1、凯氏定氮法测定食品中蛋白质凯氏定氮法测定食品中蛋白质2凯氏定氮法测定凯氏定氮法测定食品中蛋白质食品中蛋白质3一、概述一、概述 蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的含氮化合物，它是由含氮化合物，它是由20种氨基酸通过种氨基酸通过酰氨键酰氨键以以一定方式结合，并具有一定的空间结构。一定方式结合，并具有一定的空间结构。4 生理功能及在食品中的作用生理功能及在食品中的作用1蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的活体都含有蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。不同类型的蛋白质。2维持酸碱平衡、水平衡；维持酸碱平衡、水平衡；3遗传信息的表
2、达方式；遗传信息的表达方式；4维持物质的代谢及运转；维持物质的代谢及运转；5人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物，来构人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质；成自身的蛋白质；6营养指标、食品生产工艺指标。营养指标、食品生产工艺指标。5常见食物中蛋白质的含量常见食物中蛋白质的含量牛肉牛肉螺旋藻螺旋藻6常见氮系数常见氮系数78“毒奶粉事件毒奶粉事件”910（GB/T 21704-2008）l2008年年7月月1日实施的乳与乳制品中非蛋白氮含日实施的乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定（量的测定（GB/T 21704-2008）的国家标准，）的国家标准，这种检测方法就是利用三氯乙
3、酸与蛋白质结合形这种检测方法就是利用三氯乙酸与蛋白质结合形成不溶性盐，并从水溶液中沉淀出来的性质，经成不溶性盐，并从水溶液中沉淀出来的性质，经过过滤将乳制品溶液分为不溶性（沉淀）和可溶过过滤将乳制品溶液分为不溶性（沉淀）和可溶性（滤液）两部分，再利用性（滤液）两部分，再利用凯氏定氮法凯氏定氮法测定滤测定滤液中氮含量，就可以知道非蛋白氮的含量液中氮含量，就可以知道非蛋白氮的含量11凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）l凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。1.1.原理原理样品与浓硫酸浓硫酸和催化剂催化剂一同加热消化消化(digest
4、)(digest)，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出。而样品中的有机氮有机氮(organic nitrogen)(organic nitrogen)转化为氨与硫酸结合成硫酸铵硫酸铵。然后加碱碱蒸馏，使氨氨蒸出，用硼酸硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。1213第一步：样品消化第一步：样品消化l样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中14（1）消化总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98
5、%）15消化装置消化装置“自动回流消化仪自动回流消化仪”16定氮消化的不同状态RCH2(NH2)COOH+H2SO4CO2+H2O+SO2+ (NH4）2SO4澄清澄清消泡消泡碳化碳化17消化过程中试剂作用消化过程中试剂作用l硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程；l硫酸铜：催化作用1819（1）蒸馏 (NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O2021(3(3）吸收与滴定）吸收与滴定 吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可。33427424274
6、243334225)(5)(42BOHClNHHClOHOBNHOHOBNHBOHNH22各步骤操作细节图解：各步骤操作细节图解： 样品消化蒸馏滴定（1）样品消化）样品消化样品+0.4g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟45度角消化终点瓶口不能对着人盖上小漏斗23（2 2）蒸馏）蒸馏将消化液全部转移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示剂23d加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色通入蒸汽开始蒸馏冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入
7、10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。24吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源25（3 3）滴定）滴定 取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至终点。滴定前滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。26实验注意事项实验注意事项消化消化（1）不时转动凯氏烧瓶、）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化缓和沸腾消化（2）消化至呈透明后，继续消化）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化分钟，一般消化时间约时间约4小时小时（3）可
8、加如少量辛醇、硅油做消泡剂）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂（4）样品不易澄清时可冷却后加入）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢过氧化氢2-3ml2728自动凯氏定氮仪法自动凯氏定氮仪法 在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。仪器：消化炉自动蒸馏装置291 1、原理及适用范围原理及适用范围 2 2、特点：特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟分钟可消化完毕。可消化完毕。 （3）自动：自动加碱
9、蒸馏，自动吸收和滴定，）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样。个样。3031双缩脲法（分光光度法）双缩脲法（分光光度法）1.1.原理原理双缩脲反应双缩脲反应 碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配合物的反应合物的反应。 肽键（肽键（-CO-NH-）与双缩脲结构相似、能呈现此）与双缩脲结构相似、能呈现此反应反应。 560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。KOH、CuSO4、酒、酒石酸钾钠配置石酸钾钠配
10、置32标准曲线标准曲线l标准曲线（standard curve）是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。332.标准曲线绘制标准曲线绘制（1）配置一定浓度一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液；（2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中；（3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，振摇、静止1h；（4）取上清液在2000r/min离心5min、560nm测定吸光度，绘制标准曲线。 最终测定溶最终测定溶液中不能有沉液中不能有沉淀淀343.3.样品测定样品测定样品含量需在40-100mg内。4.4.结果计算（结果计算（mg/100gmg/100g）1100mmX
