1、第第8 8章章 核酸的生物合成核酸的生物合成基本内容基本内容1. DNA 的生物合成的生物合成1.1 DNA复制的半保留性复制的半保留性1.2 DNA的复制酶和相关蛋白的复制酶和相关蛋白1.3 原核细胞的原核细胞的 DNA 复制复制1.4 真核生物的真核生物的 DNA 复制复制2. RNA 的生物合成的生物合成3. 核酸合成抑制剂核酸合成抑制剂4. 基因工程简介基因工程简介基本要求：基本要求： （1）掌握中心法则、）掌握中心法则、DNA复制的基本过程及参与的复制的基本过程及参与的酶和蛋白、逆转录、酶和蛋白、逆转录、RNA的转录及其加工、的转录及其加工、DNA重组重组技术和技术和PCR技术。技术
2、。（2）理解原核与真核生物）理解原核与真核生物DNA复制的差异、核酸合复制的差异、核酸合成的抑制剂。成的抑制剂。（3）了解）了解RNA的复制、突变和修复的种类、基因工的复制、突变和修复的种类、基因工程的应用。程的应用。 DNA 是生物界遗传主要物质基础。是生物界遗传主要物质基础。生物有机体的遗生物有机体的遗传特征以密码的形式编码在传特征以密码的形式编码在 DNA 分子上，表现为特分子上，表现为特定的定的核苷酸排列顺序核苷酸排列顺序即遗传信息。即遗传信息。 80 年代以后在某些致癌年代以后在某些致癌 RNA 病毒病毒中发现遗传信息也中发现遗传信息也 可存在于可存在于 RNA 分子中，由分子中，由
3、 RNA 通过逆转录的方式通过逆转录的方式将遗传信息传递给将遗传信息传递给DNA。 在细胞分裂前通过在细胞分裂前通过 DNA 复制复制，将遗传信息由亲代传将遗传信息由亲代传递给子代，在后代的个体发育过程中，递给子代，在后代的个体发育过程中，遗传信息自遗传信息自DNA 转录给转录给 RNA，并指导蛋白质合成并指导蛋白质合成，以执行各种，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。遗传信息传递方向遗传信息传递方向生物界遗传信息传递的生物界遗传信息传递的中心法则中心法则中心法则示意图：中心法则示意图： 当一个母细胞在分裂为两个当一个母细胞在分裂为
4、两个子细胞之前，母细胞中的子细胞之前，母细胞中的 DNA 必须忠实地被复制，通必须忠实地被复制，通过复制把亲代的遗传信息传过复制把亲代的遗传信息传递给子代从而使子代表现出递给子代从而使子代表现出亲代的遗传性状。亲代的遗传性状。 DNA复制复制（DNA replication）也也称之称之DNA合成。合成。DNA 复制复制是一个在是一个在 DNA聚合酶的催聚合酶的催化下整个基因组被复制的过化下整个基因组被复制的过程。程。第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成1. DNA的复制的复制1.1 DNA复制的半保留性复制的半保留性半保留复制半保留复制 (semiconservation replica
5、tion) 定义定义：复：复制过程中双螺旋解旋并分开，然后以每条制过程中双螺旋解旋并分开，然后以每条链为模板链为模板，按碱基互补配对原则按碱基互补配对原则， 由由 DNA 聚合酶聚合酶催催化合成新的互补链化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条结果由一条链成为互补的两条链链，新形成的两个新形成的两个 DNA 分子与原来分子与原来 DNA 分子的碱分子的碱基序列完全相同。由于每个子代基序列完全相同。由于每个子代 DNA 的一条链来自的一条链来自亲代亲代 DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。称为半保留复制。 意义意义：保持遗传特性的稳定。
6、：保持遗传特性的稳定。 关于关于DNA分子的分子的复制，人们曾经提复制，人们曾经提出两种模式：出两种模式：全保留复制方式，全保留复制方式，即从亲代即从亲代DNA的两的两条链复制出一个新条链复制出一个新的子代的子代 DNA；半保留复制式，半保留复制式，是是 Watson 和和 Crick 根据根据 DNA 双螺旋双螺旋模型提出来的，即模型提出来的，即在子代的在子代的 DNA中，中，一条链来自亲代，一条链来自亲代，另一条链是新合成另一条链是新合成的。的。 哈佛大学生物系教授哈佛大学生物系教授 Matthew Meselson 和他的学生和他的学生 Franklin Stahl 用实验证明了用实验证
7、明了 DNA 是按半保留方式进行复制的。是按半保留方式进行复制的。 半保留复制的证据半保留复制的证据随着代数增加随着代数增加 14N-DNA 逐渐逐渐增加。增加。 而而14N/15N-DNA 区带区带逐渐减弱。逐渐减弱。 大肠杆菌在大肠杆菌在 15NH4Cl 培养基中生长培养基中生长 12 代，使代，使 DNA被被 15N 标记，再将细菌移到只含标记，再将细菌移到只含 14NH4Cl 培养基中培养基中培养。培养。 取每一代细胞进行裂解，将裂解液进行密度梯度离取每一代细胞进行裂解，将裂解液进行密度梯度离心。心。 离心后从管底到管口，离心后从管底到管口，DNA 分子停留在与其相当分子停留在与其相当
8、的的 CsCl 密度处，在紫外光下可以看到形成的区带。密度处，在紫外光下可以看到形成的区带。14N-DNA 分子密度较轻分子密度较轻 (1.7g/cm3)，停留在离管口，停留在离管口较近的位置；较近的位置；15N-DNA 分子密度较大，停留在离管分子密度较大，停留在离管口较远的位置。口较远的位置。 当含有当含有 15N-DNA 细胞在细胞在 14NH4C1 培养液中培养一培养液中培养一代后，只有一条区带介于代后，只有一条区带介于 14N-DNA 与与 15N-DNA 之之间，表明间，表明DNA一条链来自一条链来自 15N-DNA， 另一条链为另一条链为含有含有 14N 的新合成链。的新合成链。
9、 培养两代后则在培养两代后则在 14N-DNA 区又出现一条带。区又出现一条带。 按照按照 DNA 半保留复制方式，培养两代只能出现半保留复制方式，培养两代只能出现 14N-15N-DNA 杂合分子和杂合分子和 14N-DNA两种分子。两种分子。 随着代数增加随着代数增加 14N-DNA 逐渐增加。逐渐增加。 而而14N-15N-DNA区带逐渐减弱。区带逐渐减弱。DNA聚合酶的性质聚合酶的性质： 以以 dNTP 为原料催化合成为原料催化合成 DNA； 需要需要模板模板和和引物引物的存在；的存在； 不能起始不能起始合成新的合成新的DNA链；链； 催化催化 dNTP 加到生长中加到生长中 DNA
10、链的链的 3 -OH 末端；末端； 催化催化DNA合成的合成的方向方向是是 5 3 。 有有 3 5 外切酶活性，以保证复制过程高保真度。外切酶活性，以保证复制过程高保真度。 DNA聚合酶聚合酶 (DNA Polymerases)1.2 DNA的复制酶和相关蛋白的复制酶和相关蛋白DNA复制：模板、原料、引物复制：模板、原料、引物 、酶、蛋白质。、酶、蛋白质。3 DNA聚合酶聚合酶 从从 3 5 方向识别和切除方向识别和切除不配对核苷酸。不配对核苷酸。 错配核苷酸进入错配核苷酸进入pol结合位点不能与模板配对，无法结合位点不能与模板配对，无法改变酶的构象，被改变酶的构象，被 3 5 外切酶活性位
11、点识别并切除。外切酶活性位点识别并切除。3 5 外切酶活性外切酶活性 ( (校对作用校对作用) )模板模板 Arthur Kornberg（斯坦福（斯坦福大学医学院教授）等人于大学医学院教授）等人于1956 年在大肠杆菌的提取年在大肠杆菌的提取液中发现了液中发现了 DNA聚合酶，聚合酶，即现在的即现在的 DNA 聚合酶聚合酶 I，也称也称Kornberg酶酶，分子量，分子量为为 109 kD 大肠杆菌大肠杆菌 DNA polymerase ( DNA pol)结构结构近似球体，直径约近似球体，直径约 65 ，纵轴上有约纵轴上有约 20 深沟深沟 (cleft)，带正电荷，是酶的活性中心。带正电
12、荷，是酶的活性中心。 经经枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段：处理后，酶分子分裂成两个片段： 大片段大片段(Klenow片段片段) MW:76KD5 3 聚合酶活性聚合酶活性3 5 外切酶活性外切酶活性 (校对作用校对作用) 小片段小片段 MW: 34KD5 3 外切酶活力外切酶活力 (切除、修复作用切除、修复作用) 。 作用于作用于具切口的具切口的双链双链 DNA 的碱基配对部分，从的碱基配对部分，从 5 端切下单核苷酸或寡核苷酸。端切下单核苷酸或寡核苷酸。 在在 DNA 损伤修复中可能起着重要作用。损伤修复中可能起着重要作用。 切除切除 5 -末端末端 RNA 引物。
13、引物。5 3 外切酶活力外切酶活力 (切除、修复作用切除、修复作用)DNA pol不是不是大肠杆菌中大肠杆菌中DNA复制的主要酶。复制的主要酶。a. 体内体内 DNA 合成速率比纯化的合成速率比纯化的 DNA pol催化催化 dNTP 掺入速率高掺入速率高 20 倍；倍；b. 大肠杆菌的一个突变株中，大肠杆菌的一个突变株中， DNA pol活力正常，活力正常，但但 染色体染色体 DNA 复制不正常；复制不正常；c. 在一些突变株中，在一些突变株中，DNA pol活力很低，但活力很低，但DNA复复制正常，而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度制正常，而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。敏感。DN
14、A pol在在 DNA 修复修复中起着重要的作用，中起着重要的作用，切除切除 5 -末端末端 RNA 引物，并将岗崎片段之间的间隙补齐。引物，并将岗崎片段之间的间隙补齐。 MW：120 KD，单链。含量仅为，单链。含量仅为 DNA pol的的 5% 具具 53聚合活性聚合活性。具。具 35外切酶活性外切酶活性，但，但无无 53外切酶活性。外切酶活性。 DNApol 缺陷的大肠杆菌突变株的缺陷的大肠杆菌突变株的 DNA复制正复制正常。表明常。表明 DNA pol 不是不是DNA复制的主要酶，它复制的主要酶，它可能在可能在 DNA 损伤修复损伤修复中起一定作用。中起一定作用。 大肠杆菌大肠杆菌DN
15、A聚合酶聚合酶 (DNA pol) 多亚基：至少多亚基：至少 10 种亚基组成的复合物，称为种亚基组成的复合物，称为 DNA 聚合酶全酶。聚合酶全酶。MW：400kD 核心聚合酶核心聚合酶(core polymerase)： , ,三个亚基。三个亚基。 具具 53 聚合酶活性聚合酶活性 ( 亚基亚基) 、35核酸外切酶活核酸外切酶活性性( 亚基亚基)，但，但 无无 53外切酶活性。外切酶活性。 亚基把酶的核心夹于膜板上，从而提高酶的工作亚基把酶的核心夹于膜板上，从而提高酶的工作效率。效率。 在细胞内数量少，但催化在细胞内数量少，但催化 dNTP 掺入掺入 DNA 链速率是链速率是DNA pol
16、的的 15 倍。倍。大肠杆菌大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 (DNA pol )DNA聚合酶聚合酶 III 由多亚基组成由多亚基组成 DNA pol III全酶全酶形成一个形成一个非对称的二聚体非对称的二聚体，使复制，使复制的的先导链先导链及及随后链随后链在全酶上同时沿解链同方向合成。在全酶上同时沿解链同方向合成。 是细胞内是细胞内 DNA 复制所必需的酶。复制所必需的酶。 E. Coli DNA pol I 的主要功能是的主要功能是DNA 修复，除去修复，除去RNA引物，并引物，并将岗崎片段之间的间隙补齐；将岗崎片段之间的间隙补齐； DNA pol II 主要参与主要参与 DNA 的修复。的
17、修复。 DNA pol III 主要负责生长着的复制叉处的主要负责生长着的复制叉处的DNA复制；复制； 都可催化聚合反应，但都可催化聚合反应，但链延伸的速度链延伸的速度有很大差别，有很大差别，DNA pol III 活性最高，复制速度最快。活性最高，复制速度最快。 都都具有校正活具有校正活性性，即它们都具，即它们都具有有 3 5 外切酶外切酶活性，可以将错活性，可以将错配的核苷酸切去，配的核苷酸切去，再将正确的填上。再将正确的填上。这一功能对于这一功能对于DNA合成非常重合成非常重要。要。 RNA 引物引物：引物酶引物酶以单链以单链 DNA 为模板，利用核糖为模板，利用核糖核苷酸合成核苷酸合成
18、 RNA 作为作为 DNA 合成的引物。合成的引物。 大肠杆菌引物酶大肠杆菌引物酶：由大肠杆菌的：由大肠杆菌的 dna G基因编码，基因编码，1条多肽链，条多肽链，MW：60KD，50-100分子分子/细胞。细胞。 单链噬菌体单链噬菌体 M13 DNA和质粒和质粒 Co1E1 DNA复制时，引物的合复制时，引物的合成是由成是由RNA聚合酶催化的。聚合酶催化的。 噬菌体噬菌体T7的的Gene4蛋白，蛋白，T4的的Gene41和和61蛋白等也具有引蛋白等也具有引物酶活性和具有大肠杆菌引物酶相似功能。物酶活性和具有大肠杆菌引物酶相似功能。 引发体：引发体：引物酶与辅助蛋白引物酶与辅助蛋白 (如如 D
19、naB、DnaC、DnaT、PriA、PriB、PriC等等) 组成组成引发体引发体才有活性。才有活性。 引物酶引物酶 (Primase) 和引发体和引发体 (primosome) MW：75kD，单体酶，单体酶 借助借助 ATP 或或 NAD 水解提供能量，催化水解提供能量，催化 dsDNA中中一条一条链的相邻核苷酸之间链的相邻核苷酸之间 5-Pi与与3-OH 之间之间生成磷酸二酯生成磷酸二酯键，封闭键，封闭 DNA 双链上的缺口。双链上的缺口。 不作用：缺少一个或几个核苷酸残基，两条游离的单不作用：缺少一个或几个核苷酸残基，两条游离的单链。链。 DNA 连接酶催化反应可逆。逆反应使共价闭环
20、超螺旋连接酶催化反应可逆。逆反应使共价闭环超螺旋 DNA 产产生有缺口生有缺口 DNA-腺苷酸，生成松弛闭环腺苷酸，生成松弛闭环 DNA。 连接酶在连接酶在 DNA复制复制、损伤、损伤修复修复、重组重组中起重要作用。中起重要作用。 DNA连接酶连接酶 (DNA ligase ) DNA 复制和修复中，必复制和修复中，必须解开须解开 dsDNA 。 螺旋酶首先结合在单链螺旋酶首先结合在单链 DNA上，利用上，利用ATP的能的能量向双螺旋方向移动使量向双螺旋方向移动使DNA双链打开。双链打开。 DNA 解螺旋酶解螺旋酶 (Helicase) DNA 双螺旋经螺旋酶作用形成的单链很快被单链结合蛋白双
21、螺旋经螺旋酶作用形成的单链很快被单链结合蛋白(single strand DNA binding protein, SSB) 所覆盖。所覆盖。 一个一个 SSB 四聚体结合于四聚体结合于 ssDNA 上，可覆盖上，可覆盖32nt，可以促进，可以促进其他其他 SSB 四聚体与四聚体与 ssDNA 结合，出现协同结合。结合，出现协同结合。 单链单链 DNA 结合蛋白结合蛋白 (SSB) 作用作用： 防止防止 ssDNA 被核酸酶降解；使被核酸酶降解；使 ssDNA呈伸呈伸展状态，防止其重新配对形成展状态，防止其重新配对形成dsDNA，有利于，有利于ssDNA作为模板。作为模板。 降低天然降低天然
22、DNA 的熔解温度，促进解链。的熔解温度，促进解链。 SSB 可可重复使用重复使用: 当新生的当新生的 DNA 链合成到某一位置链合成到某一位置时，该处的时，该处的 SSB 便会脱落，并被重复利用。便会脱落，并被重复利用。 DNA 复制时，模板复制时，模板 DNA 需要解开超螺旋，复制完成需要解开超螺旋，复制完成后需要再形成超螺旋。后需要再形成超螺旋。拓扑异构酶拓扑异构酶 通过使通过使 DNA 的的一条链一条链发生断裂和再连接，能使超螺旋发生断裂和再连接，能使超螺旋 DNA 转变成松弛型环状转变成松弛型环状DNA，每催化一次可每催化一次可消除一个负消除一个负超螺旋超螺旋，即使即使 L 增加增加
23、 1，反应，反应无需供给能量无需供给能量。 DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶 (DNA Topisomerase)拓扑异构酶拓扑异构酶 即促旋酶即促旋酶 (DNA gyrase), 需要需要 ATP 提供能量，使提供能量，使 DNA 的的两条链两条链同时断裂和再连接，使松弛型环状同时断裂和再连接，使松弛型环状 DNA 转变成负超转变成负超螺旋螺旋 DNA，每催化每催化 1 次，次，L 减少减少 2。 天然状态天然状态 dsDNA 几乎均以负超螺旋的方式存在。几乎均以负超螺旋的方式存在。 拓扑异构酶拓扑异构酶和拓扑异构酶和拓扑异构酶II 共同控制着共同控制着 DNA 的拓扑结构。的拓扑结构。 DNA
24、 的合成以四种的合成以四种 dNTP 为底物，在为底物，在DNA 膜板的指令膜板的指令下，按碱基配对原则，由下，按碱基配对原则，由 DNA 聚合酶催化，向聚合酶催化，向 DNA 3-OH 端添加核苷酸，以端添加核苷酸，以 5-3的方向合成于膜板互补的方向合成于膜板互补的新链。的新链。 复制过程：起始、延伸和终止。复制过程：起始、延伸和终止。(1) DNA 复制的起始复制的起始 大肠杆菌基因组是一环形大肠杆菌基因组是一环形 dsDNA，其复制是从一个固，其复制是从一个固定复制定复制原点原点 (oriC) 开始的。开始的。 原点形成原点形成复制叉复制叉，经过，经过先导链先导链的连续复制和的连续复制
25、和滞后链滞后链的的 不连续复制，到达终点完成复制。不连续复制，到达终点完成复制。1.3 原核细胞的原核细胞的 DNA 复制复制 复制起点复制起点 DNA复制从分子上固定位置复制从分子上固定位置 (原点原点)开始，此开始，此位置称复制起点位置称复制起点 (Origin of replication，ori)。新生链（红色）新生链（红色） 大多数大多数 DNA 是双向复制，复制时是双向复制，复制时 DNA 双螺旋一边双螺旋一边解链一边合成新链。解链一边合成新链。 复制方向复制方向大肠杆菌大肠杆菌DNA 复制的电镜照片复制的电镜照片复制叉复制叉(replication fork)：DNA正在复制的分
26、叉部位。正在复制的分叉部位。复制眼复制眼 (泡泡)：正在复制的部分在电镜下象只眼睛。：正在复制的部分在电镜下象只眼睛。 复制子复制子 DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止。复制从起点开始双向进行直到终点为止。 含有一个复制原点并能在细胞中自主复制的含有一个复制原点并能在细胞中自主复制的DNA分分子称为子称为复制子复制子或或复制单元复制单元 (replicon)。 原核生物原核生物：单复制子。：单复制子。 真核生物真核生物：多复制子。：多复制子。 复制起点的特性复制起点的特性 oriC几乎都富含几乎都富含A-T序列序列. 很多细菌很多细菌 ori 区结构相似，区结构相似，核苷酸序列有相当保守
27、性，核苷酸序列有相当保守性，分类关系上愈是接近的细分类关系上愈是接近的细菌间同源性愈高，反映了菌间同源性愈高，反映了DNA复制起点的重要性。复制起点的重要性。 将复制起点连接到任一将复制起点连接到任一DNA上，均支持其复制上，均支持其复制。 复制起始步骤复制起始步骤 (引发体的形成引发体的形成)：DnaA 蛋白识别并结合于蛋白识别并结合于 oriC;DnaB 、PriA 和和 DnaG (引物酶引物酶) 蛋白相继结合组成引发体。蛋白相继结合组成引发体。DnaB：解螺旋酶解螺旋酶活性活性 / PriA：水解水解 ATP 推动推动 dsDNA 解链解链 / DnaG：合成：合成最初的最初的 RNA
28、 引物引物 在细菌和大多数病毒中，特异的在细菌和大多数病毒中，特异的 DNA 序列决定了复制的起始。序列决定了复制的起始。E.coli 中，中，OriC 位点位点是其是其 DNA 复制的唯一起点。复制的唯一起点。DNA 复制复合复制复合体参与在体参与在 OriC 处的起始过程。处的起始过程。 OriC 区序列包含区序列包含两个主要重复单位两个主要重复单位9 碱基对重复序列（碱基对重复序列（4个个拷贝）拷贝）和和富含富含 A-T 碱基对的重复区（碱基对的重复区（3个拷贝个拷贝），是多种蛋白的），是多种蛋白的结合位点。结合位点。 大约有大约有 20 个个 DnaA 蛋白与蛋白与 9 碱基对重复区结
29、合，并引起碱基对重复区结合，并引起 DNA结构的变化，导致富含结构的变化，导致富含 13 个个A-T碱基对重复区内双螺旋变性。由碱基对重复区内双螺旋变性。由于于 A-T 碱基对只含有碱基对只含有2个氢键，比起有个氢键，比起有3个氢键的个氢键的G-C碱基对就弱碱基对就弱得多，所以富含得多，所以富含A-T重复区的部位起着使复制泡中心定位的作用。重复区的部位起着使复制泡中心定位的作用。一旦这个区接近其它一旦这个区接近其它DNA复制蛋白，在解旋酶和复制蛋白，在解旋酶和SSB作用下复制作用下复制泡沿双向延伸形成两个复制叉。然后引发酶合成泡沿双向延伸形成两个复制叉。然后引发酶合成RNA引物，引物，DNAp
30、ol III开始前导链和滞后链的合成。开始前导链和滞后链的合成。 (2) DNA链的延伸链的延伸 在复制叉附近，在复制叉附近， DNA 聚合酶聚合酶 结合到结合到 DNA 膜板上。膜板上。由由DNA聚合酶聚合酶 二聚体、引发体和二聚体、引发体和 DnaB 等构成的类等构成的类似核糖体大小的复合体，称为似核糖体大小的复合体，称为 DNA复制体复制体(replisome)。 螺旋酶螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链，在复制叉处边移动边解开双链，DNA 聚合酶聚合酶 催化催化 DNA 新生链的合成。新生链的合成。解除正超螺旋的机制解除正超螺旋的机制: DNA 解链时必产生正超螺旋，当达到一定程度后就会
31、造成解链时必产生正超螺旋，当达到一定程度后就会造成复制叉难以继续前进而终止复制叉难以继续前进而终止DNA复制。而细胞内复制。而细胞内DNA复制复制不会因出现拓扑学问题而停止。不会因出现拓扑学问题而停止。 拓扑异构酶拓扑异构酶II 在复制叉前方向在复制叉前方向 dsDNA中引入负超螺旋，当中引入负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可被原来存在的负超螺旋所解链而产生正超螺旋时，可被原来存在的负超螺旋所中和。中和。 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶可打开一条链，使正超螺旋状态转变成可打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；松弛状态；前导链和滞后链前导链和滞后链： 当复制叉沿当复制叉沿 DNA 向前移
32、动时，由于两条链是反向平向前移动时，由于两条链是反向平行的，而行的，而 DNA 聚合酶只能以聚合酶只能以 53 的方向合成新链，的方向合成新链，同时新链必须与膜板链反向平行、碱基配对。同时新链必须与膜板链反向平行、碱基配对。 这样，若以走向这样，若以走向 35 的亲代为膜板，子代链就能的亲代为膜板，子代链就能连续合成，成为连续合成，成为前导链前导链 (leading strand)。 若以走向若以走向 53 的亲代为膜板时，的亲代为膜板时，DNA 聚合酶聚合酶 III 只能按只能按 53 的方向合成许多小片段，然后由的方向合成许多小片段，然后由 DNA 聚合酶聚合酶 I 切除片段上的引物，填补
33、片段之间的空缺，切除片段上的引物，填补片段之间的空缺，最后由连接酶把它们连接成一条完整的子代链，称最后由连接酶把它们连接成一条完整的子代链，称为为滞后链滞后链 (lagging strand)。前导链前导链冈崎片段冈崎片段复制方向复制方向滞后链滞后链 半不连续复制半不连续复制 (semidiscontinuous replication)：在复制叉上新：在复制叉上新生的生的 DNA 链一条按链一条按 53 的方向的方向 (与复制叉移动的方向一致与复制叉移动的方向一致) 连连续合成；另一条则按续合成；另一条则按 53 的方向的方向 (与复制叉移动的方向相反与复制叉移动的方向相反) 不连续合成。不
34、连续合成。半不连续复制：半不连续复制： 每个复制叉上仅结合着每个复制叉上仅结合着一个一个 DNA 聚合酶聚合酶 III 全酶的二聚体全酶的二聚体，它是如何同时进行先导联合制它是如何同时进行先导联合制后链的合成的？后链的合成的？ 滞后链的膜板绕聚合酶向后回滞后链的膜板绕聚合酶向后回折成环。并与聚合酶的另一个折成环。并与聚合酶的另一个活性中心按先导链膜板的取向活性中心按先导链膜板的取向缔合。缔合。 先导链和滞后链的合成速度相先导链和滞后链的合成速度相近。因为在复制叉上一套酶可近。因为在复制叉上一套酶可以同时在两条链上进行复制。以同时在两条链上进行复制。DNA复制的终点复制的终点 ter 在在DNA
35、上存在着复制终止位点上存在着复制终止位点 ter，某些蛋白因子，某些蛋白因子可识别终止位点的序列，使可识别终止位点的序列，使DNA复制在终止位点终复制在终止位点终止。止。 大肠杆菌两个复制叉在相距终点大肠杆菌两个复制叉在相距终点 100 kb 时，复制速时，复制速度减慢，从而协调度减慢，从而协调 2 个复制叉到达的时间。个复制叉到达的时间。 DNA 复制终止时，当复制终止时，当 RNA 引物被切除后，中间所引物被切除后，中间所遗留间隙遗留间隙 由由 DNA pol填充，最后由填充，最后由 DNA Ligase 封口。封口。(3) DNA复制的终止复制的终止(4) DNA复制的真实性复制的真实性
36、 大肠杆菌每复制大肠杆菌每复制109-1010 nt便出现一个误差，大肠杆菌染便出现一个误差，大肠杆菌染色体中有色体中有4.5106 bp , 平均平均 1 不正常不正常 Nt/1000 细胞细胞 靠靠 DNA 聚合酶来实现：聚合酶来实现： 每个每个 Nt 掺入有两次被选择机会：首先按掺入有两次被选择机会：首先按碱基配对碱基配对原原则，错误则，错误 Nt 掺入机率为掺入机率为 10-410-5，然后，然后 DNA聚合酶本聚合酶本身的身的校对作用校对作用又可使错误又可使错误 Nt 掺入机率为掺入机率为 10-410-5。1. DnaA 等蛋白质结合到大肠杆菌复制起始位点等蛋白质结合到大肠杆菌复制
37、起始位点 oriC 的特的特征核苷酸序列上。征核苷酸序列上。引发体引发体2. Helicase 帮助将双链帮助将双链 DNA 解旋成单链解旋成单链 DNA。3. SSB 蛋白与单链蛋白与单链 DNA 结合帮助稳定单链结构。结合帮助稳定单链结构。4. Primase 合成合成 RNA 片段。片段。5. DNA pol III以以 RNA片段为引物开始合成片段为引物开始合成 DNA。 DNA复制体复制体6. DNA 复制叉的形成复制叉的形成,，DNA 合成向两个方向同时进行合成向两个方向同时进行, 滞滞后链上的后链上的 Okazaki 片段不断被连接成大片段。片段不断被连接成大片段。7. 拓扑异构
38、酶帮助消除复制过程中拓扑异构酶帮助消除复制过程中 DNA 螺旋产生的纠缠。螺旋产生的纠缠。8. RNA引物被引物被 DNA polI 去除，补齐缺口。去除，补齐缺口。9. 最终由连接酶连接成完整的最终由连接酶连接成完整的 DNA。10.复制中止。复制中止。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA复制全过程复制全过程1.4 真核生物的真核生物的 DNA 复制复制(1) 染色质复制染色质复制 真核和原核生物真核和原核生物 DNA 复制基本特征相同。但由于真核复制基本特征相同。但由于真核 DNA 比原核远比比原核远比 DNA 大，并且大多数真核生物是由大，并且大多数真核生物是由多细胞组成，因此真核生物多细胞组成
39、，因此真核生物 DNA 复制机制更为复杂。复制机制更为复杂。主要区别主要区别： 多复制起点，双向复制，构成多复制起点，双向复制，构成多个复制子多个复制子。 真核生物的复制子在每个细胞周期仅起始一次复制。真核生物的复制子在每个细胞周期仅起始一次复制。 冈崎片段长约冈崎片段长约 100200 bp ，核小体，核小体 DNA 的长度。的长度。 涉及涉及 DNA 链与组蛋白的解开和重新组装，组蛋白为全链与组蛋白的解开和重新组装，组蛋白为全保留复制，直接转移到子代保留复制，直接转移到子代前导链上前导链上。真核细胞的真核细胞的 DNA 聚合酶：聚合酶： 真核生物染色体真核生物染色体 DNA 为线性分子，为
40、线性分子，DNA 复制时，以复制时，以 53 的方向合成新链，其的方向合成新链，其5-端不能被合成，即端不能被合成，即 5-末端末端 RNA 引物被切除后是无法被引物被切除后是无法被 DNA 聚合酶所填充。从而使聚合酶所填充。从而使染色体端部随复制次数增加而不断缩短。染色体端部随复制次数增加而不断缩短。 解决：解决：端粒酶端粒酶 端粒端粒 (telomere): 真核生物染色体的两个末端序列，为多真核生物染色体的两个末端序列，为多拷贝的富含拷贝的富含 G 的六核苷酸重复序列。在四膜虫中该重复的六核苷酸重复序列。在四膜虫中该重复序列是序列是 GGGTTG。 端粒有两种功能：端粒有两种功能： 维持
41、染色体的完整性，防止染色体间末端连接。维持染色体的完整性，防止染色体间末端连接。 解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。(2) 端粒复制端粒复制 端粒酶端粒酶包含一段与端包含一段与端粒序列互补的粒序列互补的 RNA，能以此能以此 RNA 做为模做为模板板, 由由 53 方向延方向延伸端粒伸端粒 (反转录反转录)。然后引发酶及然后引发酶及 DNA 聚合酶再依照合成滞后链的方式聚合酶再依照合成滞后链的方式, 由由53 方向延伸另一股方向延伸另一股, 虽落后股仍比模板链短，虽落后股仍比模板链短， 但整个但整个 DNA 已被加长。已被加长。
42、1986年，年，HowardCooke首先注意到，端粒的长度在体首先注意到，端粒的长度在体细胞内比在生殖细胞内短。细胞内比在生殖细胞内短。进一步的研究发现，端粒酶在生殖细胞内经常被表现进一步的研究发现，端粒酶在生殖细胞内经常被表现出来，所以端粒的长度一直保持在出来，所以端粒的长度一直保持在15kb左右。左右。端粒酶与老化端粒酶与老化大多数体细胞不制造端粒酶，每次分裂后端粒就变短大多数体细胞不制造端粒酶，每次分裂后端粒就变短(大约大约100bp)。当端粒比正常长度短数千个碱基对当端粒比正常长度短数千个碱基对，细胞就不再分裂。细胞就不再分裂。所以端粒变短是一种老化的象徵。已经有实验证明，所以端粒变
43、短是一种老化的象徵。已经有实验证明，将端粒酶加进体细胞，可以增加体细胞分裂的次数。将端粒酶加进体细胞，可以增加体细胞分裂的次数。癌细胞的主要特性是能够无限期的分裂增生，这需要癌细胞的主要特性是能够无限期的分裂增生，这需要不断表现端粒酶。实验的确发现，癌细胞的端粒酶不断表现端粒酶。实验的确发现，癌细胞的端粒酶活性活性很强很强。这点可以被用来检验癌细胞。这点可以被用来检验癌细胞。端粒酶亦可能被用於肌肉萎缩症端粒酶亦可能被用於肌肉萎缩症 (muscular dystrophy)。它是由它是由dystrophin基因突变引起，使肌肉细胞很快基因突变引起，使肌肉细胞很快 退化。虽然肌肉细胞退化。虽然肌肉
44、细胞(stem cells)能分裂增生新细胞能分裂增生新细胞取代受损细胞，取代受损细胞， 但经过多次分裂之后，但经过多次分裂之后， 端粒变短，端粒变短， 就无法再增生。就无法再增生。若将端粒酶引入细胞，可能加强增生的潜力，延缓肌若将端粒酶引入细胞，可能加强增生的潜力，延缓肌肉萎缩的速度。端粒酶可被应用到与老化相关的疾肉萎缩的速度。端粒酶可被应用到与老化相关的疾病病。 在在 RNA 病毒中发现了一种特殊的病毒中发现了一种特殊的 DNA 聚合酶，以聚合酶，以 RNA为模板，根据碱基配对原则，按照为模板，根据碱基配对原则，按照 RNA 的核苷酸的核苷酸顺序合成顺序合成DNA, 与一般遗传信息流转录方
45、向相反，故称与一般遗传信息流转录方向相反，故称为反转录，催化此过程的为反转录，催化此过程的 DNA 聚合酶叫做聚合酶叫做逆转录酶逆转录酶。 反转录酶反转录酶不仅普遍存在于不仅普遍存在于 RNA 病毒中病毒中，哺乳动物胚胎，哺乳动物胚胎 细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有逆转录酶。细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有逆转录酶。 2. 逆转录作用逆转录作用(reverse transcription)(1) 具有多种酶活性：具有多种酶活性： DNA 聚合酶活性聚合酶活性：以：以 RNA 为模板，催化为模板，催化 dNTP 以以53方向合成方向合成 DNA。需要。需要 RNA 为引物。合成的为引物。合成的 c
46、DNA 与模板与模板 RNA 形成形成 RNA-DNA 杂交分子。杂交分子。 RNase H 活性活性：水解：水解 RNA-DNA 杂交分子中的杂交分子中的 RNA，具有具有 53 和和 3 5 外切酶的活性。外切酶的活性。 DNA 指导的指导的 DNA 聚合酶活性聚合酶活性：以反转录合成：以反转录合成 DNA单链为模板，以单链为模板，以 dNTP 为底物，再合成互补的第二条为底物，再合成互补的第二条 DNA 分子。分子。(2) 逆转录过程逆转录过程 逆转录病毒逆转录病毒 (retrovirus) 致癌致癌 RNA 病毒都含逆病毒都含逆转录酶，所以被称为逆转录酶，所以被称为逆转录病毒。转录病毒
47、。 嗜肝嗜肝 DNA 病毒病毒如：乙型肝炎病毒如：乙型肝炎病毒 (hepatis B virus)，虽然，虽然不是不是 RNA 病毒，但在病毒，但在复制周期中也需经过逆复制周期中也需经过逆转录步骤。转录步骤。生物学意义生物学意义： 扩充了中心法则。扩充了中心法则。 有助于人们对有助于人们对 RNA 病毒致癌机理的了解，对防治病毒致癌机理的了解，对防治肿瘤提供了重要线索。肿瘤提供了重要线索。 反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大推动作反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大推动作用用, 已成为一种重要的工具酶。已成为一种重要的工具酶。 用组织细胞提取用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转并以
48、它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补录酶的作用下，合成出互补DNA (cDNA)，由此可由此可构建出构建出 cDNA文库文库 (cDNA library)， 从中筛选特异从中筛选特异的目的基因，是基因工程的目的基因，是基因工程 技术中最常用的获得目的技术中最常用的获得目的基因的方法。基因的方法。 外界环境和生物体内部因素常会导致外界环境和生物体内部因素常会导致 DNA 分子的损分子的损伤或改变，原核细胞中只有一份伤或改变，原核细胞中只有一份 DNA，真核二倍体，真核二倍体细胞中相同细胞中相同 DNA 也只有一对，如果也只有一对，如果 DNA 损伤或遗损伤或遗传信息改变不能更正，对体细胞就可
49、能影响其功能或传信息改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到后代。生存，对生殖细胞则可能影响到后代。 在进化过程中，生物细胞修复在进化过程中，生物细胞修复 DNA 损伤的能力，显损伤的能力，显得十分重要，使生物得十分重要，使生物保持遗传稳定性保持遗传稳定性。另一方面，在。另一方面，在生物进化中，突变是与遗传相对立统一而普遍存在生物进化中，突变是与遗传相对立统一而普遍存在, DNA 分子的变化并不是全部都能被修复成原样，正分子的变化并不是全部都能被修复成原样，正是因为如此生物才会有变异、有进化。是因为如此生物才会有变异、有进化。 3. DNA的损伤、修复与突变的损伤、
50、修复与突变 以以DNA为模板，按碱基配对进行为模板，按碱基配对进行DNA复制，是严格复制，是严格而精确的，但也不是完全不发生错误的。而精确的，但也不是完全不发生错误的。 碱基配对的错误频率碱基配对的错误频率：在：在 DNA 聚合酶的作用下碱基聚合酶的作用下碱基错配率有错配率有 10-10 左右。左右。 由于微卫星由于微卫星 DNA （Microsatellite DNA）多存在）多存在 2、3或或 4 核苷酸序列的重复核苷酸序列的重复（eg : CA, CGG, CAG），复制机），复制机器很难精确拷贝这种重复序列，会发生器很难精确拷贝这种重复序列，会发生“打滑打滑”，导致重，导致重复序列的拷
