1、资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 学习本章节的总体要求学习本章节的总体要求 * *1. 1. 熟悉免疫组织化学技术特点熟悉免疫组织化学技术特点及其原理及其原理 * *2.2.掌握免疫组织化学染色的操作流掌握免疫组织化学染色的操作流 程程 * *3.3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制剂的来源和质量控制 4.4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求了解多克隆抗体制备程序与操作要求 5.5.了解单克隆抗体制备原理和步骤了解单克隆抗体制备原理和步骤 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。概概 论论 一、什么是免疫组织化学一、什么是免疫组织化
2、学 免疫组织化学是应用免疫学和组免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对细胞组织标本中的某织化学原理，对细胞组织标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进行些多肽、蛋白质等大分子物质进行定定性、定位、定量研究性、定位、定量研究的的一门科学。一门科学。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。这项技术本质上是一种这项技术本质上是一种染色及原染色及原位示踪技术位示踪技术，它是在它是在酶组织化学酶组织化学基础基础上发展起来的，始于上发展起来的，始于2020世纪中期世纪中期。二、发展历史二、发展历史资料仅供参考,不当之处，请联系改正。免疫荧光标记抗体技术免疫荧光标记抗体技术-Coons 1940年年免疫酶标抗
3、体技术免疫酶标抗体技术-Abakane 1963不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术-Sternberger 1970胶体金免疫标记技术和亲和标记技术胶体金免疫标记技术和亲和标记技术-Hsu 1985资料仅供参考,不当之处，请联系改正。免疫试剂免疫试剂，自自1975年年Kohler和和Milstein发明了单克隆抗体制备的发明了单克隆抗体制备的杂交瘤杂交瘤技术技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多
4、数都为都为单克隆抗体单克隆抗体。 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 1.特异性强特异性强 专一专一 2.敏感性高敏感性高 检测阈值达检测阈值达ng或或pg水平水平 3.定位准确定位准确 既可定性、定位，又可定既可定性、定位，又可定量量 4.三位一体三位一体 形态、功能和代谢三结合形态、功能和代谢三结合 缺点：缺点：干扰多，易出现干扰多，易出现假阳性假阳性 三、技术特点（优点）三、技术特点（优点）资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 （一）（一） 组织处理与切片选择组织处理与切片选择 （二）免疫染色的前处理（二）免疫染色的前处理 试剂准备（示踪，放大，标记）试剂准备（示踪，放大，标记） 消化
5、消化 阻断阻断*（三）免疫组化染色（三）免疫组化染色 原理、优缺点、流程原理、优缺点、流程 （四）免疫染色的后处理（四）免疫染色的后处理 增强、衬染、封固增强、衬染、封固 四、四、免疫组织化学染色操作步骤免疫组织化学染色操作步骤资料仅供参考,不当之处，请联系改正。* *（五）结果判断与对照设置（五）结果判断与对照设置 方法众多方法众多 敏感不同敏感不同 程序雷同程序雷同 按需选用按需选用 关键步骤：关键步骤：特异抗体特异抗体-桥联抗体桥联抗体-标记抗体标记抗体种系必需匹配种系必需匹配 （第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体） 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
6、第一节第一节 抗原和抗体抗原和抗体资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一、一、抗原抗原：凡能刺激机体产生特异性免疫应答（凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免免疫原性疫原性），并能与相应免疫应答物（抗），并能与相应免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合（异性结合（反应原性反应原性）的物质。）的物质。抗原的免疫原性抗原的免疫原性取决于抗原的取决于抗原的异物性异物性；大分子大分子；表表面积面积；专一决定簇专一决定簇等等。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。免疫原性反应原性完全抗原complete antigen有有半抗原hepten无有半抗原载体蛋白
7、半抗原载体蛋白 全抗原全抗原载体蛋白：载体蛋白：BSA 、 多聚赖氨酸多聚赖氨酸 、 牛甲状腺球蛋白等；牛甲状腺球蛋白等； （免疫原性强，易获得，交叉反应易去除）（免疫原性强，易获得，交叉反应易去除）交联要求：交联要求：不改变半抗原的分子构型；不改变半抗原的分子构型； 远离半抗原的抗原决定簇；远离半抗原的抗原决定簇； 高结合率（结合半抗原数目至少高结合率（结合半抗原数目至少20个以上）个以上）交联剂交联剂资料仅供参考,不当之处，请联系改正。n 抗原决定簇抗原决定簇(表位表位)：抗原分子中决抗原分子中决n定定抗原特异性的活性抗原特异性的活性化学基团化学基团，其性，其性n质、数量、空间构型决定抗原
8、的特异性。质、数量、空间构型决定抗原的特异性。n-免疫组化的精确性、特异性精确性、特异性 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。交叉反应：交叉反应：抗原（或抗体）除与其抗原（或抗体）除与其相应抗体（或抗原）特异结合外，相应抗体（或抗原）特异结合外，有时可与其他抗体（或抗原）发生有时可与其他抗体（或抗原）发生反应。反应。-多数天然抗原表面带有多个相同或不同的表位-不同抗原的表位相同或相似的情况下可发生交叉反应-免疫组化的假阳性假阳性资料仅供参考,不当之处，请联系改正。二、抗体二、抗体nB细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。n-可与相
9、应抗原特异性结合可与相应抗原特异性结合n-亦可作为抗原，激发免疫应答亦可作为抗原，激发免疫应答资料仅供参考,不当之处，请联系改正。抗体的分子结构抗体的分子结构 1.1.抗体分子在立体构型上都是抗体分子在立体构型上都是IgIg， 但但 IgIg不都是抗不都是抗体。体。 2.2.各类各类IgIg的基本单位都是四条肽链的对称结构的基本单位都是四条肽链的对称结构, ,包包括二条相同的括二条相同的重链重链(heavy chain, H(heavy chain, H链链),),及二条及二条相同的相同的轻链轻链(light chain,L(light chain,L链链),),每条重链每条重链(H(H链链)
10、 )和和轻链轻链(L(L链链) )分为氨基端分为氨基端(N(N端端) )和羧基端和羧基端(C(C端端) )。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 3 .两条重链间，两条轻链间及重链两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借和轻链间，分别借二硫键二硫键连接。此为免疫连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体单体,呈呈“Y”字构型字构型。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 4.重链上结合有不同量的糖重链上结合有不同量的糖,故故Ig属糖蛋属糖蛋白。根据重链抗原性的不同可分为白。根据重链抗原性的不同可分为5类，即类，即 链，链， 链，链， 链，链，链
11、和链和链，链， 由它们组成由它们组成的的Ig分别称为分别称为IgM，IgG，IgA，IgE和和IgD。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 5.轻链也可根据其化学结构和抗原轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为性的差异分为和和二型。一个二型。一个Ig分子分子的二条轻链型别相同，绝无可能的二条轻链型别相同，绝无可能型和型和型共同存在于同一个型共同存在于同一个Ig分子中。分子中。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 6. Ig单体的氨基酸序列可分为单体的氨基酸序列可分为恒定区恒定区（constant region,C区区)和和可变区可变区（variable region,V区）。区）。-可变区可
12、变区位于位于Ig多肽链的多肽链的N端，占轻链的约端，占轻链的约1/2及及重链的约重链的约1/4（Ig结合抗原的所在部位结合抗原的所在部位）-恒定区恒定区位于位于Ig多肽链的多肽链的C端，占轻链的余下的端，占轻链的余下的1/2及重链的及重链的3/4（补体结合域，补体结合域，Fc受体结合位点，受体结合位点，Ig 抗原决定簇等所在部位抗原决定簇等所在部位）资料仅供参考,不当之处，请联系改正。7. Ig的水解片断可因选用的水解酶不同而异。的水解片断可因选用的水解酶不同而异。采用采用木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶(papain)水解水解Ig时：时：-2个相同的个相同的Fab (fragment antigen b
13、inding)段，即抗原结合片断段，即抗原结合片断-1个个Fc （fragment crystalliable) 段，即可结段，即可结晶片断，拥有晶片断，拥有Ig抗原决定簇。抗原决定簇。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 采用胃蛋白酶（采用胃蛋白酶（pepsin），其酶切位点），其酶切位点在在Ig重链间二硫键近羧基端重链间二硫键近羧基端- 一个具双价抗体活性的一个具双价抗体活性的F(ab)2片断片断-一个不具任何免疫活性的一个不具任何免疫活性的Fc片断。片断。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。8.8.抗体的蛋白类型主要为抗体的蛋白类型主要为IgGIgG和和IgMIgM。-IgM-IgM见于
14、初次免疫和免疫早期，滞留时间见于初次免疫和免疫早期，滞留时间较短。较短。-IgG-IgG一般见于加强免疫和免疫晚期，滞留一般见于加强免疫和免疫晚期，滞留时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。三、抗体的制备三、抗体的制备依制备途径，目前人工制备的特异性依制备途径，目前人工制备的特异性抗体有三类：抗体有三类：-多克隆抗体（多克隆抗体（PcAb）-单克隆抗体（单克隆抗体（McAb）-基因工程抗体基因工程抗体资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（一）（一） 抗原提取与纯化的一般原则抗原提取与纯化的一般原则1.1.建立检测方法建立检测方法
15、（定性、定量、活性）（定性、定量、活性）2.2.选择选择抗原含量高、易获得、价廉、可大量收集的样品抗原含量高、易获得、价廉、可大量收集的样品为为原料原料-人人AFPAFP(+)AFPAFP(+)肝癌病人腹水；肝癌病人腹水；4 46 6月胎儿血清月胎儿血清-鼠鼠AFPAFP孕孕1818天大鼠羊水天大鼠羊水-波形蛋白（波形蛋白（vimentinvimentin）猪、牛眼晶状体猪、牛眼晶状体-角蛋白（角蛋白（keratinkeratin）角化上皮角化上皮-肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobinmyoglobin）骨骼肌骨骼肌-胶原（胶原（collagencollagen）皮肤、肌腱等皮肤、肌腱等资料
16、仅供参考,不当之处，请联系改正。 3.保持抗原分子的稳定性保持抗原分子的稳定性-低温、适度低温、适度pH与离子强度、抑制酶解、保护与离子强度、抑制酶解、保护巯基巯基 4.操作步骤简易、有效操作步骤简易、有效。-提取提取-分离纯化分离纯化-浓缩浓缩-贮存贮存资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 （二）多克隆抗体（抗血清）（二）多克隆抗体（抗血清）PcAbPcAb的的 制备程序制备程序 多克隆抗体多克隆抗体-指由不同克隆指由不同克隆B细胞产生的抗细胞产生的抗体混合物体混合物。-每种抗原有多个表位每种抗原有多个表位-用其免疫动物会产生针对各表位的不同抗体用其免疫动物会产生针对各表位的不同抗体（多克隆
17、抗体）（多克隆抗体）-血清中的抗体皆是多克隆的血清中的抗体皆是多克隆的 优点：优点：制备简便、价格低廉、抗体效价高制备简便、价格低廉、抗体效价高缺点：缺点：特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 （二）多克隆抗体（抗血清）（二）多克隆抗体（抗血清）PcAbPcAb的的 制备程序制备程序n 1 抗原纯化抗原纯化免疫原免疫原n 2 免疫动物免疫动物免疫对象免疫对象n 3 收集抗血清收集抗血清粗、混合品粗、混合品n 4 提取提取IgG PcAb，纯品，纯品n 5 质量鉴定质量鉴定效价、特异性、蛋白量效价、特异性、蛋白量n 6
18、 保存与使用保存与使用免疫试剂免疫试剂n 纯度（杂纯度（杂纯）：抗血清纯）：抗血清r球蛋白球蛋白IgG特异特异性性IgGIgG片段（片段（Fab或或F(ab)2）n 抗体抗体IgG资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 （三）单克隆抗体的制备及其应用（三）单克隆抗体的制备及其应用 单克隆抗体是指由单个克隆的单克隆抗体是指由单个克隆的杂交瘤细胞杂交瘤细胞产生针产生针对对一种抗原决定簇一种抗原决定簇的特异性抗体的特异性抗体。它是采用。它是采用B淋巴细淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。 优点：优点：纯度高、特异性强、交叉反应少、质量和效价稳定缺点：缺点：
19、制备复杂、价格昂贵、抗体效价较低资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1 .利用杂交瘤技术制备利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理的基本原理 -淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一个个B细胞克隆只产生一种抗体；细胞克隆只产生一种抗体； -细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；双方亲代细胞的特性； -利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 2.
20、 McAb的制备流程的制备流程 亲 本 细 胞 准 备亲 本 细 胞 准 备 细 胞 杂 交 融 合细 胞 杂 交 融 合（PEG）HAT选择性培养选择性培养杂交瘤细胞杂交瘤细胞克隆性培养与建株（有效稀释法）克隆性培养与建株（有效稀释法）大量大量制备单克隆抗体制备单克隆抗体质量鉴定与分装冻存质量鉴定与分装冻存 （扩大培养或接种动物）（扩大培养或接种动物） （杂交瘤细胞冻存与复苏）（杂交瘤细胞冻存与复苏）资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 抗原免疫抗原免疫 免疫脾细胞免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞 (BALB/C小鼠小鼠) （经（经8-AG或或6-TG诱导）诱导） (亲本细胞亲本细胞) 混合、融合（混合、融合（PEG）选择性培养（选择性培养（HAT）筛选和克隆化筛选和克隆化 冻存冻存 阳性细胞建株（稳定分泌阳性细胞建株（稳定分泌McAb） （杂交瘤细胞）（杂交瘤细胞） 复苏复苏 McAb大量制备（上清或腹水大量制备（上清或腹水-鼠）鼠） 稳定性检查稳定性检查 纯化、鉴定（特异性、活性、含量）纯化、鉴定（特异性、活性、含量）2. McAb的制备流程的制备流程资料仅供参考,不当之处，请联系改正。四、抗体的标记四、抗体的标记-荧光素荧光素-酶酶-胶体金、胶体铁胶体金、胶体铁
