1、农残检测常用方法技术要点农残检测常用方法技术要点卞红正卞红正安徽省农产品质量安全检测中心安徽省农产品质量安全检测中心农业部农产品质量安全监督检验测试中心（合肥）农业部农产品质量安全监督检验测试中心（合肥）农产品质量安全检测技术系列之农产品质量安全检测技术系列之主要内容速测方法3准确定性定量检测法4当前常用检测方法2前言1以前农残检测方法的颁布：国家标准化管理委员会颁布国家标准国家标准化管理委员会颁布国家标准（GBGB）; ;农业部颁布行业标准农业部颁布行业标准（NYNY）; ;国家进出口商品检验检疫总局颁布行业标准，编号国家进出口商品检验检疫总局颁布行业标准，编号为为SNSN。已颁布标准截至截
2、至目前，已颁布的农产品和食品农药残留检测方法目前，已颁布的农产品和食品农药残留检测方法标准共有标准共有39390 0多多个个。其中其中：国家标准国家标准9292个个，农业行业标农业行业标准准3535个个，商检行业商检行业标准约标准约270270个。个。前 言 根据根据20092009年年6 6月月1 1日实施的中华人民共和国食品安日实施的中华人民共和国食品安全法第二十一条和第二十二条的规定，今后凡涉全法第二十一条和第二十二条的规定，今后凡涉及食品安全的标准（八个方面），统一由及食品安全的标准（八个方面），统一由国务院国务院卫卫生行政部门部制定和颁布生行政部门部制定和颁布，国务院标准化行政部门，
3、国务院标准化行政部门提供国家标准编号提供国家标准编号 。 对现行的食用农产品质量安全标准、食品卫生标准、对现行的食用农产品质量安全标准、食品卫生标准、食品质量标准和有关食品的行业标准中强制执行的食品质量标准和有关食品的行业标准中强制执行的标准予以整合，统一公布为食品安全国家标准。标准予以整合，统一公布为食品安全国家标准。 农残检测方法标准全部统一为农残检测方法标准全部统一为食品安全食品安全国家标准。国家标准。前 言1.速测方法GB/T 5009.199-2003蔬蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测类农药残留量的快速检测NY/T 448-2001蔬菜蔬菜上有机磷
4、和氨基甲酸上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检酯类农药残毒快速检测方法测方法一、当前常用检测方法NY/T 761-2008蔬菜和水果中有机磷、蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定药多残留的测定QuEChERS Method（美国农业部农业（美国农业部农业研究服务中心）修订方法研究服务中心）修订方法NY/T 761-2008 、GB/T 19648-2006水果和蔬菜水果和蔬菜中中500种农药及相关化学品残留的测定种农药及相关化学品残留的测定 气相色谱气相色谱-质谱法质谱法、GB/T 20769-2008水果和蔬菜中水果和蔬菜中4
5、50种农药及相关化学品残留量的测定种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱液相色谱-串串联质谱法联质谱法等方法糅合在一起的实施细则等方法糅合在一起的实施细则2.准确定性定量检测法一、当前常用检测方法二、速测方法1快速检测程序试样试样检测检测 阴性阴性阳性阳性复测（两次以上）复测（两次以上）阴性阴性阳性阳性根据市场根据市场规定处理规定处理 准确定量准确定量定性定性分析分析二、速测方法GB/T 5009.199-2003NY/T 448-2001适用范围围 蔬菜（葱蒜、萝萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭茭白、蘑蘑菇菇和番茄含有抑制酶的植物次生物质质，易导导致假阳阳性；叶绿绿素高的也会会干扰扰，这两类这两
6、类可整株取样样） 适用叶菜(除韭菜)、果菜、豆菜、瓜菜、根菜(除萝萝卜、茭茭白等)方法速测测卡法(纸纸片法)和酶抑制率法(分光光度法)酶抑制率法(分光光度法)波长长412nm4103nm酶乙酰酰胆碱酯碱酯酶（用pH8磷酸缓缓冲液溶解）（3min吸光度变变化值值0.3，4冰箱保存不超过过4天）丁酰酰胆碱酯碱酯酶（用pH8磷酸缓缓冲液溶解）3min吸光度变变化值值0.40.8之间间底物硫代乙酰酰胆碱碱（蒸馏馏水溶解，4冰箱保存不超过过2周）碘碘化硫代丁酰酰胆碱碱（BTCI）（用pH8磷酸缓缓冲液溶解）显显色剂剂二硫代二硝基苯苯甲酸（DTNB）+碳碳酸氢钠氢钠缓缓冲液溶液，4冰箱保存二硫代二硝基苯苯
7、甲酸（DTNB）缓缓冲液溶解步骤骤取表面干净净的蔬菜或瓜果，叶菜类类取叶片部分，瓜果取表皮带带肉，剪成1cm左右见见方碎片。取样样1g置于小烧烧杯内内，加入5mL缓缓冲溶液，振荡荡1-2min，倒出并静并静置3-5分钟钟；于小试试管内内分别别加入2.5mL样样本提取液、100uL酶液、100uL显显色剂剂，摇匀摇匀后于37放置15min以上，加入100uL底物，应应立即倒入仪仪器比色皿中，记录记录3min吸光度变变化值值。取2g切碎的样样本（非叶菜类类取4g）放入提取瓶内瓶内，加入20mL缓缓冲液，振荡荡1-2min，倒出并静并静置3-5分钟钟；于小试试管内内分别别加入50uL酶液、3mL样样
8、本提取液、50uL显显色剂剂，于37-38下放置30min后分别别加入50uL底物，倒入比色皿中，用仪仪器测测定。结结果抑制率50%：阳阳性（阳阳性样样品需要重复检测复检测2次以上，若不合格, 用色谱谱、质谱质谱等进进一步定性定量分析）抑制率70%：阳阳性（阳阳性样样品应应有2次以上的重复检测复检测，若不合格, 用色谱谱、质谱质谱等进进一步定性定量分析）备备注1、当温当温度低于37时时，酶反应应速度放慢，加入酶液和显显色剂剂后反应时间应时间应该应该延长长，延长时间长时间的确定，应应以空白对对照测试测试3min吸光度变变化值值0.3方可进进行下一步操作。2、3min吸光度变变化值值0.3原因：酶
9、的活性不够够；酶的活性太低。3、样样品检测检测放置时间与时间与空白的时间应该时间应该一致。1、样样品检测检测放置时间与时间与空白的时间应该时间应该一致。2、丁酰酰胆碱酯碱酯酶对乐对乐果、甲基对对硫磷、毒死蜱蜱、二嗪嗪磷等农药农药不太灵灵敏，检检出浓浓度均在10mg/kg以上。二、速测方法2结果计算抑制率（抑制率（% %）= = 抑制率：酶被抑制的程度抑制率：酶被抑制的程度A Ac c 对照组对照组3min 3min 后与后与3min 3min 前吸光值之差前吸光值之差; ; A A 样本样本3min 3min 后与后与3min 3min 前吸光值之差。前吸光值之差。100cscAAA二、速测方
10、法3注意事项20112011年首届全省农产品质量安全检测技术人员大比武现场操作年首届全省农产品质量安全检测技术人员大比武现场操作评分细评分细则（农残速测类）则（农残速测类） (2011(2011年年) )中对中对取样部位、处理方法取样部位、处理方法等等内容进行详细内容进行详细的分项打分，这些打分项都是平时检测中需要注意的地方。的分项打分，这些打分项都是平时检测中需要注意的地方。适用范围：蔬菜（葱蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番适用范围：蔬菜（葱蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄含有抑制酶的植物次生物质，易导致假阳性；叶绿素高的也会干扰，茄含有抑制酶的植物次生物质，易导致假阳
11、性；叶绿素高的也会干扰，这两类可整株取样）这两类可整株取样） ；农药：有机磷和氨基甲酸酯类。；农药：有机磷和氨基甲酸酯类。所有操作步骤顺序、加液量、处理时间一定要严格按标准执行。所有操作步骤顺序、加液量、处理时间一定要严格按标准执行。建议使用同一批比色皿，不同批次的比色皿对结果可能存在影响。一建议使用同一批比色皿，不同批次的比色皿对结果可能存在影响。一批上机样品同时检测，共用一个对照。批上机样品同时检测，共用一个对照。 检测前一定要检查酶液活性（检测前一定要检查酶液活性（3min3min吸光度变化值吸光度变化值0.30.3）；酶液反复）；酶液反复解冻最多不超过两次解冻最多不超过两次, ,否则会
12、影响酶活性。否则会影响酶活性。二、速测方法4如何看待农残快速测定方法n 何为快速检测方法？ 指检测速度相对较快、便于现场筛查的检测方法。其主要适合于定性和半定量测定，检测准确度相对要差一些。n 法律地位 中华人民共和国农产品质量安全法第三十六条规定“采用国务院农业行政主管部门会同有关部门认定的快速检测方法进行农产品质量安全监督抽查检测，被抽查人对检测结果有异议的，可以自收到检测结果时起四小时内申请复检。复检不得采用快速检测方法。” 二、速测方法5农残速测与色谱、质谱等方法的结果比较n 时间时间：从：从20052005年至年至20072007年。年。n 项目项目：农业部开展的省份间农产品质量安全
13、例行监测互查。：农业部开展的省份间农产品质量安全例行监测互查。n 要求要求：承担任务的：承担任务的3737个部级中心分别用农残速测进行初步筛查，并把所有样个部级中心分别用农残速测进行初步筛查，并把所有样品用品用NY/T 761NY/T 761等方法进行色谱、质谱定量检测。等方法进行色谱、质谱定量检测。n 目的目的：想验证速测与色谱检测的相关性，如果有相关性，就可以先用速测初：想验证速测与色谱检测的相关性，如果有相关性，就可以先用速测初步筛查，然后把阳性（超标的）样品再用色谱等方法准确定量，那样可以大大步筛查，然后把阳性（超标的）样品再用色谱等方法准确定量，那样可以大大减少工作量。减少工作量。n
14、 结论结论：速测结果和色谱等定量检测结果几乎没有任何相关性。说白了就是速：速测结果和色谱等定量检测结果几乎没有任何相关性。说白了就是速测超标的，色谱检测不出来，速测不超标的，色谱可能会超标。因为没有什么测超标的，色谱检测不出来，速测不超标的，色谱可能会超标。因为没有什么相关性，农业部在省部级检测中心这个层级最终导致放弃速测方法。相关性，农业部在省部级检测中心这个层级最终导致放弃速测方法。所以，速测仅仅是法律认可的一项工作，不要较真，如被检方有异议，更所以，速测仅仅是法律认可的一项工作，不要较真，如被检方有异议，更不能拿速测阳性结果进行处罚和仲裁。不能拿速测阳性结果进行处罚和仲裁。二、速测方法6
15、为什么采用农残快速检测法 （非官方解释最实在的理解） 鲜活农产品不宜长时间保存，快速检测方法克服了当前所有准确定量方法（色谱、质谱方法等）检测周期过长的问题。【时限性考虑时限性考虑】 我国研究院所和各地市针对特殊样品，采用酶抑制法取得了与准确定量方法（色谱、质谱方法等）一致性结果。【所谓的科学依据所谓的科学依据】 快速检测方法是经过农业部会同有关部门认定发布的，经法律认可的方法，具有权威性和统一性（不过可靠性谈不上不过可靠性谈不上）。【法律依据法律依据】 快速检测方法所需设备简单，易掌握，平时运营成本相对较低，选用该法主要是从我国从业人员素质、经济状况的国情出发来考虑的（不可能要求大家都去买质
16、谱、色谱等设备）。【方法经济性、操控性方法经济性、操控性】 明知快速检测方法准确度不高，选用该法，主要是在县级、乡镇等一级进行普及，让经营户、老百姓发现有人在抓农产品质量安全，更主要的是起到震慑作用。【震慑作用震慑作用】【案例】河南省郑州市农残快速检测网络【案例】河南省郑州市农残快速检测网络三、准确定性定量检测法1基本步骤：u检测前工作准备检测前工作准备u提取提取u净化净化、浓缩定容、浓缩定容u标准溶液配制和测定标准溶液配制和测定u结果计算结果计算三、准确定性定量检测法2提取条件的优化：uQuEChERSQuEChERS方法选择方法选择单一单一乙腈为提取溶剂乙腈为提取溶剂。u含水量低或含糖量高
17、的样品应加入一定量的水后再含水量低或含糖量高的样品应加入一定量的水后再进行提取，以提高提取效率。进行提取，以提高提取效率。u乙腈对乙腈对N N- -三卤甲硫基杀菌剂类农药，具有降解作用，三卤甲硫基杀菌剂类农药，具有降解作用，如克菌丹、抑菌灵等；通过加入如克菌丹、抑菌灵等；通过加入1%1%的醋酸，调节的醋酸，调节pHpH值，值，能够抑制上述农药的分解。能够抑制上述农药的分解。三、准确定性定量检测法3盐析：u盐析盐析剂种类：氯化钠、醋酸钠和硫酸铵等；剂种类：氯化钠、醋酸钠和硫酸铵等；u盐析剂能与水结合使游离水分子减少，减少了农药盐析剂能与水结合使游离水分子减少，减少了农药在水相中的溶解度；在水相中
18、的溶解度；u盐析剂能减少有机溶剂在水中的溶解度；盐析剂能减少有机溶剂在水中的溶解度；u盐析剂能使水相的比重增大，有助于分离。盐析剂能使水相的比重增大，有助于分离。三、准确定性定量检测法4脱水剂的选择：u无无水硫酸镁吸水能力比无水硫酸钠高水硫酸镁吸水能力比无水硫酸钠高3 3倍倍。u无无水硫酸镁吸水的同时也放热，促进农药的萃取。水硫酸镁吸水的同时也放热，促进农药的萃取。无机盐无机盐加入量（加入量（g）乙腈中的水分乙腈中的水分（加入前，（加入前，%）乙腈中的水分乙腈中的水分（加入后，（加入后，%）NaCl2g / 27mL276.0Na2SO40.8g / 4mL63.9MgSO40.8g / 4m
19、L60.6三、准确定性定量检测法5净化剂的选择：uPSAPSA提供伯氨基和仲氨基，相比氨基更能去除基质提供伯氨基和仲氨基，相比氨基更能去除基质干扰；主要干扰；主要用来用来消除各种有机酸、色素以及一些糖和脂肪酸消除各种有机酸、色素以及一些糖和脂肪酸。为了。为了减少仪减少仪器的维护，往往在器的维护，往往在PSAPSA的基础上加的基础上加C18C18净化。净化。uPSAPSA可去除可去除9090以上的脂肪酸和以上的脂肪酸和5050左右的左右的色素。色素。uGCBGCB可去除可去除9090以上的色素，但对脂肪酸的净化能力仅有以上的色素，但对脂肪酸的净化能力仅有1010左右。对于一些含色素高的样品，将两
20、者联合左右。对于一些含色素高的样品，将两者联合使用。使用。但用量要但用量要适当适当，否则会，否则会吸附一些平面结构的农药，影响回收率，如六氯吸附一些平面结构的农药，影响回收率，如六氯苯、百菌清等。苯、百菌清等。净化剂净化剂去杂种类去杂种类PSAPSA糖、有机酸、色素等糖、有机酸、色素等C18C18油脂、非极性干扰物等油脂、非极性干扰物等GCBGCB色素、甾醇、非极性干扰物等色素、甾醇、非极性干扰物等方法1：NY/T 761-2008 方法名称及来源：方法名称及来源：蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留检测方法氨基甲酸酯类农药多残
21、留检测方法NY/T 761-2008NY/T 761-2008。 农药种类和个数：农药种类和个数：有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药药等共等共104种。种。 使用仪器：使用仪器：GC、LC。 检测步骤：检测步骤：依次依次5mL丙酮丙酮+正己烷正己烷(10+90), 5mL正己烷预淋正己烷预淋4 mL甲醇甲醇二氯甲烷二氯甲烷(1+99)预淋预淋方法1：NY/T 761-2008方法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和和GB/T 20769等综合法方法名称及来源：方法名称及来源： NY/T 761-2008NY/T 761-2008、
22、GB/T 19648-2006GB/T 19648-2006和和GB/T 20769-GB/T 20769-20082008等，其中以等，其中以GB/T 19648-2006GB/T 19648-2006为主。为主。农药种类和个数：农药种类和个数： 有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯类和有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯类和苯并咪唑类农药等苯并咪唑类农药等800800多种。多种。使用仪器：使用仪器： GCGC、LCLC、GC-MS/MSGC-MS/MS和和LC-MS/MSLC-MS/MS。 检测步骤：检测步骤：5mL乙腈乙腈+甲苯预淋甲苯预淋剩余约剩余约20mL乙腈乙腈+甲苯分甲苯分次
23、或次或1次倒入次倒入，淋洗小柱，淋洗小柱洗脱液用量洗脱液用量约为约为25mL25mL方法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和和GB/T 20769等综合法方法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和和GB/T 20769等综合法方法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和和GB/T 20769等综合法方法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和和GB/T 20769等综合法方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method方法名称及来源：方法名称及来源： 在美国农业部的在美国农业部的QuEChERS MethodQuEChERS Method基础上
24、做了基础上做了优化和调整。优化和调整。 农药种类：农药种类： 有机磷，有机氯，氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农有机磷，有机氯，氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药等多残留检测。药等多残留检测。使用仪器：使用仪器： GC-MS/MS GC-MS/MS、LC/MS/MSLC/MS/MS。方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method原理原理： 与固相萃取与固相萃取(SPE)(SPE)相似，都是利用吸附剂填料与相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。的目的。优点优点： 回收率高，对大量极性及挥发性的农药品种的回收率
25、高，对大量极性及挥发性的农药品种的回收率大于回收率大于85%85%；精确度和准确度高；可分析的；精确度和准确度高；可分析的农药范围广；速度快；溶剂使用量少，污染小，农药范围广；速度快；溶剂使用量少，污染小，价格低廉且不使用含氯化物溶剂；操作简便；使价格低廉且不使用含氯化物溶剂；操作简便；使用很少的玻璃器皿，装置简单。用很少的玻璃器皿，装置简单。方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method检测步骤：检测步骤：(1)(1)样品粉碎；样品粉碎；(2)(2)单一溶剂乙腈提取分离；单一溶剂乙腈提取分离；(3)(3)加入加入MgSOMgSO4 4等盐类除水；等盐类除水；(4)(4)加入乙二
26、胺加入乙二胺-N-N-丙基硅烷丙基硅烷(PSA)(PSA)等吸附剂除杂；等吸附剂除杂；(5)(5)上清液进行上清液进行GC-MS/MSGC-MS/MS、LC-MS/MS LC-MS/MS 检测。检测。 检测步骤：检测步骤：称取10g样品于50mL离心管中，加20mL乙腈,高速均质2 min吸取0.5mL上层提取液于15mL离心管中，加入0.5 mL50%甲醇水溶液，涡旋混匀振摇后,5000 r/min 离心35 min将8g氯化钠与无水硫酸镁混合粉末（重量比为1:1）倒入上述50mL离心管中吸取1.0mL上层提取液于10mL离心管中（离心管中含有40mg的PSA、40mg的C18、20mg的GCB、1mL甲苯），剧烈振摇后，静置5min。过0.22m微孔滤膜LC-MS/MS检测剧烈振摇剧烈振摇1min1min过0.22m微孔滤膜GC-MS/MS检测方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method方法方法3：优化后的：优化后的QuEChERS Method
