采好的样品送检不要超过3小时小时2.微生物检测流程微生物检测流程3.3.常见卫生指标及致病菌常见卫生指标及致病菌细菌总数细菌总数大肠菌群大肠菌群霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌大肠杆菌大肠杆菌（肉制品）（肉制品）沙门氏菌沙门氏菌（禽、畜肉）（禽、畜肉）副溶血性弧菌（水产品）副溶血性弧菌（水产品）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌（剩饭）（剩饭）单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌（乳制品、冷藏食品）（乳制
37、品、冷藏食品）肉毒梭菌肉毒梭菌（发酵制品、肉制品）（发酵制品、肉制品）4.测定微生物的大小测定微生物的大小测量方法：测微尺测量方法：测微尺长度单位：微米长度单位：微米表示方法：球菌：直径表示方法：球菌：直径 杆菌：长杆菌：长* *宽宽 螺菌：长、宽螺菌：长、宽5.测定微生物数量测定微生物数量方法：活菌计数法方法：活菌计数法平板菌落计数法；总菌计数法平板菌落计数法；总菌计数法血球计数板或霍瑟血球计数板或霍瑟（Peroff HausserPeroff Hausser）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。已）。 6.菌落总数的测定菌落总
38、数的测定菌落的定义：菌落的定义：将细菌接种在固体培养将细菌接种在固体培养基上经基上经1824小时培养，长出肉眼可小时培养，长出肉眼可见的见的来源于一个细胞的来源于一个细胞的细菌集团。细菌集团。菌落总数：菌落总数：食品检样经过处理，在一食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得定条件下培养后，所得1ml（g）检样）检样中所含菌落的总数。中所含菌落的总数。检测意义：检测意义：菌落总数菌落总数常作为评价食品常作为评价食品被污染程度的一个重要指标。预测保被污染程度的一个重要指标。预测保质期。质期。菌落总数的检验程序菌落总数的检验程序25g(ml)样品样品+225ml生理生理盐水（盐水（0.85%）(1
39、:10的稀释液的稀释液)作几个适当倍数的稀释液作几个适当倍数的稀释液(例如例如1:100，1:1000)选择选择23个适宜稀释度个适宜稀释度各取各取1ml分别加入灭菌培养皿中分别加入灭菌培养皿中平皿中加平皿中加1520ml 营养琼脂营养琼脂（46），于于361培养培养48h 菌落记数菌落记数/报告报告GB 4789.2-2010 （1）以无菌操作，将检样25g（或25mL）剪碎以后，放于含有225mL灭菌生理盐水三角瓶内，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000r/min-100000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。 （2
40、）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。 （3）另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。 检样稀释及培养检样稀释及培养1 （4）对检样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 （5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46 营养琼脂培养基注入平皿15mL-20mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾
41、入加有1mL生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。 （6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（361）恒温箱内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。 检样稀释及培养检样稀释及培养2流程图流程图l菌落计算方法菌落计算方法可用肉眼观查，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数可用肉眼观查，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（量。菌落计数以菌落形成单位（CFU)表示表示.平板菌落数的选择平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在30300之间之间,无蔓延菌落生长的平板作为菌落总数。无蔓延菌落生长的平板作为菌
42、落总数。300的记录多不可计；每个稀释度应采用两个平板平均数；的记录多不可计；每个稀释度应采用两个平板平均数； 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数；以代表全皿菌落数； 平皿内如有菌落之间无明显界线，可视为一个菌落数；平皿内如有菌落之间无明显界线，可视为一个菌落数；报告报告
43、菌落总数计算方法菌落总数计算方法 若只有一个稀释度菌落在适宜计数范围内，计算平均值若只有一个稀释度菌落在适宜计数范围内，计算平均值X 稀释倍数；作为结果；稀释倍数；作为结果； 若两个连续稀释度的菌落都在适宜计数范围内时按公式计算：若两个连续稀释度的菌落都在适宜计数范围内时按公式计算： 报告报告 若所有稀释度平均菌落数均若所有稀释度平均菌落数均 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均若所有稀释度的平均菌落数均 300或或 30时，则以最接近时，则以最接近30或或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。的
44、平均菌落数乘以稀释倍数报告之。报告报告菌落数的报告菌落数的报告 菌落数菌落数 100内时，按四舍五入修约，以整数报告，内时，按四舍五入修约，以整数报告，100时，采用时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，第三位数以四舍五入方法二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，第三位数以四舍五入方法修约；取前两位数字，后面用修约；取前两位数字，后面用0代替，也可用代替，也可用10的指数表示；的指数表示； 若平板上为蔓延菌落无法计数，则报告菌落蔓延；若平板上为蔓延菌落无法计数，则报告菌落蔓延； 若空白上长菌，则实验失败；若空白上长菌，则实验失败； 称重以称重以CFU/g为单位报告，体积取样以为单位
45、报告，体积取样以CFU/ml为单位报告。为单位报告。报告报告 菌落总数检测注意事项：菌落总数检测注意事项： 1 操作要在无菌的状态下进行。操作要在无菌的状态下进行。 2 操作时间越短越好。操作时间越短越好。 3 样品不同选择的稀释倍数不同。样品不同选择的稀释倍数不同。 4 培养基冷却温度不宜过高或过低。培养基冷却温度不宜过高或过低。7.大肠菌群的测定大肠菌群的测定大肠菌群大肠菌群的定义：的定义：系指一群在系指一群在3724小时能发酵乳糖、产酸、产气、小时能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，该菌主要来源于人畜
46、粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。检测意义：检测意义：该菌主要来源于人畜粪便，故该指标体现了食品被粪便污该菌主要来源于人畜粪便，故该指标体现了食品被粪便污染的程度。染的程度。7.7.大肠菌群的测定大肠菌群的测定 基本概念基本概念 大肠菌群包括大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群的来源分粪便来源和非粪便来源，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群，粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，主要就是大肠杆菌
47、，但也包括克雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使其与粪便污染的相关性受到了影响。 大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但用途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标，粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。 大肠菌群表示方法：最可能数-MPN（ most probable number） /100mL 。 大肠菌群的测定流程大肠菌群的测定流程检样检样25g（ml）+225ml稀释液，均质稀释液，均质10倍系列，稀释选择适宜倍系列，稀释选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，个连续稀
48、释度的样品匀液，接种接种LST肉汤管肉汤管产气产气不产气不产气BGLB肉汤肉汤产气产气不产气不产气大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阳性查查MPN表表报告结果报告结果361 482h361482hGB 4789.3-20101.LST:月桂基硫酸月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤盐胰蛋白胨肉汤2.BGLB：煌绿乳：煌绿乳糖胆盐肉汤糖胆盐肉汤大肠菌群的测定步骤大肠菌群的测定步骤 检验稀释检验稀释 取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同。 初发酵试验初发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST,每管接种量为1ml。如接种量在1ml以上者,用双料LST。
49、置361温箱内,培养242h,观察倒管是否有气泡产生，产气者进行复发酵试验，如未产气者则继续培养至48 2h，产气者进行复发酵试验。未产气者报告大肠菌群阴性。 复发酵试验复发酵试验用接种环从产气的用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物一环，肉汤管中分别取培养物一环，接种于接种于BGLB管中，管中， 361温箱内,培养482h,观察倒管是否有气泡产生，产气者记为大肠菌群阳性管。 报告报告 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。大肠菌群的测定大肠菌群的测定 注意事项注意事项 初发酵阳性管，只能经过复发酵实验后，才有可能成为阳性。初发酵阳性管，只能经
50、过复发酵实验后，才有可能成为阳性。 在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生，复在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生，复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时导管内无气体，但在液面及管壁发酵却证实为大肠菌群阳性。有时导管内无气体，但在液面及管壁却可看到小气泡。却可看到小气泡。 如何避免放小倒管时产生气泡（大肠菌群检测）？如何避免放小倒管时产生气泡（大肠菌群检测）？ 客户要求大肠菌群客户要求大肠菌群ml(g),请问如何检测和报告？请问如何检测和报告？ LST发酵管和发酵管和BGLB发酵管在灭菌以后要检查小导管内有无气泡发酵管在灭菌以后要检查小导管内有无气泡,如如果有气泡就
