1、DNA重组技术的原理及步骤重组技术的原理及步骤 第五组：郑桂贤第五组：郑桂贤一、发展历史一、发展历史1951年，美国学者E莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒质粒。20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时，斯吉巴尔斯基在基因期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。二、二、DNA重组技术的原理重组技术的原理 1.目的基因的获取 2.克隆载体的选择与构建 3.外源基因与载体的连接 4.重组DNA导入受体菌
2、5.重组体的筛选 6.克隆基因的表达三、 DNA重组技术的步骤重组技术的步骤1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体Recombinant DNA TechnologyRecombinant DNA Technology（一）分：目的基因的获取（一）分：目的基因的获取 1.化学合成法:2.基因组DNA、cDNA3.聚合酶链反应克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建 理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点（广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安全性 常用克隆载体：质粒DNA、
3、噬菌体DNA 、病毒DNA 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能；带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。polylinker（二）切：对目的基因和载体适当切割（二）切：对目的基因和载体适当切割 （1）与）与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具分子相关的几种酶及基因工程的其他工具（三）接：目的基因与载体连接（三）接：目的基因与载体连接 (三)连接策略 1.粘端DNA间的连接 (1)同一限制性内切酶切割位点连
4、接 (2)不同限制性内切酶切割位点连接 2.平端DNA间的连接 3.同聚物加尾连接 4.人工接头连接 同聚物加尾连接（四）转：重组（四）转：重组DNADNA转入受体菌转入受体菌无性繁殖感受态细胞:容易接受外源DNA的状态.方式:转化、转染、感染导入大肠杆菌导入哺乳动物细胞 1.氯化钙转化法 2.电击法 3.体外包装感染法1.显微注射法2.电穿孔法 3.DNA-磷酸钙共沉淀4.DEAE-葡聚糖转染法 5.病毒感染法6.脂质体介导法7.细胞融合法 8.原生质体融合法 9.微细胞介导法（五）筛：筛选出含有重组体的受菌（五）筛：筛选出含有重组体的受菌体体 直接选择法间接筛选法核酸水平蛋白质水平1.抗药
5、性选择*1.酶切图谱免疫学的技术：*2.核酸探针SDS-PAGE、2.标志补救*3.PCRWesternblot、3.分子杂交法*4.序列测定ELISA、放免、免疫沉淀、荧光抗体等抗药性选择(六)克隆基因的表达原核表达体系表达载体的标准： 1.含有大肠杆菌适宜的选择标志 2.具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子 3.含有适当的翻译控制序列 4.含有合理设计的多接头克隆位点真核表达体系 关键步骤是将重组DNA导入真核细胞基因载体目的基因粘端连接平端连接尾接法分切接转筛总观参考文章 张亚旭 DNA重组技术的研究综述 生物技术进展 2012年第2卷第一期 57-83 张洪渊 生物化学教程 第七章 Page479 王镜岩 朱圣庚 徐长法 生物化学下册 第40章Page580 百度百科 马克学 席兴宇 转化、转导、转染和感染的解析 生物学教学 2010（第35卷）第10期
