1、微生物作为遗传研究材料的优越性微生物作为遗传研究材料的优越性作为遗传研究材料具有独特优势，了解微生物遗传研究有助于理解多年来分子生物学、分子遗传学理论发展。 世代周期短，繁殖世代所需时间短； 易于操作管理和进行化学分析(纯培养与代谢产物累积)； 便于研究基因的突变(表现与选择)； 便于研究基因的作用(突变型生长条件与基因作用)； 便于研究基因的重组(重组群体大、选择方法简便有效)； 遗传物质比较简单，可作为研究高等生物的简单模型； 在研究基因结构、功能与表达调控时更为简便。同时：微生物的应用领域日益扩大、成就突出(微生物工程)；在遗传工程(包括动植物)中，作为重要研究材料、工具，也具有决定性作
2、用。第六节 细菌的遗传分析1ppt课件二、细菌遗传的实验研究方法(一) 细胞计数(培养物细胞浓度)(二) 建立纯系的方法(三) 选择培养法鉴定突变型与重组型(四) 突变型与重组型的批量筛选方法2ppt课件( (一) ) 细胞计数( (培养物细胞浓度) )培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实验技术，其基本思路是： 对原培养物进行连续稀释； 进行平板涂布（或混合倒平板）培养； 由于每个细胞形成一个菌落，计数菌落数； 根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。3ppt课件( (二) ) 建立纯系的方法纯培养4ppt课件( (三) ) 选择培养法鉴定突变型与重组型许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养
3、条件有关。营养缺陷型的筛选、鉴定： 选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原生营养型)与营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长)。其它突变类型的筛选、鉴定： 对于其它的突变类型(如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。5ppt课件( (四) ) 突变型与重组型的批量筛选方法选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，仅采用选择培养法要进行多次试验才能够达到目的、效率太低。为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了影印培养法。 该方法原理与选择培养法一致，但是采
4、用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选择培养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。6ppt课件 细菌的基因组 nucleoid(+plasmid)nucleoid(+plasmid)1 1 结构: : P107 环状双链DNADNA，单倍性，以折叠或螺旋状态存在； 2 2 大小：长约25035000 m( (未螺旋) )； 3 3 复制方式：着膜式复制。 分裂特点：均等分裂，无基因重组。7ppt课件Plasmid p108-1098ppt课件图图7-3大肠杆菌染色体的基本结构图解大肠杆菌染色体的基本结构图解9ppt课件 细菌的突变型( (一) )合成代谢功能的突变型 ana
5、bolic functional mutants: : 营养缺陷型，auxotroph, X-( (二) )分解代谢功能的突变型： c catabolic functional mutants: : laclac- -等( (三) )抗性突变型 resistant mutants 1 1 抗药性突变型: : 青霉素: penr, pens 链霉素: strr, strs penicillinStreptomycin抗性抗性: resistance 敏感敏感: sensitive， susceptive 2 抗噬菌体突变型抗噬菌体突变型 T1噬菌体噬菌体 Tonr Tons T2噬菌体噬菌体 T
6、tor Ttos T6噬菌体噬菌体 Tsxr Tsxs10ppt课件 突变型的筛选例如： 营养缺陷型的筛选: u.v : u.v 野生型细菌 完全培养基： 影印培养基本培养基： 补充培养基 ： 氨基酸类 维生素类 系列氨基酸补充培养基：赖氨酸 脯氨酸 精氨酸. .CMMMSM影印实验（影印实验（replica plating ）Joshua Lederberg & Esther Lederberg（1952）11ppt课件在细菌中遗传物质有三种转移的形式。转化（transformation）接合（conjugation）转导（transduction）其共同特点是：（1）单方向转移；（2）都产
7、生部分二倍体；（3）外源基因只有整合到环状染色体上才能稳定地遗传。 12ppt课件13ppt课件(一) 细菌转化实验 (二) 转化过程(三) 共转化与遗传图谱绘制 转转 化化一、一、 细菌的转化与作图细菌的转化与作图转化(transformation) ：指外源DNADNA片段不经中间媒介体直接进入感受态细胞进行基因重组形成重组体的过程。转化子：通过转化而形成的重组体。P99 P99 证明证明DNADNA是遗传物质的经典是遗传物质的经典实验一：转化实验实验一：转化实验14ppt课件感受态与感受态因子： 感受态感受态指细菌能够从周围环境中吸收指细菌能够从周围环境中吸收DNADNA分子进行转化的生
8、理状态。分子进行转化的生理状态。 感受态主要受一类蛋白质感受态主要受一类蛋白质( (感受态因子感受态因子) )影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。 一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用态，以大肠杆菌为例，用CaCa2+2+( (如如CaClCaCl2 2) )处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感处理对数生长后期
9、的大肠杆菌可以增强其感受能力。受能力。15ppt课件按照细菌出现感受态的方式，可把转化分为三种类型1.自然转化(naturally occuring transformation)：细菌自发地出现感受态，如肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，枯草杆菌等。2.人 工 诱 导 的 感 受 态 ( a r t i f i c i a l l y i n d u c e d competence)：如Ca2+诱导的大肠杆菌等发生的转化。3.原生质体转化(protoplast transformation)：将DNA分子连同PEG一同加入原生质体，造成细胞摄取DNA。还可以用电穿孔法(electroporatio
10、n)代替PEG，用高压脉冲电流在细胞膜上击成小孔，使DNA分子通过小孔而导入细胞，又称为电转化。可适用于多种细菌，放线菌和真核细胞的转化。2和3：工程转化（engineered transformation） 16ppt课件转化过程17ppt课件18ppt课件图图7-13细菌转化的机制细菌转化的机制19ppt课件通过转化可以测定基因的连锁、基因的排列顺序以及图距。原理如下：如果在供体的染色体上有两个离得很远的基因a和b，我们将会发现它们总是在不同的DNA片段上，这样如果有 一 个 ab供 体 和 a b 受 体 ， 那 共 转 化（cotransformation）即两个基因同时转化的概率是由
11、两个基因单独转化的概率的乘积。若每个基因的转化频率是103的话，那么这两个基因同时被转化的频率应为103103106。如果两个基因离得很近，有可能位于同一个DNA片段上，那么它们共转化的频率将接近于单个基因转化的频率。若共转化的频率要比两个单个基因转化频率相乘积高的话，那么这两个基因一定是紧密连锁的。 ( (三) ) 共同转化与遗传图谱绘制20ppt课件基因的顺序也可以通过共转化的结果来分析确定，例如p和q常常共转化，而q和o也常常共转化，但基因p和o从未发生共转化，那么这三个基因的顺序一定是p q - o。由于转化片段的大小是可以控制的，因此两个基因共转化的频率可以和转化片段的平均大小相等。
12、通过转化片段平均大小相关的共转化频率测定，就可以获得这些基因的连锁图谱。21ppt课件利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理： 相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。 因此可能通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。2 转化基因间重组值的计算 a a、b b单个整合个体数 a a、b b单个整合+ +同时整合总体数重组值重组值= = = = (+ -)+(- +)(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +) P93 q21P93 q2122ppt课件出现野生型菌落的可能
13、原因： 回复突变；转化；互养； 细菌间发生了基因重组 细菌的接合与染色体作图细菌的接合与染色体作图23ppt课件几种可能解释及其分析对上述试验结果原养型菌落可能产生于： 亲本细菌亲本细菌A A或或B B发生了发生了回复突变回复突变； 两品系细胞通过培养基交换养料两品系细胞通过培养基交换养料互养作用互养作用； 两品系间发生了两品系间发生了转化作用转化作用； 发生细胞融合，形成了发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。24ppt课件回复突变可能的排除Lederberg和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验
14、，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。 单基因回复突变的频率约为单基因回复突变的频率约为1010-6-6； 双基因回复突变的频率则为双基因回复突变的频率则为1010-12-12，频率很低。，频率很低。 但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基本可但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基本可以排除回复突变的可能。以排除回复突变的可能。25ppt课件互养作用及其排除试验材料： A A品系：品系：A A- -B B+ + T T1 1s s( (metmet- -biobio- -thrthr+ +leuleu+ +T T1 1s s) )； B B品系：品系：A A+
15、 +B B- - T T1 1r r( (metmet+ +biobio+ +ththr r- -leuleu- -T T1 1r r) )。试验方法： 将将A A、B B品系混合接种在基本培养基表面；品系混合接种在基本培养基表面； 短时间后喷短时间后喷T T1 1杀死杀死A A品系，使其不能持续产生品系，使其不能持续产生ThrThr与与LeuLeu供供B B品系持续生长。品系持续生长。结果与结论： 仍然出现原养型菌落。仍然出现原养型菌落。 从而表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生从而表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了了遗传重组遗传重组。26ppt课件转化作用及其排除Led
16、erberg和Tatum曾把品系A的培养液经加热灭菌，加入到B品系的培养物中，未得到原养型菌落；表明原养型菌落可能不是由转化作用产生。戴维斯(Dawis, 1950)的U型管试验(结果没有得到原养型细菌)；实验结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件。27ppt课件异核体和杂合二倍体的可能性出现原养型菌落的另一种可能是细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这两种情况类似于二倍体生物的杂合体将产生原养型菌落。 异核体异核体指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两个或多个细胞核。个或多个细胞核。 双杂合二倍体双杂合二倍体则是异核体进一步发生
17、核融合，形成二倍体则是异核体进一步发生核融合，形成二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。细胞核，核内含有两种遗传物质。但细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存在。培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落。对试验中得到的原养型菌落后代研究表明： 后代没有出现预期的性状分离现象后代没有出现预期的性状分离现象。28ppt课件经过上述分析可以认为： 在在LederbergLederberg和和TatumTatum及其它类似试验中，发生了一种不同于及其它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为转化的遗传重组方式，称之为接合接合（conjugationconjugation）。由于
18、历史的局限，从一开始莱德伯格和塔特姆就根据真核的重组来解释他们的发现，认为细菌接合是一个彼此交换遗传物质的过程。29ppt课件F F因子及其在杂交中的行为致育因子(fertility factor, F因子; sex factor, 性因子) 。F因子的化学本质是DNA，可以自主状态存在于细胞质中或整合到细菌的染色体上。F因子可以在细菌细胞间进行转移并传递遗传物质。图图F因子的结构因子的结构图图F因子的整合因子的整合30ppt课件F F因子状态与遗传物质转移特点因子状态与遗传物质转移特点F factor31ppt课件F因子状态与遗传物质转移特点不能进行不能进行极少转移极少转移因子因子, ,大量
19、大量转移细菌基转移细菌基因。因。转移因转移因子，还转子，还转移细菌个移细菌个别基因。别基因。因子状态 游离 整合菌株类型 + + F F fr fr - - 菌株性别 杂交类型 + + - - F F - - fr fr - - - - - - 传递特点 只转移 因子不转 移细菌基因。32ppt课件F F+ + F F- -(1)F纤毛(F pili) 由纤毛素(pilin)蛋白构成，接合管仅使细胞初步接触；(2)转移启动 转移起始区(transfer origin, Ori T) ,滚环复制；(3)单链转移，复制，或重组。33ppt课件Hfr Hfr F F- -(1)F整合后呈线状；(2)
20、转移起点0riT位于中间；(3)先转移F因子的一部分,F的后面部分最后转移。（4）重组子仍为F-F-高频重组菌株高频重组菌株P125P125异源双链34ppt课件三 细菌基因重组的特点 部分二倍体: :指含有一个完整基因组和部分基因组的细胞.(.(半合子)P85)P85 内基因子:P85:P85 外基因子:P85:P85 细菌基因重组的特点: : (1) (1)细菌基因重组是在部分 二倍体中进行; ; (2) (2)只有偶数交换才产生有 活性的重组体; ; (3)(3)相反的重组体不出现. .5-3635ppt课件 中断杂交与重组作图一、中断杂交实验原理 1 1中断杂交实验 Hfr thr+
21、leu+ azir tonr lac+ gal+ strs F- thr- leu- azis tons lac- gal- strr 选择培养基 9 11 18 25 9 11 18 25 加str 无thr, leu 影印接种 azi Ton lac gal 接合接合中断接合中断接合杀死杀死HfrHfr检查基因检查基因作图作图36ppt课件37ppt课件2 中断杂交实验作图原理A A： Hfr Hfr染色体上的基因是从某一点开始, , 以线性方式进入- -的, ,B B：离原点愈近的基因进入- -愈早, ,出现在- -中的比例愈大, ,反之, ,则愈小. . 3 3 中断杂交作图中断杂交作
22、图: : 指在指在HfrHfr F-F-杂交中杂交中, ,把接合中的细菌在把接合中的细菌在不同时间取样不同时间取样, ,搅拌中断杂交搅拌中断杂交, , 分析受体菌基因型分析受体菌基因型, ,以以HfrHfr基基因出现在因出现在- -中的先后为顺序中的先后为顺序, ,以转移的时间以转移的时间( (分钟分钟) )为图距单为图距单位进行基因作图的方法位进行基因作图的方法. . 4 4 作图作图 ( (原点原点) ) azi Ton lac galazi Ton lac gal F F 0 9 11 18 25min 0 9 11 18 25min38ppt课件大肠杆菌基因组很大（全部转移需要100分
23、钟），其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成。39ppt课件1)1)不同的HfrHfr品系转移的起始基因是不同的; ; 说明：因子可以在不同的位点插入细菌染色体; ;2)2)与同一基因相邻的基因是相同的; ; 说明：不同品系细菌的基因顺序是相同的; ;3)Hfr3)Hfr基因可以两个不同方向转移基因进入-;-;4)4)一个HfrHfr转移的起始基因是另一个HfrHfr最后转移的基因 说明：细菌的染色体是环状的. . P85 P85 图 5-355-35 thr lac his galpurthipro2glyHfrH3312140ppt课件5 E.coli的染色体呈环状41p
24、pt课件三、重组作图 (难点) 细菌的重组作图的前提(1) 两个基因紧密连锁; (2) 两个基因进入受体菌的先后;例：已知lac 和ade紧密连锁; lac+比ade+先进入-; 杂交、选择、统计重组体 Hfr lac+ ade+ strs F- lac- ade- strr 选择培养基 加str,无ade -ade+strr 伊红美兰培养基 紫红色菌落紫红色菌落ade+ lac+粉红色菌落粉红色菌落ade+ lac- B: lac+ ade+ A:lac+ ade+ C: lac+ ade+ F- lac+ ade+ 亲组合亲组合 52 F- lac- ade+ 重组合重组合 1542ppt
25、课件3 计算重组体 重组值=重组菌落数/总菌落数100% =(lac- ade+)/(lac+ ade+ )+(lac- ade+) 100% = 15/(52+15) 100% 20% 已知中断杂交实验该两个基因相距1分钟, 重组作图与中断杂交作图的图距关系: 1分钟图距 20% 重组值4 E.coli染色体全长： 100分钟；含有：4.6 106bp 20 100 2000 cM 1cM 2000bp43ppt课件F因子与性导一 F因子与F菌株 F因子：指整合态的F因子从Hfr上错误切割下来， 且带有细菌个别基因的F因子。 F菌株：指带有F因子的细菌。二 性导: 指利用因子将供体菌的基因导
26、入受体形成部分二倍体的过程。 F F- F + F 44ppt课件图图7-12F因子的起源和部分二倍体的形成因子的起源和部分二倍体的形成（仿自（仿自Griffiths，2005）45ppt课件F和F因子不同：F品系转变成Hfr品系的频率要高于F品系F变成Hfr时F因子整合到同一（所带基因的同源）位点上，而F变成Hfr时可整合到不同位点；FF 时可高频传递特定的基因，形成部分二倍体。而FF要么产生F但不转移任何基因，要么以107将宿主的基因按顺序转入受体，但受体仍为F。所转移的基因是不同的。 46ppt课件性导: 指利用因子将供体菌的基因导入受体形成部分二倍体的过程。 F F- F + F 1
27、性导的特点:只能转移因子插入位点附近的基因。 2 性导在遗传分析中的应用：(1) F因子可自主复制；因子可自主复制；(2) 性导所形成的部分二倍体可用作测定两突变形间的互补性导所形成的部分二倍体可用作测定两突变形间的互补试验；试验；(3) 确定部分二倍体中两基因的显隐系；确定部分二倍体中两基因的显隐系；(4) 利用两基因的共性导率作图利用两基因的共性导率作图.P88P88：四种菌株总结：四种菌株总结 杂交关系杂交关系47ppt课件Donor recipient defective phageGeneralized transductionRestricted transduction转导（tr
28、ansductiontransduction）与作图48ppt课件Lerderberg and ZinderLerderberg and ZinderLT22（P22溶原） phe - trp - tyr - his + LT2 （P22敏感） phe +trp + tyr +his 结果：在MM上以10-5频率出现原养型菌株。两亲本菌株分别置于U型管的两臂时，在LT22的一边出现了原养型菌株（与接合不同）。进一步实验证明在两个菌株间传递遗传物质的是沙门菌的一种温和噬菌体P22。LT2LT22prototroph49ppt课件普遍性转导噬菌体的形成噬菌体的头部误包装了细菌的染色体片段（大小相似
29、的），形成转导噬菌体，即：噬菌体头部+供体菌的染色体片段或称为：完全缺陷噬菌体，假噬菌体。P1包装不严格，其中约有1/100的宿主片段可能会被错误地包装到噬菌体中，称为“偷渡偷渡” 。50ppt课件图图7-15普遍性转导病毒颗粒的形成与受体细菌被转导的结果普遍性转导病毒颗粒的形成与受体细菌被转导的结果51ppt课件Generlized transductionGenerlized transduction52ppt课件Abortive transductionAbortive transduction53ppt课件普遍性转导作图(1)(1) 作图原理: :两基因的共转率愈大相距愈近，反之则愈远
30、(2(2）双因子转导作图 例如：确定abcabc三个基因在染色体上的顺序 分别测定a-ba-b、 a-ca-c、 b-c b-c 的共转导率； 如果：a-ba-b的共导率最大，a-ca-c较大，而b-cb-c的最小， 则顺序为：b a cb a c54ppt课件两点法基因顺序的确定 杂交测定三个共转率: :例：P1供体 thr+ leu+ azir 受体thr- leu- azis转导子基因型转导子基因型 共转率共转率 leu+ azir 50 % leu+ thr+ 2 % thr+ leu+ 3 % thr+ azir 0 % 基因可能顺序基因可能顺序 thr azi leu或或 thr
31、leu azi基因顺序是基因顺序是: : thr leu azi 2）三因子转导作图选择选择thr+转导子转导子选择选择leu+转导子转导子55ppt课件(2)中间位点法中间位点法 供体菌：供体菌：supC+ trpA+ pyrF+ 受体菌：受体菌：supC- trpA- pyrF- 基因顺序是基因顺序是: supC trpA pyrF 转导子转导子 （1）supC+ trpA+ pyrF+ 36（双交换）（双交换） （2）supC+ trpA+ pyrF- 114（双交换）（双交换） （3）supC+ trpA- pyrF+ 0（四交换）（四交换） （4）supC+ trpA- pyrF-
32、453（双交换）（双交换）56ppt课件图转导噬菌体与受体染色体之间重组图转导噬菌体与受体染色体之间重组四交换形成转导子频率最低四交换形成转导子频率最低57ppt课件3）共转率与图距关系公式: : d d( (图距) )=L(1-x)=L(1-x)L L：转导DNADNA的平均长度X: X: 两个基因的共转导频率3 当产生转导子是概率很低的随机事件，加上噬菌体能携带细菌的DNA的总量受其头部的大小容量限制，所以无论是a 还是b 被错误地包在噬菌体头部的机会和它们的距离成正比。若a，b距离十分近，可以同时包在转导噬菌体中的话，就会产生ab共转导。 两个或多个基因的共转导是紧密连锁的一种很好的指标
33、。两个共转导基因之间的距离可以通过转导来确定，建立精细的结构图。58ppt课件Lysogenic circleLysogenic circleRestrictive transduction59ppt课件60ppt课件dgaldbiod: defective or deletion61ppt课件另一种是通过携带的gal和受体的基因gal 进行同源配对，经双交换，产生重组的转导子，这种转导子较为稳定。一种是通过整合形成部分二倍体，这种转导子不稳定，可因的切离或丢失而又回复成gal品系。dg侵染gal菌株时可以通过两种不同的途径进行转导：1010-6-6裂解、感染裂解、感染50%转导转导phage
34、 62ppt课件 d dgalgal+ + 转导galgal- -细菌63ppt课件LFT LFT ，HFTHFT(a) dgal+转导gal-细菌,因为该dgal+转导颗粒的产生频率很低，转导gal-细菌出现转导子的频率也很低，称为低频转导（LFT，Low frequency transduction)。(b)在gal基因处发生一次交换, dgal+整合到细菌染色体上。细菌染色体上的gal基因是双份的（ gal+和 gal- ）。该溶原性转导子不稳定。 如果在gal基因处发生两次交换，则产生稳定的转导子。(c)正常的噬菌体（helper phage）在attB位点通过一次交换整合到细菌染色体
35、上。形成的是双重溶原（double lysogen）菌，带有两个（ 和dgal）， gal基因是双份的（ gal+和 gal- ）。如用紫外线等诱导该细菌裂解，产物中 和dgal各占50%,再进行转导时频率高，称为高频转导（HFT，high frequency transduction）。64ppt课件转导的特点1噬菌体介导2部分二倍体3相反的重组子不出现媒介过程结果普遍性转导和局限性转导的区别p90p9065ppt课件Lysogenic conversionLysogenic conversion例：白喉棒状杆菌，噬菌体，产毒菌株66ppt课件噬菌体转变与转导的不同温和噬菌体不携带任何来自供
36、体菌的外源基因，使宿主表型改变的完全是噬菌体基因整合入宿主菌染色体的结果。温和噬菌体是完整的，不是缺陷的。获得新性状的是溶原化的宿主细胞，不是转导子。获得的性状可随噬菌体消失而同时消失。67ppt课件p124p124 细菌同源重组1 细菌同源重组的特点ConjugationTransformationTransduction homologous recombination68ppt课件2 转化：重组发生在 单链DNA和完整的双链DNA之间 异源双链 修复校正 受体基因型 重组体基因型 选择69ppt课件3 接合：重组发生在（更长的）单链DNA和完整的双链DNA之间 异源双链 修复校正 受体基因型 重组体基因型 选择70ppt课件4 转导：重组发生在 双链DNA片段和完整的双链DNA之间 两次双链交换 选择71ppt课件
