1、第二章第二章 基因工程原理基因工程原理第一节第一节 基因工程的概念及其主要内容基因工程的概念及其主要内容第二节第二节 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶第三节第三节 基因克隆的质粒载体基因克隆的质粒载体第四节第四节 目的基因的分离目的基因的分离第五节第五节 基因与载体的重组与导入受体细基因与载体的重组与导入受体细 胞胞第六节第六节 重组体的筛选重组体的筛选第一节第一节 基因工程的概念及其主要内容基因工程的概念及其主要内容基因决定性状（一）青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素基因决定性状（二基因决定性状（二) )家蚕能够吐出蚕丝为人类利用基因决定性状（三基因决定性状（三）v豆科植物的根瘤能够固
2、定空气中的氮定向基因改造设想 一一 基因工程概念基因工程概念基因工程：在生物体外，通过对在生物体外，通过对DNADNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基 因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的基因产物基因工程基因工程(gene engineering)(ge
3、ne engineering)常和常和以下名称混用以下名称混用遗传工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因操作(gene manipulation);重组DNA技术(recombination DNA technique)克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。二、基因工程的主要内容或（步骤）二、基因工程的主要内容或（步骤）1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切
4、消化或PCR扩增扩增等步骤，分离出带有目的基因的等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。片段。2、在体外，将带有目的基因的外源、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。分子。3、将重组、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的分子的受体细胞克隆。受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，
5、提取出已经得到扩增的、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。基因工程过程示意图由此可见，一个完整的基因工程包括基因的分离、重组、转移，基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程。基因工程的实施至少要有4个必要的条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。三、基因工程技术及其应用三、基因工程技术及其应用供体细胞目的基因载体
6、重组DNA分子转化细胞受体细胞多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断 转基因动物(畜牧业、渔业 生物反应器)转基因植物(农业、林业 生物反应器)冶金、环保轻工、食品转基因植物转基因植物转基因动转基因动物作为生物作为生物发生器物发生器第二节第二节 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶基因工程的工具酶就其用途可分为基因工程的工具酶就其用途可分为3大类，大类，即限制性内切酶、连接酶和修饰酶。即限制性内切酶、连接酶和修饰酶。2.1 2.1 限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶(restriction endonuclease)是一类以环状或线形双是一类以环状或线形双链链DNA为底物，能识别为底
7、物，能识别DNA中特定的核中特定的核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有链的一个磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和和5-P集团集团DNA片段的内脱氧核苷酸片段的内脱氧核苷酸酶。酶。 2.1.12.1.1限制性内切酶在限制性内切酶在DNADNA分子上的识别分子上的识别序列序列限制性内切酶在双链限制性内切酶在双链DNA分子上能识别分子上能识别的特定核苷酸序称之为识别序列，有时的特定核苷酸序称之为识别序列，有时称之为识别位点。识别序列多数由称之为识别位点。识别序列多数由4、5、6个核苷酸组成，如个核苷酸组成，如Dpn、Apy和和EcoR
8、的识别序列分别是的识别序列分别是GATC、CCTGG和和GAATTC。 2.1.2 2.1.2 限制性内切酶的酶切位限制性内切酶的酶切位点点限制性内切酶具有特定的酶切位点，即限制限制性内切酶具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。进行切割，由此产生特定的酶切末端。 不同限制性核酸内切酶切割的三种情况不同限制性核酸内切酶切割的三种情况1.产生产生3突出粘性末端（突出粘性末端（cohesive end):以以EcoR I为例：为例： 5-G AATTC-3 5-GP OHAATTC-3 3-CATAA
9、A G-5EcoR I 3-CTTAAOH PG-52.产生产生5突出粘性末端突出粘性末端:以以Pst I为例：为例： 5-CTGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3 3-G ACCTC-5 Pst I 3-GOH p ACGTC-53.产生平末端（产生平末端（blunt end): 以以Nru I为例：为例： 5-TCG CGA-3 5-TCGp OHCGA-3 3-AGC GCT-5 Nru I 3-AGCOH pGCT-5v 一种限制酶只能识别一种特定的核苷一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将酸序列，并在特定的切割点上将DNA DNA 分分子切断。目前已发现
10、的限制酶有子切断。目前已发现的限制酶有200200多多种。种。几种最常用的限制性核酸内切酶限 制 性 核 酸 内 切 酶 名 称 识 别 序 列 和 切 割 位 点 B a m H G G A T C C C la A T C G A T E c o R G A A T T C H in d A A G C T T H in d G T P y P u A C K p n G G T A C C N o t G C G G C C G C P s t C T G C A G S a l G T C G A C S a u 3 A G A T C S f i G G C C N N N N N
11、G G C C S m a C C C G G G X b a T C T A G A X h o C T C G A G EcoRI binds to the GAATTC sequence andcuts the DNA, creating DNA fragments.2.1.3 2.1.3 限制性内切酶反应系统限制性内切酶反应系统限制性内切酶反应底物是限制性内切酶反应底物是DNA分子，但只含识分子，但只含识别序列的寡核苷酸是不会被切割的。如只含别序列的寡核苷酸是不会被切割的。如只含GAATTC的寡核苷酸不会被的寡核苷酸不会被EcoR切割，只切割，只有在识别序列两侧个延伸有在识别序列两侧个
12、延伸1个或几个核苷酸后个或几个核苷酸后才能被才能被EcoR切割。所以人工合成的切割。所以人工合成的EcoR连杆不是连杆不是GAATTC，而是，而是GGAATTCC。限制。限制性内切酶反应系统的缓冲液因酶而异性内切酶反应系统的缓冲液因酶而异,常用的常用的缓冲液有缓冲液有A、B、L、M、H等几种，厂家出售等几种，厂家出售限制性内切酶时提供相应的缓冲液。限制性内限制性内切酶时提供相应的缓冲液。限制性内切酶反应温度多数是切酶反应温度多数是37，少数低于或高于，少数低于或高于37。2.2 DNA2.2 DNA连接酶连接酶用于将两片段乃至数段用于将两片段乃至数段DNA片段拼接起片段拼接起来的酶称为来的酶称
13、为DNA连接酶。基因工程中最连接酶。基因工程中最常用的酶是常用的酶是T4DNA连接酶，它催化连接酶，它催化DNA5磷酸基与磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯羟基之间形成磷酸二酯键，其用途是：键，其用途是：连接带匹配粘末端的连接带匹配粘末端的DNA分子。分子。使平端的双链使平端的双链DNA分子互相连接或与合分子互相连接或与合成的寡核酸头相连接。成的寡核酸头相连接。 DNADNA连接酶的作用过程连接酶的作用过程2.3 2.3 用于基因工程中的修饰酶用于基因工程中的修饰酶2.3.1 DNA 2.3.1 DNA 聚合酶聚合酶目前常用的目前常用的DNA 聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶、
14、大肠杆菌大肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶大片段（大片段（Klenowfragment）、噬菌体聚合酶、噬菌体）、噬菌体聚合酶、噬菌体聚合酶以及耐高温的聚合酶（如聚合酶以及耐高温的聚合酶（如TaqDNATaqDNA聚合酶）等。聚合酶）等。 反转录酶是一种依赖于的聚合酶。反转反转录酶是一种依赖于的聚合酶。反转录酶在基因工程中的用途主要是以真核录酶在基因工程中的用途主要是以真核mRNA为模板为模板合成合成cDNA，用于组建，用于组建DNA文库文库,进而分离为特定蛋进而分离为特定蛋白质编码的基因。另外，将与偶联建白质编码的基因。另外，将与偶联建立起来的反转（），使真核基因立起来的反转（），使真核基因的分离
15、更加有效。的分离更加有效。DNA聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于加于DNA分子的分子的羟基端，主要用于给载体或羟基端，主要用于给载体或cDNA加上加上互补的同聚尾，便于外源基因重组。互补的同聚尾，便于外源基因重组。第三节第三节 分子克隆的质粒载体分子克隆的质粒载体 质粒的一般生物学特性；质粒的一般生物学特性；质粒质粒DNA的分离与纯化；的分离与纯化；质粒载体的构建及类型；质粒载体的构建及类型；常用质粒载体举例；常用质粒载体举例；一、质粒的一般生物学特性一、
16、质粒的一般生物学特性（一）、质粒（一）、质粒DNA1、质粒质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒质粒。R质粒可将其抗性转移到质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。能力。2、质粒、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上
17、，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3、质粒、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4、环形双链的质粒、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环），开环DNA（ocDNA），线性）
18、，线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开开。（二）、质粒的拷贝数与不亲和性（二）、质粒的拷贝数与不亲和性1 1、质粒的拷贝数质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。目。 根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-51-5个）与松个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-20010-200份拷贝）。因份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型
19、的。此，作为载体的质粒应该是松弛型的。2 2、质粒的不亲和性质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。二、质粒二、质粒DNADNA的分离与纯化的分离与纯化三、质粒载体的构建及类型三、质粒载体的构建及类型质粒
20、载体的发展概况；质粒载体的发展概况；质粒载体的特点（基本条件）；质粒载体的特点（基本条件）；遗传标记基因遗传标记基因质粒载体的类型质粒载体的类型（一）发展概况（一）发展概况 1. 第一阶段（第一阶段（1977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒天然质粒和重组质粒的利用，如的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载系列载体。体。 3.3.第三阶段
21、：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 （二）载体特点（二）载体特点1、 至少有一个复制起点，因至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自而至少可在一种生物体中自主复制。主复制。2、 至少应有一个克隆位点，至少应有一个克隆位点，以供外源以供外源DNA插入。插入。3、 至少应有一个遗传标记基至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。分子是
22、否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高、具有较小的分子量和较高的拷贝数。的拷贝数。注：前三个特点必不可少注：前三个特点必不可少。pBR322pBR322BamBam HIHISalSal I IHinHin dIIIdIIIPstPst I IScaSca I IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)（三）遗传标记基因（三）遗传标记基因1、 标记基因的作用标记基因的作用 1）指示外源）指示外源DNA分子（载体或重组分子）分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可
23、），也可以是非选择性的（如以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源）指示外源DNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。 * 这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的（如的（如TcS），也可以是），也可以是非选择性非选择性的（的（lacZ），绝大多数为后者。），绝大多数为后者。 2 2、 标记基因的种类标记基因的种类 1 1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子） 主要是主要是抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Amp: Ampr r ，TetTetr r ，CmlCmlr r，KanKanr r，StrStrr r 2 2）
24、生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ3、常用的遗传标记基因及其作用机制、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因四环素抗性基因（ TetTetr r ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白蛋白质，与细菌细胞膜结合，质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入阻止四环素分子进入细菌细胞。细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因
25、氨苄青霉素抗性基因（ AmpAmpr r ，Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切切割割氨苄青霉素的氨苄青霉素的内酰胺环，使氨苄青霉素失活。内酰胺环，使氨苄青霉素失活。3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（ CmlCmlr r ，Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白亚基上，阻止蛋白质合成。质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移
26、酶，使氯霉素乙酰乙酰化化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4) 卡那霉素卡那霉素(Kanr), 新霉素新霉素(Neor)和和G418抗性抗性(G418r)基因基因 Kanamycin，Neomycin和和G418均属脱氧链霉胺氨基葡均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等等抗性基因均可使这类抗生素抗性基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化，使之不能进入细，使之不能进入细胞内。胞内。5）半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ ） lacZ中含有多克隆位点，当无外源中
27、含有多克隆位点，当无外源DNA片片段插入时，质粒表达段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽，与肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码缺失突变体宿主菌（不能编码-肽）表达的肽）表达的lacZ基因产物（基因产物（ 链）互补，产生有活性的链）互补，产生有活性的半乳半乳糖苷酶，在含有指示剂糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂和诱导剂IPTG的存的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了了lacZ -肽基因的结构，细菌内不能产生肽基因的结构，细菌内不能产生半半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 P LacZ LacZ 转录转录 翻译翻
28、译 LacZ基因的结构与产物基因的结构与产物pUC18 BamHI片段片段重组重组DNADNA分子分子 转化转化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap的平板上的平板上,白色菌落为重组白色菌落为重组子，子，兰色菌落兰色菌落为为原载体原载体利用利用LacZ基因筛选重组子基因筛选重组子（四）、质粒载体的类型1 1、根据载体的分子生物学特性划分、根据载体的分子生物学特性划分 （1 1）. 质粒型载体质粒型载体环状环状dsDNAdsDNA分子，自主分子，自主复制复制 （2 2）. 病毒型载体病毒型载体环状、线状、环状、线状、ss
29、-ss-和和dsds- -DNADNA分子，形成病毒颗粒分子，形成病毒颗粒 （3 3）. .混合型载体混合型载体具质粒和病毒特性，特具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性性的转换依赖于宿主细胞生物学特性 2、根据载体功能划分、根据载体功能划分 （1）. 普通型载体普通型载体 1) 特点特点: 至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一中一 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。 2) 用途用途: 基因组或基因组或cDNA文库的构建文库的构建;次克隆次克隆(subcloning)或限制酶谱分析；
30、外源或限制酶谱分析；外源DNA扩增。扩增。 例子例子: pBR322和和pUC载体。载体。 上述两例中的非重组子来源有两个：上述两例中的非重组子来源有两个： a. 酶切反应时仍未被作用的酶切反应时仍未被作用的pBR322或或pUC18分子分子 b. b. 酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子普通型载体普通型载体pBR322的结构图的结构图pBR322pBR322BamBam HIHISalSal I IHinHin dIIIdIIIPstPst I IScaSca I IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)pUC18和和
31、pUC19载体载体EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r（2）、表达型载体（）、表达型载体（expression vector） 1) 特点特点: a. 基因的启动子序列和终止子序列；基因的启动子序列和终止子序列； b. 一般无检测标记基因；一般无检测标记基因； c. 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）； d. 重组分
32、子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。 2) 结构结构: a. 转化单元转化单元-宿主细胞转化宿主细胞转化 b. 表达单元表达单元-外源基因表达外源基因表达 3) 类型类型: 型型：转录起始区（调控序列：转录起始区（调控序列+启动子）启动子）+ 终止子终止子 型型: 转录起始区转录起始区 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）密码子）+ 终止子终止子 型型: 转录起始区转录起始区 + 翻译起始区翻译起始区 + 信号肽链编码区信号肽链编码区 + 终止子终止子（常称之为表达分泌型载体）（常称之为表达分泌型载体）三种表
33、达型载体结构图三种表达型载体结构图TAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III VIIIIIIOri转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区CSCSCSCS-cloning site 显然显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定被表达的外源基因一旦确定, 表达表达载体的类型也就确定了。载体的类型也就确定了。 4) 用途用途: a. 表达外源基因以产生大量外源基因产物表达外源基因以产生大量外源基因产物 b. 用于构建用于构建cDNA文库文库 四、常
34、用质粒载体举例1 1、pBR322pBR322载体载体2 2、pUCpUC载体载体1 1、pBR322pBR322载体载体优点：优点：1 1、分子量较小，为、分子量较小，为4363bp4363bp，不仅利于自身不仅利于自身DNADNA的纯化，的纯化，可容纳的外源可容纳的外源DNADNA也较大。也较大。2 2、具有两种抗菌素抗性基因、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。可供转化子的选择记号。3 3、具有较高的拷贝数，经过、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中氯霉素扩增后，每个细胞中可累积可累积1000-30001000-3000个拷贝，个拷贝，为重组体为重组体DNADNA的制备
35、提供了的制备提供了极大的方便。极大的方便。pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)筛选重组子的示意图筛选重组子的示意图重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切 BamHI片段片段(Tcr) pBR322PstI(Apr)片段片段 重组分子重组分子I 重组分子重组分子(Aps Tcr) (A
36、pr Tcs） PstI片段片段 外源外源DNABamHI片段片段重组分子重组分子I 涂布涂布Ap平板平板 Apr转化子转化子 分别转化分别转化E.coli(ApS TcS) 重组分子重组分子 涂布涂布Tc平板平板 Tcr转化子转化子影印到影印到Tc平板上平板上 Apr TcS为重组子为重组子Apr Tcr为原载体为原载体 影印到影印到Ap平板上平板上 ApS Tcr为重组子为重组子 即为非重组子即为非重组子利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程2、pUC18和和pUC19 pUCpUC系列质粒载体具有三个显著特点：系列质粒载体具有三个显著特点： （1 1）、分子
37、量更小，仅为）、分子量更小，仅为2.7KB2.7KB，容纳外源，容纳外源DNADNA量增大；具有更量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700500-700个拷贝）。个拷贝）。 （2 2）、含易于检测是否有外源）、含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因LacZLacZ，可，可利用利用 - -互补原理进行蓝白筛选。互补原理进行蓝白筛选。 （3 3）、多克隆位点区（）、多克隆位点区（MCSMCS） 由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性
38、末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源外源DNADNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。效率，又可以定向克隆。 其其MCSMCS区与区与M13mpM13mp噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使pUCpUC上克隆的目的上克隆的目的基因直接转移到基因直接转移到M13mpM13mp载体，进行载体，进行DNADNA测序和体外突变等研究。测序和体外突变等研究。pUC18和和pUC19载体载体EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I
39、I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r利用菌落颜色筛选重组子利用菌落颜色筛选重组子AprAprApr转化筛选重组子 白色菌落2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA重组DNA提取DNA 电泳AprAprApr1)限制酶切分子克隆载体的选择分子克隆载体的选择1. 选择克隆载体的几个重要参数选择克隆载体的几个重要参数（1 1）实验对象）实验对象 （2 2）实验性质）实验性质（3 3）载体容量）载体容量（4 4）合适克隆位点）合
40、适克隆位点（5 5）载体的稳定性）载体的稳定性（6 6）载体）载体DNADNA制备的难易制备的难易（7 7）外源基因表达产物产量、产物特点等）外源基因表达产物产量、产物特点等2. 实验对象实验对象（1 1）供体：遗传背景与）供体：遗传背景与DNADNA特点等，其中包括染色体特点等，其中包括染色体DNADNA大小，基大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。的传递方式等。（2 2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式递方式( (包括人
41、为的方法包括人为的方法) )，DNADNA限制修饰系统，限制修饰系统，DNADNA重组基因特重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。如常用于基因工程的宿主菌如常用于基因工程的宿主菌E.coliE.coli，菌株不同，基因型亦不同，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：不同载体要求不同菌株。如： E.coliE.coli DH5DH5、 E.coliE.coli DH5 DH5、 E .coliE .coliDH5FDH5F 1 1） 三者均有限制三者均有限制- -修饰系统和重组基因缺陷，外源修饰系统和重组基因缺陷，外源D
42、NADNA可存活，可存活，且不发生重组且不发生重组2 2） DH5 DH5和和 DH5FDH5F都具有一个可供遗传标记都具有一个可供遗传标记lacZlacZ检测的遗检测的遗传背景传背景3 3） DH5F DH5F可供可供M13mpM13mp系列载体配套使用，系列载体配套使用，M13M13病毒的感染需要病毒的感染需要 FF的存在的存在3. 实验性质实验性质分子克隆的一般程序包括以下几步：分子克隆的一般程序包括以下几步： （1 1）分离供体）分离供体DNADNA或或RNARNA（mRNAmRNA）和载体）和载体DNADNA （2 2）构建基因文库或）构建基因文库或cDNAcDNA文库文库 （3 3
43、）目的基因或）目的基因或cDNAcDNA 克隆的筛选克隆的筛选 （4 4）目的基因或）目的基因或cDNAcDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等 （5 5）基因表达与调控机理的研究）基因表达与调控机理的研究1) 1) 建立文库用载体建立文库用载体 常在常在E.coliE.coli 进行进行 i.i.目的基因与供体基因大小目的基因与供体基因大小 小小质粒载体，操作方便，鉴定简单质粒载体，操作方便，鉴定简单 大大或或coscos质粒载体质粒载体, , 甚至甚至pYACpYAC载体载体( (为减少文库规模，即使基
44、因为减少文库规模，即使基因组小的也可用组小的也可用和和coscos载体）载体） ii.ii.筛选方法筛选方法 )互补法：可表达互补法：可表达, ,选一般载体选一般载体; ;不表达，选表达载体不表达，选表达载体( (外源基因必外源基因必须表达，表达产物必须具备活性须表达，表达产物必须具备活性) ) ) )免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性 )杂交法：各种载体均可杂交法：各种载体均可2) 2) 目的基因的鉴定目的基因的鉴定 次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等 定序：定序载体（定序：定
45、序载体（M13mpM13mp系列），其他质粒载体（如系列），其他质粒载体（如pUCpUC系列，系列，pBR322pBR322，T3T3，T7T7，SP6SP6启动子载体）启动子载体）3) 3) 基因表达与调控基因表达与调控 外源基因可表达外源基因可表达普通载体普通载体; ; 不表达不表达表达型（分泌）载体表达型（分泌）载体 4.4. 载体容量载体容量 M13mpM13mp载体载体 4 kb4 kb 细菌质粒载体细菌质粒载体 10kb 10kb 载体载体 23kb23kb cos cos质粒载体质粒载体 48kb48kb P1 P1载体载体 95 kb95 kb pYAC pYAC载体载体 1000 kb1000 kb5.5. 合适的克隆位点合适的克隆位点 单克隆位点和多克隆位点单克隆位点和多克隆位点
