1、精品课程精品课程主讲：刘常金主讲：刘常金第三章第三章 蛋白质改造的分子途径及其蛋蛋白质改造的分子途径及其蛋白质的异源表达白质的异源表达 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法
2、都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。 1寡核苷酸介导的位点特异性突变 这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，也称为专一性位点突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 (1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素关于DNA模板的制备寡核苷酸突变引物的设计和选择 寡核苷酸突变引物与DNA模板的退火和引物延伸条件DNA聚合酶的选择存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响受体细胞对突变体产率的影响关于DNA模板的制备双链DNA模板：质粒单链
3、DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免RNA污染) 寡核苷酸突变引物的设计和选择引物特征：具有和模板DNA的互补区；足够长，能与目标DNA序列退火；突变引物应尽可能避免形成稳定二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列；突变引物不能与目标DNA的其它区域和载体DNA形成稳定的杂交体。引物设计取决于所要产生的突变类型：用于单个核苷酸改变的引物，一般长度为1719个核苷酸；多处改变核苷酸或改变2个以上，一般长度为25个核苷酸以上。寡核苷酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件退火条件：突变引物与模板突变引物与模板DNA的摩尔比为的摩尔比为1050；退火通常将二者混；退火通常将二者混合物加热
4、到合物加热到Tm值以上值以上20度，然后再缓慢冷却到室温；度，然后再缓慢冷却到室温；对于对于AT含量高的引物，为保证退火安全，加热后可含量高的引物，为保证退火安全，加热后可冷却到较低温度，以稳定模板和引物复合体。冷却到较低温度，以稳定模板和引物复合体。引物延伸条件：退火完成后加入4种脱氧核苷三磷酸，DNA聚合酶、DNA连接酶等，进行2-15小时的延伸反应。DNA聚合酶的选择目前一般选择目前一般选择T4DNA聚合酶和聚合酶和T7DNA聚合酶聚合酶 存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响 dCTP氧化脱氨可产生微量氧化脱氨可产生微量dUTP， dUTP渗入到新渗入到新生生DNA链中后
5、，受体菌中的尿嘧啶链中后，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在糖基化酶可在U的的位置切断位置切断DNA链，降低突变体的产率。链，降低突变体的产率。 利用经利用经HPLC纯化的高质量的纯化的高质量的dNTP可以降低可以降低U碱基碱基的错误搀入，提高突变产生的比率的错误搀入，提高突变产生的比率。 受体细胞对突变体产率的影响受体菌中的错配修复系统将产生的突变去除；受体菌中的错配修复系统将产生的突变去除；当用当用M13作为克隆载体时，由于作为克隆载体时，由于M13 DNA可能可能出现不对称复制，如果突变链的复制效率较低，出现不对称复制，如果突变链的复制效率较低，则最终将降低突变体的产率。则最终将降低突变
6、体的产率。为了提高突变体的回收率，即提高突变效率，为了提高突变体的回收率，即提高突变效率，利用点错配修复缺失的菌株为受体菌可使突变利用点错配修复缺失的菌株为受体菌可使突变产率提高近产率提高近10倍。倍。 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel 突变法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 Kunkel 突变法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变PCR flash 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 2区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也基因工程技术不但可
7、使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片又称片段取代法段取代法(DNA fragment replacement)。盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混或任何混合序列合序列)的的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。序列。盒式突变的两个关键问题：1.目标基因中要有适当的限制
8、性内切酶识别位点。对于天对于天然蛋白质来说，其所含可供利用的限制性内切酶识别位然蛋白质来说，其所含可供利用的限制性内切酶识别位点很少，可利用遗传密码的简并性在不改变氨基酸序列点很少，可利用遗传密码的简并性在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。2.用于取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段的获得。目前利用目前利用PCR技术可产生具有特定限制性内切酶位技术可产生具有特定限制性内切酶位点的、具有各种突变位点的盒式突变点的、具有各种突变位点的盒式突变
9、DNA片段的技术已片段的技术已经很成熟。经很成熟。如今，对目标基因进行区域性定向突变，除了上述的盒如今，对目标基因进行区域性定向突变，除了上述的盒式突变外，也完全可以通过式突变外，也完全可以通过PCR方法对给定基因序列进方法对给定基因序列进行融合和剪接，这种基因改造方法不受特定限制性内切行融合和剪接，这种基因改造方法不受特定限制性内切酶位点的存在与否的限制酶位点的存在与否的限制。第三节 重组蛋白质的表达 一一表达系统：表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。受体细胞。 根据受体
10、细胞的不同可分为：根据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统原核表达系统(大肠杆菌大肠杆菌)： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以核细胞中以发酵形式发酵形式快速高效地表达、快速高效地表达、合成基因产物的体系。合成基因产物的体系。2真核表达系统（哺乳动物细胞）：真核表达系统（哺乳动物细胞）： 使外源基因在真核细胞中表达的体系。使外源基因在真核细胞中表达的体系。二二原核生物基因结构和表达特点原核生物基因结构和表达特点1.原核生物染色体原核生物染色体DNA是裸露的环是裸露的环形形DNA，其转录和翻译是偶联的其转录和翻译是偶联的连续进行。连续进行。 2. 原核
11、生物形成多顺反子原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。结合，翻译形成多条肽链。 3、一般不含内含子（一般不含内含子（intron），），没有转没有转录及翻译后加工系统录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成一起，形成操纵子操纵子。操纵子（操纵子（operon）：）：是一组功能上相是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位一个遗传单位 原核生物基因表达的基本单位（即一原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。个转录单位）
12、。共同协调作用，完成某一多肽的表达共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。调控。包括：调控区包括：调控区(调节基因，启动基因，调节基因，启动基因， 操纵基因操纵基因)、 结构基因结构基因操纵子特点：操纵子特点：5、原核生物中参与转录的基因结构：原核生物中参与转录的基因结构：启动子启动子终止子终止子 启动子启动子(promoter, P)是指能被是指能被RNA聚合聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。序列。 一般长一般长40-60bp，富含富含A-T碱基对碱基对 具有保守序列：具有保守序列： -10区（区（pribnow box）：）：TATAAT -35
13、区：区： RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于启动子强弱取决于-35区和区和-10区的碱基组成及其间区的碱基组成及其间隔序列隔序列 终止子（终止子（terminatorterminator，T T）: :位于基因位于基因33端端, ,给予给予RNARNA聚合酶转录终止信号的聚合酶转录终止信号的DNADNA序序列列 6、与转译有关的原核细胞结构：与转译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点核糖体结合位点转译起始密码子转译起始密码子AUG 或或GUGSD顺序（顺序（shine-da
14、lgarno）：）：AUG上游上游3-11 bp长约长约3-9bpmRNA与与16s核糖体亚基间的识别与核糖体亚基间的识别与结合序列结合序列 三三外源基因在原核表达系统中表达外源基因在原核表达系统中表达的必要条件的必要条件：1.删除内含子和删除内含子和5非编码区非编码区2.外源基因置于强启动子和外源基因置于强启动子和SD顺序控制顺序控制下下3.维持正确开放阅读框架（维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解白质不被降解 四影响外源基因在原核细胞中表四影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选
15、择强、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。启动子。 常见原核强启动子：常见原核强启动子： Plac：受：受Lac阻遏蛋白负调，受阻遏蛋白负调，受IPTG的的诱导诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和启动子和Trp启动子的杂合启启动子的杂合启动子。动子。 PL和和PR启动子启动子：噬菌体早期左：噬菌体早期左/右向启右向启动子，受动子，受噬菌体噬菌体CI基因负调控。温度基因负调控。温度诱导。诱导。 2、基因剂量：、基因剂量：3、核糖体结合位点：、核糖体结合位点：SD顺序与顺序与16srRNA3末端互补程度。末端互补程度。AUGSD间距离。
16、间距离。AUG后的核苷酸后的核苷酸 五原核表达载体：五原核表达载体： 适用于在原核细胞适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD顺序顺序 筛选标志筛选标志 其它调控基因其它调控基因 类型：类型：融合型表达载体：融合型表达载体：-融合蛋白融合蛋白非融合型表达载体：非融合型表达载体：-天然完整蛋白天然完整蛋白分泌型表达载体：分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌产物可跨膜分泌至胞周间隙至胞周间隙 （一）融合型表达载体（一）融合型表达载体 PSDForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因技术关键：克隆基因插入原核序列技术关
17、键：克隆基因插入原核序列3 3端而维持正确阅读框架端而维持正确阅读框架。 选择合适酶切位点选择合适酶切位点 加入人工合成的加入人工合成的DNA接头接头 构建位相载体构建位相载体优点：优点：表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切割方便： pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX系列系列（二）非
18、融合型表达载体（二）非融合型表达载体 PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子第一个密码子非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子启动子-温度温度诱导诱导插入位点插入位点-HpaI（三）分泌型表达载体：（三）分泌型表达载体：1、主要元件：、主要元件：启动子和启动子和SD序列序列信号肽序列信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽，下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解、优点：分泌表达，避免降解。 分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII
19、-ompA1分泌型融合表达载体分泌型融合表达载体-pEZZ18六六提高表达水平的手段提高表达水平的手段1、选择合适载体，提高翻译水平、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子强启动子-提高转录水平提高转录水平 核糖体结合位点（核糖体结合位点（ATG-SD） 避免产物降解避免产物降解 ：分泌：分泌/融合表达融合表达 细菌蛋白酶抑制剂细菌蛋白酶抑制剂2、选择合适宿主、选择合适宿主 Lac 启动子启动子-LacI菌菌PL/PR - CI857 溶源菌溶源菌 3、诱导表达、诱导表达 温度诱导温度诱导-PLPR /IPTG的化学诱导的化学诱导-Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿提高表达蛋
20、白的稳定性，防止被宿主降解主降解七表达产物的检测：七表达产物的检测： 1、特异性鉴定：、特异性鉴定：荧光抗体法荧光抗体法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫印迹法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定生物学活性鉴定 八、原核表达系统的缺点八、原核表达系统的缺点1、没有转录后加工系统，不能识别、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工的蛋白质进一步修饰加工 真核表达系统的必要性及优势真核表达系统的必要性及优势1. 具转录后加工系统具转录后加工系统2. 具翻译后修饰系统具翻译后修饰系统3. 可实现真正的分泌表达可
21、实现真正的分泌表达4.基因治疗基因治疗真核基因结构及表达调控特点真核基因结构及表达调控特点 （一）真核基因组的复杂性（一）真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，真核基因组庞大，具大量非编码序列具大量非编码序列 -mRNA丰度不同丰度不同 结构复杂结构复杂：染色质、核膜、线粒体：染色质、核膜、线粒体-表达调控多样表达调控多样 不连续性：内含子、外显子不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构没有操纵子结构 (二）真核表达系统二）真核表达系统组成：真核表达载体组成：真核表达载体 受体细胞受体细胞 基因转移方式基因转移方式据受体细胞及表达载体的不同分为据受体细胞及表达载体的不同分为3种：种： 酵母表达系
22、统酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统（三）转化三）转化1、原生质体法：去除厚壁、原生质体法：去除厚壁2、电穿孔法：效率较高、电穿孔法：效率较高（四）外源基因的表达四）外源基因的表达1、胞内表达、胞内表达2、分泌表达：在、分泌表达：在MCS前加入信号肽前加入信号肽序列序列大肠杆菌表达体系大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。大肠杆菌表达体系的应用 当外源蛋白质的分子量小于7
23、0kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于34个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。1表达载体的一般特点(1) 复制起始点(2) 选择性基因 (3) 强的、可诱导的启动子(4) 强的转录终止序列 (5) 核糖体结合位点(6) 合适的多克隆位点2与外源基因有效表达的相关因素(1) 有效的转录起始(2) 有效的翻译(3) 蛋白质水解作用(4) 蛋白质的外泌 3改善表达水平的方法 诱导条件外源基因的编码序列用蛋白酶缺失的宿主菌4. 改善外源蛋白溶解性的方法 外源蛋白的分泌表达 细菌生长温度 外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达 外源蛋白与相关蛋白或蛋
24、白标签融合大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。大肠杆菌体系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。哺乳动物细胞表达系统 1选择哺乳动物细胞表达体系的优点2两个主要的
25、哺乳动物细胞表达系统1哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。哺乳动物细胞表达系统在生物制药方面被广泛应用 据统计，美国在2000年1月2004年12月批准的所有创新生物技术药物中，用酵母表
26、达的有两种，用大肠杆菌表达的有6种，且都是分子量为35006000道尔顿的低分子量多肽。与此形成鲜明对比的是，从2000年以后，哺乳动物细胞表达系统更受美国等国家的制药公司的重视。目前，美国418种在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞（CHO）为主的哺乳动物细胞表达的。在FDA已批准上市的生物技术药物中，哺乳动物细胞表达的产品占70%以上。从销售情况来看，2005年全球生物技术药物约70%的销售额（超过365亿美元）是由CHO等哺乳动物细胞表达产品带来的。预计到2007年，动物细胞表达的产品在整个生物制药市场中的份额将达75%。哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处 在天然环境条件下，研究工程化
27、基因产物的性质。 如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。 2两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要12个月的时间，在稳定转化的细胞中， DNA被整合到染色体中， 这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。
