1、环境微生物学实验环境微生物学实验常州大学赵远赵远 孙向武孙向武 实验概况 环境微生物学的实验教材包括环境微生物学的实验教材包括（1）基础微生物学技术，基础微生物学技术，（2）现代微生物学技术，共）现代微生物学技术，共10个实验。个实验。 包括微生物实验技术基础、在环境科学及环境工程中应用、包括微生物实验技术基础、在环境科学及环境工程中应用、现代微生物学实验技术等有关内容。现代微生物学实验技术等有关内容。 对每个实验的内容，力求较详细的介绍每种方法的技术特对每个实验的内容，力求较详细的介绍每种方法的技术特点和基本操作要求，反映现代环境微生物学最新的实验技点和基本操作要求，反映现代环境微生物学最新
2、的实验技术，同时兼具实用性和可操作性。术，同时兼具实用性和可操作性。 目的：是使学生得到微生物学基础实验技术、基本操作和目的：是使学生得到微生物学基础实验技术、基本操作和技能训练，同时也初步掌握现代微生物技术的操作方法。技能训练，同时也初步掌握现代微生物技术的操作方法。本实验指导书主要用于环境与安全工程学院环境工程、给本实验指导书主要用于环境与安全工程学院环境工程、给水排水专业和环境科学专业的本科生的微生物学基础实验水排水专业和环境科学专业的本科生的微生物学基础实验教材。教材。实验守则一、学生在实验室应保持安静，不得高声喧哗、打闹，不准随地吐痰、抽烟、乱丢纸屑和杂物，不准将食物带入实验室。进入
3、实验室应穿实验服，服从指导老师和实验员的安排。二、学生必须按时到达实验室，迟到10分钟不得进入实验室，并按旷课处理。实验进行中不得脱离岗位，必须离开时，需经实验老师同意。三、实验前要认真做好预习，明确实验目的、内容、方法和步骤，阅读有关仪器和设备说明书。学生应在指定的实验岗位进行实验，不准擅自变换实验岗位。四、应按操作规程使用实验仪器和设备，不懂即问，不可盲目、野蛮操作。五、在实验过程中要虚心听取指导老师和实验员的指导，严格遵守操作规程，仔细观察实验现象，按规定格式做好原始记录，经老师审阅同意后，方可结束实验，做到实验数据可靠、真实。六、爱护仪器设备，除指定使用的仪器外，未经指导老师许可，不得
4、自行拆卸、插拔仪器，不得随意动用与本次实验无关的设备及用品，不得将非本人物品带出实验室，实验用品不准挪作他用，违者教师有权令其终止实验并离开实验室。七、对实验室公物、门窗、水电、用具、仪器和设备，要妥善保管和爱护，凡损坏仪器设备者应及时向指导老师或实验员报告。如果因违反实验室规章制度而造成设备的损坏、丢失、实验室软环境的破坏等事故，实验室有权责令当事人写出书面检查，并按相关规定进行处理。八、要节约水、电和药品。对有毒有害物品必须在教师指导下进行处理，不准乱扔、乱放。九、学生实验完毕后，应按规定程序关闭仪器、设备、电源和水源，并做到清洗器皿、清理桌子和清扫地面。十、若实验室发生诸如火灾等重大事故
5、时，应及时切断电源，并在指导老师的指挥下按次序撤离。实验注意事项环境微生物学实验是一门操作技能较强的课程。通过本课程学习，要求学生能牢固地建立无菌概念，掌握环境微生物实验的一套基本操作技术；树立严谨、求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力；树立勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风。 为了提高教学效果，保证实验的质量和实验室的安全，实验注意事项如下： 1 每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法。初步熟悉实验操作中的主要步骤和环节、对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。 2非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应放在不影响实验
6、操作的地方。 3每次实验前须用湿布擦净台面，必要时可用70%酒精或“新洁尔灭”溶液（01浓度）。实验前要洗手，以减少染菌的几率。 4微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌感染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点： 在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流。 接种时尽量不要走动和说话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅，而导致杂菌污染。 用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染环境。 在清洗带菌的培养皿、三角烧瓶或试管等之前，应先煮沸半小时或进行蒸汽灭菌。 5凡需进行培养的材料，都应注明菌名、接种
7、日期及操作者姓名(或组别)，放在指定的温箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果和按时交实验报告。6实验室内严禁吸烟，不准吃东西，以免感染。7节约药品和水、电、煤气。8各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置。9实验完毕、立即关闭煤气，整理和擦净台面，离开实验室之前要用肥皂或清洁剂洗手，值日生负责打扫实验室及进行安全检查（门窗、水、电、煤气等）。10意外事故的处理： 如因玻璃器皿打碎而使菌液洒到桌面或地上时、应立即以5石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液投盖其上，半小时后再擦去。 如菌液污染手部时，应先用70乙醇棉花拭去、再用肥皂水洗刷干净；如污染致病菌时、应将手浸于24来苏尔或01新洁尔灭溶液中，1
8、0min20min后用自来水刷洗干净。 如不慎将菌液及入口中，应立即吐出并用大量自来水漱口。实验一实验一 光学显微镜的使用及微生物形态观察、大小测定和计数光学显微镜的使用及微生物形态观察、大小测定和计数实验二实验二 培养基的配置和灭菌培养基的配置和灭菌实验三实验三 纯种微生物的分离、培养及接种技术纯种微生物的分离、培养及接种技术实验一实验一 光学显微镜的使用及微生物形态观察、大小测定和计数光学显微镜的使用及微生物形态观察、大小测定和计数1、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片，学会绘制生物图3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法4、了解血
9、球计数板的结构，掌握使用和计算方法实验目的实验目的显微镜的构造显微镜的构造现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器：光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。显微镜的显微镜的使用使用 1、低倍镜观察、低倍镜观察 将标本波片用标本夹夹住，移动到物镜的正下方。下降10物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜简，使标本在视野中初步聚焦，再使用微调调节图像清晰。移动标本，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。2、高倍镜观察
10、、高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，移动标本，仔细观察并记录所观察到的结果。3、油镜观察、油镜观察 在标本的盖玻片上滴少量香柏油，将物镜转换到油镜，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心降下，使镜头侵入香柏油中。开足光圈，旋转细调节器至标本显出，清晰为止。微生物大小的测量微生物大小的测量标定目镜测微尺标定目镜测微尺 装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为100格或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，10m格。将物测微尺的刻度朝上
11、放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格的长度。换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格的长度。镜台测微尺及其中央部分的放大目镜测微尺校正目镜测微尺微生物大小的测量微生物大小的测量微生物大小的测量微生物大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出微生物的长度和宽度。10 10 1010 颤藻颤藻硝化细菌硝化细菌大肠杆菌大肠杆菌酵母菌酵母菌作业记录实验结果完成下列任务并提交一份实验报告。1、绘制所观察的一种或两种微生
12、物的形态，并测量其大小。2、将菌液浓度的实验结果填入下表：计数次数每个中方格菌数稀释倍数原菌液浓度（个/ml）平均值（个/ml）第一次第二次实验二实验二 培养基的配置和灭菌培养基的配置和灭菌1、明确培养基配置的原理2、掌握配制培养基的一般方法和步骤3、掌握灭菌锅的使用方法实验目的实验目的实验基本原理实验基本原理本次需要配制的培养基是为下次从土壤或活性污泥中分离细菌用的，所以选择配制适合细菌生长的牛肉膏蛋白胨培养基。这是一种应用最广泛最普遍的细菌基本培养基，牛肉膏提供碳原和能源，蛋白胨主要提供氮源，NaCI提供无机盐，用HCI和NaOH调节pH，还要加入一定量的琼脂最为凝固剂。琼脂在大于96时融
13、化，小于40时凝固，通常不被微生物利用。培养基配方如下：（调节 pH 7.2 7.4）牛肉膏蛋白胨NaCI琼脂水5 g10 g5 g 25 g1000ml实验内容和步骤实验内容和步骤1.配制溶液：取一定容最的烧杯或搪瓷杯盛入适量蒸馏水，按培养基配方逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。牛肉膏、蛋白胨可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足所需容量。2.调节pH：用精密pH试纸测量培养基原始pH值。若偏酸，逐滴加入1molL的NaOH 溶液，边加边搅拌，随时测pH值，直至达约7.4。若偏碱，同法用1molL的HCI溶液调节。3.分装：将配制好的培养基装入三角瓶和试管中，三角瓶装量不要超过容积的1/2
14、，试管装量不要超过试管高度的1/3，约为5ml。5、加塞：分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入并保证良好的通气性能。4. 加塞：分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入并保证良好的通气性能。实验内容和步骤实验内容和步骤5. 包扎：加塞后，三角瓶外包一层牛皮纸或两层旧报纸，用麻绳以活结形式扎好：试管先用橡皮筋全部捆好，再在棉塞外包牛皮纸或旧报纸，防止灭菌时冷凝水润湿棉塞。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。 6. 灭菌：将包扎好的培养基放进高压蒸汽灭菌锅内，0.103MPa，121，20min，高压蒸汽灭菌。7. 搁置斜面：将灭菌的试管培荞基冷却至
15、50左右，将试管口端搁在玻璃棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。8. 无菌检套：将灭菌的培养基放入37的培养箱中培养2448h，检查灭菌是否彻底。作业 实验结束完成下列思考题，并提交实验报告。 1、配制培养基的过程中应该注意些什么问题？为什么？ 2、培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的?实验三实验三 纯种微生物的分离、培养及接种技术纯种微生物的分离、培养及接种技术l、掌握梯度稀释平板法分离纯种微生物的原理、方法2、掌握常规接种技术3、建立无菌操作意识实验目的实验目的实验基本原理实验基本原理土样或活性污泥中含有的微生物数量很多，而且聚
16、集在一起，经过无菌水的梯度稀释可以将微生物充分分散，成单个细胞，涂布到固体平板上，长成单菌落，一个单菌落对应于原土样（或活性污泥）中的一个微生物，乘以相应的稀释倍数可以计算出土样的微生物浓度；将单菌落进一步划线纯化可分离到纯种微生物。（一）梯度稀释平板法（一）梯度稀释平板法1、 制备土壤（或活性污泥）稀释液制备土壤（或活性污泥）稀释液准确称取土样10g或活性污泥10ml，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤或活性污泥悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸（深吸浅吹）3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释
17、液：再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml移入装有9ml无菌水的诚管中，也吹吸三次，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液。（一）梯度稀释平板法（一）梯度稀释平板法 2、加菌、加菌将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各1ml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各1rnl放入编号10-4的3个平板中（图3-1）（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。3、倒平板、倒
18、平板上述操作的同时，将培养基加热融化，再冷却到4050，倾注1015ml培养基入已含有菌液的培养皿内（约23mm厚）。迅速盖上皿盖，平放在工作台上，轻轻转动，是培养基和稀释的菌液充分混合均匀，冷却后，即制成平板。4、培养、培养将培养皿倒置，放于30恒温培养箱中培养2436h，观察结果。（二）平板划线（二）平板划线平板划线的主要目的是长出单菌落，得到纯培养。将融化的培养基无菌操作倒入无菌的空培养皿中。接种环在火焰上彻底杀菌并冷却后，蘸取少量菌种，在平板表面轻轻地划线（如图），使得初始聚集在一起的细胞渐渐稀释，最后有单个分散的细胞，长出单菌落，达到分离纯化的目的。将划好线的培养皿倒置于30恒温培养
19、箱中培养2436h，观察结果。（三）斜面接种（三）斜面接种1、在待接种的斜面培养基的试管上部，贴上标签，写上菌名、接种日期等。2、将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两只试管，中指位于两只试管之间，斜面向上，管口齐平。3、右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，将接种环可能进入试管的部分在火焰上灼烧灭菌。4、在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌央住棉塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量茵烧掉。将烧过的接种环伸入菌种管内，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸入另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞，最后再次灼烧接种环，则接种完毕。作业 实验结束完成下列思考题，并提交实验报告。 1、梯度平扳稀释法分离纯种微生物的方法和原理是什么？ 2、平板培养皿为什么要倒置培养？ 3、观察实验结果，并对结果进行分析。
