1、基因诊断基因诊断(gene diagnosis)(gene diagnosis)： 以以DNADNA和和RNARNA为诊断材料，为诊断材料， 应用分子生物应用分子生物学技术方法，直接检查基因的结构、或表达是否学技术方法，直接检查基因的结构、或表达是否异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。一、诊断下列两种类型疾病：一、诊断下列两种类型疾病：1 1、内源基因的变异、内源基因的变异 基因结构的异常基因结构的异常基因致病基因致病 基因表达的异常基因表达的异常2 2、外来生物的入侵、外来生物的入侵 基因诊断的特点：基因诊断的特点：1.1.特异性高，针对性强：特异性高
2、，针对性强： 使用基因探针通过分子杂交使用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病原因分析。断或发病原因分析。2. 2. 灵敏度高灵敏度高: : 用放射性同位素、酶或化学发光试剂标用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，记探针，有很高的检测灵敏度，PCRPCR扩增也有很高的扩增也有很高的灵敏度。灵敏度。3.3.早期诊断：早期诊断：无临床表现无临床表现4.4.取样方便：取样方便：不受组织时相限制不受组织时相限制5.5.安全高效：安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型不必培养高危病菌病毒，还可
3、分亚型6. 6. 适应范围广：适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。可检测内源性基因和外来基因。二、基因诊断的遗传标记n1. 人类基因组中存在三类主要的遗传变异n（1）第一代多态性标记是RFLP（限制性片段长度多态性)n(2)第二代短串联重复多态性（short tandem repeat polymorphism STRP）n(3)第三代多态性标记是单核苷酸的多态性SNP第一代多态性标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代多态性标记是短的串联重复序列 包括小卫星DNA和微卫星DNA，其多态性主要来自重复序
4、列拷贝数的变化小卫星DNA由15-65bp的基本单位串联重复而成，长度一般不超过20kb。重复次数（小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的；按照孟德尔的规律遗传微卫星DNA/简短串联重复（STR、STRP或SSLP）重复单元2-8bp，通常重复10-60次CTAGCTTATATATATATATATATATATATAAGCTTGC第三代多态性标记是单核苷酸的多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）SNP：是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性
5、”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础,从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。 SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于，它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。三、人类疾病与基因密切相关n1、基因结构改变导致蛋白质的结构或数量发生变化导致疾病n2、基因表达异常n3、病原生物基因入侵导致疾病n4、可遗传的基因组变异导致人类疾病易感性差异四、基因诊断中常用的分子生物学技术四、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridizationNucleic acid hybridization） n聚
6、合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR) (PCR) n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP） n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP） nDNADNA序列测定（序列测定（DNA sequencingDNA sequencing） n生物芯片（生物芯片（biochipsbiochips） nWesternWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blottingWestern blotting） n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法方法 优点与问题优点与问题 解决方案解决方案核酸分
7、子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使可自动化，但不适宜广泛使用用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广效率高，成本高，不适宜广泛使用泛使用选择合适的芯片选择合适的芯片 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 Gene Diagnosi
8、s of Hereditary Gene Diagnosis of Hereditary DiseasesDiseases（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断-ASO-ASO杂交法杂交法2.HBS2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.HBS3.HBS的的PCR-RFLPPCR-RFLP分析分析 n正常的（正常的（N N）的）的ASOASO探针：探针： 5 5 -ACT CCT G-ACT CCT GA AG GAG AAG TCT GC-3G GAG AAG TCT GC-3 n突变的（
9、突变的（M M）的）的ASOASO探针：探针： 5 5 -ACT CCT G-ACT CCT GT TG GAG GAAG TCT GC-3G GAG GAAG TCT GC-3 1.1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASOASO杂交法杂交法M NM NM NM NM NM NM NM N5 5 3 3 正常基因正常基因1.15kb1.15kb(CCT GAG G)(CCT GAG G)5 3 突变基因突变基因1.35kb1.35kb(CCT G(CCT GT TG G)G G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析MstMst酶切位点酶切位
10、点（CCTNAGGCCTNAGG）2. HBS2. HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析目目 录录0.2kb0.2kb1.15kb1.15kb1.35kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目 录录 PCR-SSCP技术检测技术检测DNA突变突变 传染病的基因诊断传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Gene Diagnosis of Infectious DiseasesDiseases 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAVHA
11、V） HAVHAV系系RNARNA病毒，利用病毒，利用RT-PCRRT-PCR技术可从粪便中检技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组测出甲型肝炎病毒的基因组RNARNA。 n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV） 设计保守区序列引物，扩增各型设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNAHBV DNA片段；片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNAHBV DNA，以便分型。以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCVHCV） HCVHCV为正链为正链RNARNA病毒，先反转录成病毒，先反转录成cDNAcDNA，再进行，再进行巢式巢式PCRPCR检测
12、检测HCVHCV。 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Malignant TumorsGene Diagnosis of Malignant Tumors一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1 1原癌基因的检测原癌基因的检测 rasras 基因家族基因家族由由H-rasH-ras、K-rasK-ras和和N-rasN-ras组成。最组成。最常见的突变是第常见的突变是第1212、1313、5959或第或第6161位密码子的点突变。位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-rasK-ras突变为主，如第突变为主，如第121
13、2位密码子突变，由编码甘氨酸的位密码子突变，由编码甘氨酸的GGTGGT突变为突变为TGTTGT、GTTGTT或或GATGAT，少，少数突变为数突变为GCTGCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-N-rasras突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-rasH-ras突变为主。突变为主。 PCRPCR及及PCR-SSCPPCR-SSCP分析：分析：扩增扩增ras ras 基因第基因第1212位密码位密码子点突变部位，再用子点突变部位，再用SSCPSSCP技术进行分析，或者直接技术进行分析，或者直接测序确定患者测序确定患者r
14、asras原癌基因的点突变。原癌基因的点突变。 核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASOASO）：）：检测检测rasras基因第基因第1212位位密码子点突变。密码子点突变。2.2. ras ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法3 3抑癌基因抑癌基因p53p53的检测的检测 np53p53基因以密码子第基因以密码子第175175位、第位、第248248位、第位、第249249位、位、第第273273位及位及 第第282282位点突变率最高。在结直肠癌、位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53p53基因蛋白。基因蛋
15、白。np53p53的基因诊断方法有的基因诊断方法有 （1 1）PCR-SSCPPCR-SSCP分析技术分析技术 （2 2）DNADNA序列分析序列分析 （3 3）PCR-RFLPPCR-RFLP分析分析基因治疗基因治疗Gene TherapyGene Therapyn基因治疗：基因治疗：指将目的基因通过基因转移技指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。表达产物对疾病起治疗作用。 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacement
16、gene replacement） 定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。有的缺陷基因。 目的：目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略n转导基因的载体与基因组转导基因的载体与基因组DNADNA具有相同的序具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重列。带有
17、目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。组的位点，进行部分基因序列的交换。n基因同源重组技术又称为基因同源重组技术又称为基因打靶（基因打靶（gene gene targeting)targeting)基因同源重组技术基因同源重组技术（二）（二） 基因添加（基因添加（gene augmentationgene augmentation） 定义定义: : 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。不表达的基因。类型类型: :在有缺陷基因的细胞中在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导
18、入正常基而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向靶细胞中向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因导入靶细胞本来不表达的基因，利用，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。其表达产物达到治疗疾病的目的。（三）基因干预（三）基因干预（gene interferencegene interference） 定义：定义： 采用特定的方式采用特定的方式抑制某个基因的表达抑制某个基因的表达，或，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。以达到治疗疾病的目的。 反义反义RNARNA，
19、核酶，核酶，RNAiRNAi等等n定义：定义：将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，这种基基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀自杀”效应，从而效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。达到清除肿瘤细胞的目的。n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy(Suicide Gene Therapy)自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫
20、治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因通过将抗癌免疫增强的细胞因子或子或MHCMHC基因导入肿瘤组织，以增强肿基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。瘤微环境中的抗癌免疫反应。 THANK YOUSUCCESS2022-7-5二、基因转移技术二、基因转移技术 基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径体内法基因治疗体内法基因治疗体外法基因治疗体外法基因治疗 基因转移基因转移( (gene transfer)gene transfer)技术技术 1.1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2. 2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统
21、病毒载体病毒载体 介导的基因转移效率较高，也是使用最介导的基因转移效率较高，也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有多的基因治疗载体。据统计，有72%72%的临床的临床实验计划和实验计划和71%71%的病例使用了病毒载体，其的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体中用得最多的是反转录病毒载体。反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 p两端各有一长末端重复序列两端各有一长末端重复序列LTRLTR。 反转录病毒前病毒的结构特点反转录病毒前病毒的结构特点 pLTRLTR由由U3U3、R R和和U5U5三部分组成。三部分组成。p病毒有三个结构基因
22、病毒有三个结构基因p55端端LTRLTR下游有一段病毒包装所必需的序列（下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接）及剪接供体位点供体位点( (SD)SD)和剪接受体位点和剪接受体位点( (SA)SA)。 p含有负链含有负链DNADNA转录的引物结合位点转录的引物结合位点( (PBS)PBS)和正链和正链DNADNA转录的转录的引物结合位点引物结合位点。l在在U3U3内有增强子和启动子；内有增强子和启动子； l U3U3和和U5U5两端分别有病毒整合序列两端分别有病毒整合序列( (IS)IS) ；l 在在R R内还有内还有poly(A)poly(A)加尾信号。加尾信号。 lgaggag基因，编码
23、核心蛋白和属特异性抗原；基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；lpolpol基因，编码反转录酶；基因，编码反转录酶；lenvenv基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白( (包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白) )。 反转录病毒载体的制备和转染反转录病毒载体的制备和转染反转录病毒介导的基因转移系统反转录病毒介导的基因转移系统1)1)反转录病毒载体：反转录病毒载体： 它可以克隆并表达外源治疗基因，但不能它可以克隆并表达外源治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。 2 2）辅助细胞株）辅助细胞株( (如如PA317PA317)
24、 )： 能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装。包装。 反转录病毒载体的特点反转录病毒载体的特点 1 1）反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶高效地进入靶细胞细胞。 2)2)前病毒通过前病毒通过LTRLTR高效整合至靶细胞基因组高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达永久表达。 3) 3) 病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞病毒颗粒以出芽的方
25、式分泌至辅助细胞培养的上清液中，培养的上清液中，易于分离制备易于分离制备。 反转录病毒载体的主要缺点反转录病毒载体的主要缺点 1 1）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；险； 2 2）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 7kbkb以下以下的外源基因。的外源基因。 （2 2）腺病毒）腺病毒( (adenovirus)adenovirus)载体载体 腺病毒是双链腺病毒是双链DNADNA病毒。它通过受体介导的病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转
26、移至细胞核内，保持在染色体外，核内，保持在染色体外，不整合不整合进入宿主细胞基因组进入宿主细胞基因组中。中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。 腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；l重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸
27、入或气管内滴注；入或气管内滴注；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 7.5 kbkb外源基因。外源基因。 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点l宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。l靶向性差。靶向性差。 l不能整合不能整合到靶细胞的基因组到靶细胞的基因组DNADNA中。分裂增中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，而丢失的机会增多，表达时间相对较短表达时间相对较短。（3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体 单链线状单链线状DNADNA缺陷型病毒。其基因组缺陷型病毒。
28、其基因组DNADNA小于小于5 5kbkb，无包膜，外形为裸露的无包膜，外形为裸露的2020面体颗粒。面体颗粒。AAVAAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAV Virus Particles AAV AAV载体是目前正在研究的一类新型安载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。全载体，它对人类无致病性。 AAVAAV可以高效定点整合至人可以高效定点整合至人1919号染色体
29、的特定号染色体的特定区域区域1919q13.4q13.4中，中，并能较稳定地存在。这种靶向定并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。 AAVAAV载体的缺陷载体的缺陷 AAVAAV载体容量小，目前最多只能容纳载体容量小，目前最多只能容纳5 5 kbkb外源外源DNADNA片段
30、；片段；感染效率比反转录病毒载体低感染效率比反转录病毒载体低, ,在在40%40%- -80%80%的成人中存在过感染的成人中存在过感染; ;可能会可能会引起免疫排斥。引起免疫排斥。常用基因治疗载体常用基因治疗载体 整合整合致病性致病性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量反 转 录 病反 转 录 病毒毒 载载体体随机整合，随机整合，效率高效率高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb7kb腺 病 毒 载腺 病 毒 载体体不整合，可不整合，可能丢失能丢失不致病不致病分裂细胞、分裂细胞、非 分 裂 细非 分 裂 细胞胞 腺 相 关 病腺 相 关 病毒载体毒载体定 点 整 合定 点 整 合(19(19号染
31、色号染色体特定区域体特定区域) )不致病不致病分裂细胞、分裂细胞、非 分 裂 细非 分 裂 细胞胞5kb5kb7.5kb7.5kb 2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 基本原理基本原理: :利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可混合后，可以自动形成包埋外源以自动形成包埋外源DNADNA的脂质体，与细胞一起孵育，的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源即可通过细胞内吞作用将外源DNADNA转移至细胞内，并转移至细胞内，并进行表达。进行表达。 脂质体介导的基因转移技术
32、使用方便、成本低廉。脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图 （2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNADNA通过多聚阳离子与细胞配体通过多聚阳离子与细胞配体偶联，多聚阳离子与配体共价连接后，又通偶联，多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的过电荷相互作用与带负电荷的DNADNA结合，将结合，将DNADNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源从而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶
33、细胞。受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图 （3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 q将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%40%40%；q将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；糖尿病所缺少的胰岛素；q肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需基因，可产生血友病所需的凝血因子的凝血因子 。 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点p制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒DNADNA重
34、组体的技术较容重组体的技术较容易；易；p排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；p导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；逆转的缺点；p基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 三、基因干预三、基因干预 （gene interferencegene interference）（一）反义（一）
35、反义RNARNA（antisense RNAantisense RNA） （二）干扰（二）干扰RNA RNAiRNA RNAi （三）核酶技术（三）核酶技术 四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究 （一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 ( (一一) )遗传病基因治疗必须符合以下要求遗传病基因治疗必须符合以下要求1.1.在在DNADNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.3.该基因的表达不需要精确调控；该基因的表达不需要精确调控；4.4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中
36、表该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用；达并发挥其生理作用；5.5.该遗传病不经治疗将有严重后果该遗传病不经治疗将有严重后果( (如不治疗难以如不治疗难以存活等存活等) )。可供选择并符合上述。可供选择并符合上述4 4条以上要求的条以上要求的不过只有不过只有3030余种遗传病。余种遗传病。n腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶( (ADA)ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 ( (PNP)PNP)缺乏症缺乏症 n珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 n血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 n苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿
37、症和其他先天性代谢缺陷病 n莱莱- -纳纳( (Lesch-Nyhan)Lesch-Nyhan)综合征综合征 n家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 n囊性纤维化病囊性纤维化病 腺苷酸脱氨酶（ADA）基因缺乏症（二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；基因以抑制癌症的发生、发展和转移；（2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；录和翻译，发挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组）增强
38、肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。 (5) (5) 提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏 基因治疗；基因治疗； 耐药基因治疗。耐药基因治疗。 临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：临两大难题：（1 1）患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在）患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次
39、化疗的患者，其体内的差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交叉耐受，最终导致化疗失败。产生交叉耐受，最终导致化疗失败。（2 2）大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨）大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。髓造血细胞的功能受到抑制。 药物增敏基因治疗：药物增敏基因治疗： 为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以将某些细胞，可以将某些药物增敏基因导入药物增敏基因导入肿瘤细胞，肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞
40、，使特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。增强化疗效果的目的。 提高化疗效果的辅助基因治疗提高化疗效果的辅助基因治疗 耐药基因治疗：耐药基因治疗： 肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶： 多药耐药（多药耐药（mdr-1mdr-1）基因编码的基因编码的P-P-糖蛋白、多药耐糖蛋白、多药耐药相关蛋白（药相关蛋白（MRPMRP）以及肺耐药相关蛋白等；以及肺耐药相关蛋白等； 细胞内氧化和解毒作用的酶系统：细胞内氧化和解毒作用的酶系统： 细胞色素细胞色素P-450P-450（c
41、ytochrome P-450cytochrome P-450）、）、谷胱甘肽谷胱甘肽S-S-转移酶（转移酶（GSTGST）以及谷胱甘肽过氧化物酶（以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PXGSH-PX）等。等。 向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，增强骨向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，达到髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。彻底杀灭肿瘤细胞的目的。五、基因治疗的问题与展望五、基因治疗的问题与展望n 缺乏高效、缺乏高效、 靶向性的基因转移系统靶向性的基因转移系统n 缺乏有效的治疗靶基因缺乏有效的治疗靶基因n 真核生物表达调控机制未完全阐明真核生物表达调控机制未完全阐明n 缺乏准确的疗效评价缺乏准确的疗效评价n谢谢！THANK YOUSUCCESS2022-7-5
