1、CMACMA芯片技术应用于辅助生殖植入前芯片技术应用于辅助生殖植入前/ /产前产前/ /产后产后先天性疾病诊断的初步应用先天性疾病诊断的初步应用 浙江大学医学院附属妇产科医院浙江大学医学院附属妇产科医院1出生时就有外表的、内部的结构异常或功能异常出生时就有外表的、内部的结构异常或功能异常我国出生缺陷率达我国出生缺陷率达5.6%每年新增出生缺陷约每年新增出生缺陷约90万例万例日益成为突出的公共卫生问题和社会问题日益成为突出的公共卫生问题和社会问题2出生缺陷出生缺陷遗传因素遗传因素环境因素环境因素（理、化、（理、化、生物因素生物因素、生活方式）、生活方式）遗传遗传+环境因素环境因素染色体异常染色体
2、异常（所有新生儿中，染色（所有新生儿中，染色体异常占体异常占0.92%，多为新发而非遗，多为新发而非遗传）传）单基因突变单基因突变（多为孟德尔遗传，少（多为孟德尔遗传，少数为新发）数为新发）3高危人群高危人群目标人群目标人群产前诊断产前诊断孕前诊断孕前诊断不孕人群不孕人群精子精子产后先天性疾病诊断产后先天性疾病诊断卵子卵子+胚胎胚胎胎儿胎儿新生儿、儿童新生儿、儿童4对胚胎或卵子行卵裂球或极体活检，作染色体和对胚胎或卵子行卵裂球或极体活检，作染色体和/ /或基因学检测，将无或基因学检测，将无疾病胚胎植入子宫妊娠，并出生正常子代的技术疾病胚胎植入子宫妊娠，并出生正常子代的技术辅助生殖与遗传学技术相
3、结合的一种产前诊断方法辅助生殖与遗传学技术相结合的一种产前诊断方法关键点是建立单细胞遗传诊断技术关键点是建立单细胞遗传诊断技术孕前诊断孕前诊断-植入前遗传学诊断技术植入前遗传学诊断技术(preimplantation Genetic Diagnosis, PGD)5在人类染色体研究历史上在人类染色体研究历史上,研究者一直致力于利用可视化的显微镜分析染色体研究者一直致力于利用可视化的显微镜分析染色体的完整性的完整性除了非整倍体，染色体微缺失、重复、扩增和等基因组除了非整倍体，染色体微缺失、重复、扩增和等基因组DNA失衡是导致胎儿失衡是导致胎儿发育迟缓、畸形、死胎、流产和其他先天性疾病的内在原因发
4、育迟缓、畸形、死胎、流产和其他先天性疾病的内在原因6是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术绒毛活检取材绒毛活检取材 孕中期羊膜腔穿刺羊水孕中期羊膜腔穿刺羊水 细胞培养细胞培养 染色体核型分析染色体核型分析对非整倍体和重大染色体结构异常诊断的准确率达到对非整倍体和重大染色体结构异常诊断的准确率达到99% 7材料受限，需要新鲜的组织、材料受限，需要新鲜的组织、血样进行血样进行活细胞培养活细胞培养不能分辨长度在不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、增加或易位以下染色体片断的缺失、增加或易位染色体亚端粒区域异常诊断率较低染色体亚端粒区域异常诊断率较低单细胞分析单细胞
5、分析 高分辨率分析高分辨率分析8荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（fluorescent in-situ hybridization，FISH)可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断 提高了染色体异常的诊断精度提高了染色体异常的诊断精度FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交-无需细无需细胞培养，可用于单细胞分析胞培养，可用于单细胞分析Chromosome 13q13-14Chromosome 21q21荧光标记的荧光标记的DNA探针探针中期分裂相中期分裂
6、相间期细胞核间期细胞核9FISH局限性局限性只能对有限的位点进行检测只能对有限的位点进行检测 FISH依赖于探针的设计，检测不明原因的病例难度较大依赖于探针的设计，检测不明原因的病例难度较大对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力 10 Metaphase chromosomesblastomerenormal 11normal 22der 11der 22Reciprocal translocation t(11;22)(q25;q12)Metaphase chromosomesblastomerenormal 13 normal 14 d
7、er 13-14Robertsonian translocation der(13;14)(q10;q10)FISH for structural aberrations2-colour FISH3-colour FISH11比较基因组杂交比较基因组杂交（ comparative genomic hybridization, CGH )1 1：1 1混合杂交于混合杂交于同个正常男性中期分裂相同个正常男性中期分裂相Cot-1 DNA双色荧光强度比分析双色荧光强度比分析 正常正常 DNADNA 病人病人 DNADNAGainLossLossLOSSGain121 1：1 1混合杂交于芯片（混合杂交
8、于芯片（BAC.OligoarrayBAC.Oligoarray，SNP)SNP)Cot-1 DNA计算机扫描，数据分析计算机扫描，数据分析 病人病人 DNADNA 正常正常DNADNAGainLossLoss微阵列比较基因组杂交技术（微阵列比较基因组杂交技术（ Array Comparative genomic hybridization，aCGH)1314aCGH优势优势结合了基因芯片和传统结合了基因芯片和传统CGH的优点的优点更高的分辨率：更高的分辨率： G-显带的分辨率：显带的分辨率：10Mb 传统传统CGH:5-10Mb Array CGH:100kb检测基因组的拷贝数变化检测基因组
9、的拷贝数变化，可对染色体非整倍体、微缺失或微重复或其他不平，可对染色体非整倍体、微缺失或微重复或其他不平衡的染色体异常检测衡的染色体异常检测能够对染色体异常进行精确定位能够对染色体异常进行精确定位结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测-PGS/PGD15161. 用于检测用于检测CNV的染色体芯片（的染色体芯片（CMA)在在下列情况应作为一线检测手段下列情况应作为一线检测手段v非已知综合症的多发畸形非已知综合症的多发畸形v非综合症型的发育迟缓非综合症型的发育迟缓/智力低下智力低下v孤独症谱系疾病孤独症谱系疾病2. 进一步明确发育迟缓、语
10、言发育落后和进一步明确发育迟缓、语言发育落后和其他尚不明确遗传学病因的症状其他尚不明确遗传学病因的症状3. 对于一些对于一些CMA检出不平衡的病例，建议检出不平衡的病例，建议用细胞遗传用细胞遗传/FISH进行确认，同时对父进行确认，同时对父母进行临床遗传评估和咨询母进行临床遗传评估和咨询17The American Journal of Human Genetics 86, 749764, May 14, 2010 21698例不明原因发育迟缓、低智，孤独症，多发畸形例不明原因发育迟缓、低智，孤独症，多发畸形芯片（芯片（CMA)检测：诊断率检测：诊断率15%-20%核型分析：诊断率仅核型分析：
11、诊断率仅3% 发育障碍和智力低下等先天疾病首选发育障碍和智力低下等先天疾病首选CMA18截止截止2011年，智力低下的年，智力低下的array CGH研究论文就达研究论文就达4370篇篇19CMACMA技术平台技术平台Affymetrix 芯片平台芯片平台 产前、产后检测产前、产后检测Bluegenome 芯片平台芯片平台 植入前胚胎检测植入前胚胎检测20CMACMA的应用的应用在辅助生殖临床上进行全染色体范围的非整倍体筛查在辅助生殖临床上进行全染色体范围的非整倍体筛查在反复自然流产原因分析在反复自然流产原因分析补充产前诊断的一个重要手段补充产前诊断的一个重要手段在智力低下、发育迟缓和体征多种
12、畸形儿童致病原因分析在智力低下、发育迟缓和体征多种畸形儿童致病原因分析在儿童自闭症原因分析在儿童自闭症原因分析21l高龄产妇高龄产妇l复植入失败复植入失败l复发性早期流产复发性早期流产l严重的男性不育症严重的男性不育症l父母为平衡易位、倒位携带者父母为平衡易位、倒位携带者非整倍体是辅助生殖低妊娠率和高流产率的主要因素，PGS的目的是识别整倍体的正常胚胎转移，以实现增加怀孕的机会CMACMA植入前胚胎遗传学筛查植入前胚胎遗传学筛查/ /诊断适应人群诊断适应人群22CMACMA产前诊断适应人群产前诊断适应人群希望更全面、更准确的了解胎儿染色体情况，以排除出生缺陷的可能性（希望更全面、更准确的了解胎
13、儿染色体情况，以排除出生缺陷的可能性（生长发育迟缓，智力低下、自闭症等原因）生长发育迟缓，智力低下、自闭症等原因）胎儿胎儿B B超检查发现结构异常，但染色体核型分析正常者超检查发现结构异常，但染色体核型分析正常者羊水染色体核型分析已发现异常，但无法确定异常染色体的确切位置或来羊水染色体核型分析已发现异常，但无法确定异常染色体的确切位置或来源者源者胎儿发现新发的染色体相互易位，需进一步排除微缺失者胎儿发现新发的染色体相互易位，需进一步排除微缺失者23CMACMA检测先天性疾病的适应症检测先天性疾病的适应症不同程度的智力低下不同程度的智力低下生长发育迟缓、语言发育迟缓生长发育迟缓、语言发育迟缓面容
14、异常面容异常内脏器官（如心脏、肾脏、生殖器）畸形内脏器官（如心脏、肾脏、生殖器）畸形认知认知/精神精神/行为问题（如多动症、自闭症）行为问题（如多动症、自闭症）24截止截止12年年10月，共收病人月，共收病人233例例植入前诊断病例植入前诊断病例7例例难免流产流产物分析难免流产流产物分析121例例产前诊断病例产前诊断病例50例例产后先天性疾病诊断产后先天性疾病诊断55例例CMACMA检测病例检测病例25植入前诊断病例植入前诊断病例反复流产反复流产反复反复IVF失败失败父母为平衡易位携带者父母为平衡易位携带者产前诊断病例产前诊断病例新发平衡易位胎儿，排除染色体微缺失新发平衡易位胎儿，排除染色体微
15、缺失父母为平衡易位携带者父母为平衡易位携带者B超诊断结构异常胎儿：脑部结构异常、先心、肾增大、单脐动超诊断结构异常胎儿：脑部结构异常、先心、肾增大、单脐动脉、羊水过多、淋巴水囊瘤脉、羊水过多、淋巴水囊瘤产后诊断产后诊断自闭症自闭症脑发育不全脑发育不全/智力低下智力低下先天性心脏病先天性心脏病26检测标本检测标本活检的单个卵裂球活检的单个卵裂球绒毛绒毛引产胎儿组织引产胎儿组织羊水羊水脐血脐血外周血外周血27SurePlex Bluegnome24SureBluegnomeBlueFuse Multi 28用用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)提取纯化提取纯化DNABlueg
16、nome CytoChip Focus Constitutional芯片芯片Affymetrix CytoScan HD & SNP 6.0Reference DNA: Normal Promega Male Normal Asian Male检测主要试剂检测主要试剂29主要步骤主要步骤30后续验证主要方法后续验证主要方法MLPAFISHPCR多重连接探针扩增技术多重连接探针扩增技术 (MLPA)31初步总结初步总结植入前诊断病例植入前诊断病例6例病人，共例病人，共32个胚胎进行了个胚胎进行了array CGH检测检测其中其中2例患者的所有胚胎检测结果异常，未获得可移植的正常例患者的所有胚胎检
17、测结果异常，未获得可移植的正常胚胎胚胎4例患者得到可移植的胚胎，例患者得到可移植的胚胎，2例获得成功妊娠，目前已孕例获得成功妊娠，目前已孕30周，继续妊娠中。周，继续妊娠中。32产前诊断病例产前诊断病例核型含衍生染色体的羊水标本全部检出染色体的异常来源核型含衍生染色体的羊水标本全部检出染色体的异常来源死胎或胚胎停育病例中死胎或胚胎停育病例中46.9%检出了染色体拷贝数增加检出了染色体拷贝数增加/减少，减少， 含含16,15,21，22,18号等染色体的非整倍体，染色体拷贝数增加的片号等染色体的非整倍体，染色体拷贝数增加的片段包括段包括4q13.2-q35.2，5p15.33，5p13.33，10q11.21，19p13.3-p13.2等，。等，。B超诊断结构异常引产胎儿组织超诊断结构异常引产胎儿组织30.4%可检出有临床意义的染色体微可检出有临床意义的染色体微缺失或微重复，其中大部分为常规染色体核型分析不易检出的病缺失或微重复，其中大部分为常规染色体核型分析不易检出的病例例33产后病例产后病例37.1%检出有临床意义的染色体微缺失、微重复，检出拷贝数减检出有临床意义的染色体微缺失、微重复，检出拷贝数减少的染色体片段包括少的染色体片段包括15q11.2，15q13.1，5p15.33-p4.3，11p11.2，5q11.2，16q23.3等等34
