1、第二章第二章 基因工程制药基因工程制药第一节第一节 概概 述述第二节第二节 目的基因的获得目的基因的获得第三节第三节 基因表达基因表达第四节第四节 基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性第五节第五节 基因工程菌中试基因工程菌中试第六节第六节 重组工程菌的培养重组工程菌的培养第七节第七节 基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离纯化第八节第八节 变性蛋白的复性变性蛋白的复性第九节第九节 基因工程药物的质量控制基因工程药物的质量控制 第二章第二章 基因工程制药基因工程制药 一、基因工程技术生产药品的优点一、基因工程技术生产药品的优点 二、基因工程药物生产的基本过程二、基因工程药物生产的基本过程
2、三、国内外基因工程药物研究进展三、国内外基因工程药物研究进展 第一节第一节 概概 述述第一节第一节 概概 述述基因工程技术诞生：基因工程技术诞生：20世纪世纪70年代年代 现代生物技术的发展现代生物技术的发展 基因工程基因工程： 应用应用DNA重组技术，按照人们的重组技术，按照人们的意愿意愿，在，在基因基因水平上改变生物水平上改变生物 遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品和服和服 务的技术。务的技术。一、基因工程技术生产药品的优点一、基因工程技术生产药品的优点 1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富
3、集）的大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足够数量的生理活性物质。提供足够数量的生理活性物质。 3. 开发更多的内源性生理活性物质。开发更多的内源性生理活性物质。 4. 通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优 化天然的生理活性物质。化天然的生理活性物质。 5. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 6. 降低成本，提高产品质量。降低成本，提高产品质量。二、基因工程药物生产的基本过程二、基
4、因工程药物生产的基本过程 1. 目的基因的获得目的基因的获得 2. 构建构建DNA重组体重组体 上游技术上游技术 3. 构建工程菌构建工程菌 4. 工程菌的发酵工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验产品的检验三、国内外基因工程药物研究进展三、国内外基因工程药物研究进展 目前研制的基因工程药物主要包括目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子 表皮生长因子、凝血因子；表
5、皮生长因子、凝血因子； 3. 激素，如胰岛素、生长激素、心钠素；激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4. 酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激 活剂、超氧化物歧化酶等。活剂、超氧化物歧化酶等。 Vitamin A 第二节第二节 目的基因的获得目的基因的获得 一、一、 反转录法反转录法 二、化学合成法二、化学合成法 一、反转录法一、反转录法 1mRNA的纯化的纯化 （1）选择表达目的蛋白质丰度高的）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。的生物材料。 （2）分离）分离总总RNA。 （3）分离）分离mRNA（多聚（多聚T纤
6、维素）纤维素）2cDNA第一链的合成（第一链的合成（RT-PCR，随机引物），随机引物）3cDNA第二链的合成第二链的合成4cDNA克隆克隆5将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞 S 1RNaseH核酸发夹结构克隆定向酶入噬菌体质粒T、A、 转染电击化学法一、反转录法一、反转录法6cDNA文库的鉴定文库的鉴定 显色抗性失活抗性获得抗体差示寡核苷酸探针核酸探针一、反转录法一、反转录法7目的目的cDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定 计算机辅助分析阅读测序酶切 、一、反转录法一、反转录法 优点：优点：准确性高准确性高、人工接头、改进、利用、人工接头、改进、利用 局限性：局限性： 1小分子量的
7、蛋白或多肽小分子量的蛋白或多肽 2已知核苷酸顺序或氨基酸顺序已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3费用较高费用较高 二、化学合成法二、化学合成法Vitamin B2 基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。进攻，保护自身的过程。第三节第三节 基因表达基因表达 1. 原核细胞（大肠杆菌
8、、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等） 2. 真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）一、宿主菌的选择一、宿主菌的选择 1原核细胞原核细胞（1）大肠杆菌）大肠杆菌 优点：遗传背景清晰，生长迅速。优点：遗传背景清晰，生长迅速。 缺点：胞内表达，提取困难。缺点：胞内表达，提取困难。 包含体形式，需复性。包含体形式，需复性。 表达后不存在修饰作用，应用受限。表达后不存在修饰作用，应用受限。 翻译产物的翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基（末端常多余一个甲硫氨酸残基（AUG启始密码子启始密码子 编码）容易引起免疫反应。编码）容易引起
9、免疫反应。 大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。 蛋白酶水解作用破坏产物。蛋白酶水解作用破坏产物。一、宿主菌的选择一、宿主菌的选择 1原核细胞原核细胞（2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌 优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。 缺点：蛋白酶水解活性更强。缺点：蛋白酶水解活性更强。 （3）链霉菌）链霉菌 优点：不致病优点：不致病 分泌能力强分泌能力强 具有糖基化能力具有糖基化能力 缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差一、宿主菌的选择一、宿主菌的选择 2真核细胞真核细胞（1）酵母：无毒、倍增时间短
10、、分泌功能、糖基化作用、使之）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之 成为理想的宿主。成为理想的宿主。（2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。）丝状真菌：肽剪切、糖基化。（3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。一、宿主菌的选择一、宿主菌的选择1载体载体 表达载体必须具备下列条件：表达载体必须具备下列条件： 载体能独立复制载体能独立复制 具有多克隆（具有多克隆（MCS）位点和标记基因）位点和标记基因 具有很强的启动子具有很强的启动子 具有调节基因具有调节基因 具有很强的终止子具有很强的终止子 具有产生带有具有产生带有SD序列和序列和AUG的的mR
11、NA的能力的能力二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达 基因工程药物研究中常用的表达载体基因工程药物研究中常用的表达载体 （1）PBV220系统系统 PL、PR串联启动子，增强启动信号。串联启动子，增强启动信号。 rrnB基因的终止信号。基因的终止信号。 PL、PR与与rrnB之间有之间有MCS及及SD序列。序列。 CITS857抑制子基因（温控诱导）抑制子基因（温控诱导） 质粒较小（质粒较小（366kb），便于插入大的外源基因），便于插入大的外源基因二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达PBG-2: 由由PBV220衍生衍生,可以表达与可以表达与IgG结合的融合蛋白，并且
12、是有蛋结合的融合蛋白，并且是有蛋白剪切位点，便于表达后纯化及白剪切位点，便于表达后纯化及纯化后剪切。纯化后剪切。二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达（2）PET系统系统 IPTG诱导（异丙基诱导（异丙基-硫代硫代-D-半乳糖苷）半乳糖苷） 多克隆位点上有多克隆位点上有NdeI或或NCOI单一切点，切开后粘性末端为单一切点，切开后粘性末端为 ATG，便于外源基因插入表达。，便于外源基因插入表达。 在外源基因的在外源基因的N末端可融合末端可融合6个个His，便于纯化。，便于纯化。二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达2影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素影响目的基因在大肠杆菌中
13、表达的因素（1）外源基因的拷贝数）外源基因的拷贝数（2）启动子的强弱）启动子的强弱（3）SD序列的有效性序列的有效性（4）SD与与ATG的间距的间距（5）密码子的组成（偏爱性）密码子的组成（偏爱性）（6）产物的稳定性）产物的稳定性（7）产物对宿主的影响）产物对宿主的影响二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达3表达形式表达形式（1）融合蛋白，增强稳定性。）融合蛋白，增强稳定性。（2）非融合表达。）非融合表达。二、大肠杆菌中的基因表达二、大肠杆菌中的基因表达 1载体载体 YEP类（酵母附加体质粒）类（酵母附加体质粒） 由大肠杆菌质粒，由大肠杆菌质粒，2m质粒和质粒和Trp或或URA3组成
14、，组成， ARS来自来自2m质粒。质粒。 YRP（酵母复制型质粒）（酵母复制型质粒） ARS来自染色体来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。双标及大肠杆菌质粒。 YCP（酵母着丝粒型质粒）（酵母着丝粒型质粒） 除具有除具有YRP元件外，还具有着粒成份。元件外，还具有着粒成份。 三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达 YIP（酵母整合型质粒）（酵母整合型质粒） 含有可与染色体进行同源重组的序列含有可与染色体进行同源重组的序列 酵母表达型质粒酵母表达型质粒 分泌型表达质粒分泌型表达质粒 带有控制蛋白质分泌的信号序列带有控制蛋白质分泌的信号序列三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因
15、表达2影响目的基因在酵母中表达的因素影响目的基因在酵母中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数）外源基因的拷贝数 （2）TATA盒启动子成分盒启动子成分 （3）分泌信号序列）分泌信号序列 （4）终止序列）终止序列 （5）翻译后修饰）翻译后修饰 （6）对宿主影响）对宿主影响三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。第四节第四节 基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性 1. 质粒的分裂不稳定性：质粒的分裂不稳定性： 指工程菌分裂时
16、出现一定比列不含质粒的子代菌的现象。指工程菌分裂时出现一定比列不含质粒的子代菌的现象。 主要与两个因素有关：主要与两个因素有关： （1）含质粒菌产生不含质粒子代的频率，质粒丢失率与）含质粒菌产生不含质粒子代的频率，质粒丢失率与 宿主菌、质粒特性和培养条件有关。宿主菌、质粒特性和培养条件有关。 （2）含质粒菌与不含质粒菌比生长速率的差异的大小。）含质粒菌与不含质粒菌比生长速率的差异的大小。 2. 质粒的结构不稳定性：质粒的结构不稳定性： 指指DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。一、质粒不稳定产生的原因：一、质粒不稳定产生的原因
17、： 1. 选择合适的宿主菌选择合适的宿主菌 2. 选择合适的载体选择合适的载体 3. 选择压力选择压力 4. 分阶段控制培养分阶段控制培养 5. 控制培养条件控制培养条件 6. 固定化固定化二、提高质粒稳定性的方法二、提高质粒稳定性的方法 一、工程菌选择一、工程菌选择二、反应器（发酵罐）设计二、反应器（发酵罐）设计三、发酵培养基组成三、发酵培养基组成四、工艺最佳化与参数监测控制四、工艺最佳化与参数监测控制第五节第五节 基因工程菌中试基因工程菌中试一、基因工程菌的培养方式一、基因工程菌的培养方式二、基因工程菌的培养工艺二、基因工程菌的培养工艺三、基因工程菌的培养设备三、基因工程菌的培养设备第六节
18、第六节 重组工程菌的培养重组工程菌的培养 基因工程产品纯化前的性质：基因工程产品纯化前的性质： 目的产物在体系中含量较低目的产物在体系中含量较低 体系中组份复杂（细胞、代谢物、残留培养基及无机盐等）体系中组份复杂（细胞、代谢物、残留培养基及无机盐等） 目的产物稳定性差：对目的产物稳定性差：对pH、温度、金属离子、有机溶剂、温度、金属离子、有机溶剂、 剪切力、表面活性剂等十分敏感，容易失活、变性。剪切力、表面活性剂等十分敏感，容易失活、变性。 第七节第七节 基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离纯化一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 1. 含目的产物的初始
19、物料的特点含目的产物的初始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素 均对分离纯化技术和工艺有直接影响。这些因素包括：均对分离纯化技术和工艺有直接影响。这些因素包括： （1）菌种类型、形式，各种生物学性质，产物和副产物种类、）菌种类型、形式，各种生物学性质，产物和副产物种类、 产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体）， 代谢物种类，产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；代谢物种类，产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等； （2）原材料和培养基的来
20、源及质量是否稳定；）原材料和培养基的来源及质量是否稳定； （3）生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式）生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式(连续、批连续、批 式、半连续式、半连续)，生产周期，生产能力，工艺控制条件及方式等；，生产周期，生产能力，工艺控制条件及方式等； （4）初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主要杂质）初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主要杂质 种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性、粘度、流体力学性 质和热力学性质等。质和热力学性质等。 一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素一、
21、建立分离纯化工艺需了解的各种因素2. 物料中杂质种类和性质物料中杂质种类和性质 物料中杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、物料中杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、化学性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性稳定性(对热、对热、pH、盐、有机溶剂等、盐、有机溶剂等)、溶解度、分配系数、挥发性、溶解度、分配系数、挥发性及吸附性能等。及吸附性能等。 二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 3. 目的产物的特性目的产物的特性 目的产物特性主要有产物的化学、物理和生物学特
22、性。目的产物特性主要有产物的化学、物理和生物学特性。 包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性度、稳定性(对热、冷冻、对热、冷冻、pH、盐、有机溶剂和金属离子等、盐、有机溶剂和金属离子等)、疏水性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物活性、亲和性、配、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物活性、亲和性、配基种类、表面活性等。基种类、表面活性等。二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 4. 产品质量要求产品质量要求 产品质量要求主要包括产品质量指标，产品用途，对纯
23、度、生产品质量要求主要包括产品质量指标，产品用途，对纯度、生物活性、比活的要求。允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质物活性、比活的要求。允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性的种类和最大允许量，以及对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。等。二、分离纯化的基本过程二、分离纯化的基本过程 基因工程药物的分离纯化一般包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初基因工程药物的分离纯化一般包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工等步骤。步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工等步骤。 二、分离纯化的基本过程二、分离纯化的基本过程
24、分离纯化的技术特点：分离纯化的技术特点： 条件温和条件温和 选择性好选择性好 收率要高收率要高 纯化过程快速纯化过程快速三、细胞的破碎方法三、细胞的破碎方法1. 细胞收集 2. 细胞破碎膜过滤离心 物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、 超声破碎法、高压挤压法化学破碎法：渗透冲击、增溶法、 脂溶法生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 壳多糖酶等）超声破碎法超声破碎法四、固液分离四、固液分离分离细胞碎片常用的方法有分离细胞碎片常用的方法有：1. 离心沉淀：高速离心、超速离心2. 膜过滤：微滤、超滤和反渗透3. 双水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖 聚乙二醇-无机盐五、重组蛋白质的分离纯化五、重组蛋白质
25、的分离纯化 分离纯化主要依赖色谱分离方法。分离纯化主要依赖色谱分离方法。 色谱技术包括：色谱技术包括： 离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、 凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。 五、重组蛋白质的分离纯化五、重组蛋白质的分离纯化 1. 离子交换层析：离子交换层析： 是以离子交换剂为固定相，是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。的一种层析方法。
26、pH、两性分子、侧链、两性分子、侧链、COONH 3五、重组蛋白质的分离纯化五、重组蛋白质的分离纯化 2. 疏水层析：疏水层析： 是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 疏水层析最常用填料是多聚糖（如琼脂糖）及硅胶。疏水层析最常用填料是多聚糖（如琼脂糖）及硅胶。 利用氨基酸侧链的疏水键。利用氨基酸侧链的疏水键。 五、重组蛋白质的分离纯化五、重组蛋白质的分离纯化3. 亲和层析：亲和层析： 是利用固定化配体与目的蛋白质之间非是利用固定化配体与目的
27、蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。种结合解除。 五、重组蛋白质的分离纯化五、重组蛋白质的分离纯化4. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析： 又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。溶液中各组分进行分离的液相层析方法。 大分子先从色谱柱中流出大分子先从色谱柱中流出六、非蛋白质类杂质的去除六、非蛋白质类杂质的去除1. DNA的去
28、除的去除 （1）DNA在在pH 4. 0以上呈阴离子，可用以上呈阴离子，可用阴离子交换剂阴离子交换剂吸附除去，吸附除去， 但目的蛋白质但目的蛋白质PI应在应在6. 0以上。以上。 （2）如蛋白质为强酸性，则可选择条件使其吸附在）如蛋白质为强酸性，则可选择条件使其吸附在阳离子交换剂阳离子交换剂 上，而不让上，而不让DNA吸附上去。吸附上去。 （3）利用）利用亲和层析亲和层析吸附蛋白质，而吸附蛋白质，而DNA不被吸附，也可分离。不被吸附，也可分离。 （4）疏水层析疏水层析对分离也有效，在上柱时需要高盐浓度，使对分离也有效，在上柱时需要高盐浓度，使DNA-蛋蛋 白质结合物离解，蛋白质吸附在柱上，而白
29、质结合物离解，蛋白质吸附在柱上，而DNA不被吸附。不被吸附。六、非蛋白质类杂质的去除六、非蛋白质类杂质的去除2. 热原质的去除热原质的去除（1）整个生产过程在无菌条件下进行，防止产生热原质。）整个生产过程在无菌条件下进行，防止产生热原质。（2）所有层析介质在使用前先除去热原质，在）所有层析介质在使用前先除去热原质，在28下进下进 行操作，洗脱液需先经无菌处理，流出的蛋白质溶液行操作，洗脱液需先经无菌处理，流出的蛋白质溶液 也应无菌处理，即通过也应无菌处理，即通过0. 2m微滤膜，并在微滤膜，并在28下保存。下保存。六、非蛋白质类杂质的去除六、非蛋白质类杂质的去除3. 病毒的去除病毒的去除 成品
30、中必须检查是否含有病毒。病毒主要来源于宿主细胞。成品中必须检查是否含有病毒。病毒主要来源于宿主细胞。经过色谱分离，经过色谱分离， 一般能除去病毒，必要时可以用紫外线照射使病一般能除去病毒，必要时可以用紫外线照射使病毒失活，或过滤将病毒除去。毒失活，或过滤将病毒除去。七、选择分离纯化方法的依据七、选择分离纯化方法的依据1. 根据产物表达形式来选择根据产物表达形式来选择2. 根据分离单元之间的衔接选择根据分离单元之间的衔接选择3. 根据分离纯化工艺的要求来选择根据分离纯化工艺的要求来选择（1）要具有良好的稳定性和重复性。）要具有良好的稳定性和重复性。（2）要尽可能减少组成工艺的步骤。）要尽可能减少
31、组成工艺的步骤。（3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设 备也能相互适应。备也能相互适应。（4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干 扰产品质量。扰产品质量。（5）工艺时间要尽可能短。）工艺时间要尽可能短。（6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低。）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低。（7）具有较高的安全性。）具有较高的安全性。第八节第八节 变性蛋白的复性变性蛋白的复性一、包含体形成的原因一、包含体
32、形成的原因二、包含体的分离和溶解二、包含体的分离和溶解三、包含体蛋白复性方法三、包含体蛋白复性方法一、包含体形成的原因一、包含体形成的原因包含体形成的原因主要是高水平表达的结果。包含体形成的原因主要是高水平表达的结果。1. 在高水平表达时，新生肽链的聚在高水平表达时，新生肽链的聚 集速率一旦超集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包含体的形成。过蛋白正确折叠的速率就会导致包含体的形成。2. 重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，也导致包含体的形成。伴侣等，
33、也导致包含体的形成。电镜下包含体颗粒电镜下包含体颗粒一、包含体形成的原因一、包含体形成的原因 包含体虽然由无活性的蛋白组成，但包含体形成对重组蛋白的生产包含体虽然由无活性的蛋白组成，但包含体形成对重组蛋白的生产提供了几个优势：提供了几个优势：1. 包含体具有高密度，易于分离纯化；包含体具有高密度，易于分离纯化；2. 重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；的蛋白的降解；3. 用于生产处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白。用于生产处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白。二、包含体的分离和溶解二、包含体的分离和
34、溶解1.包含体的分离包含体的分离（1）对培养收集的重组菌进行破碎（高压匀浆、超声波破碎等），为了提）对培养收集的重组菌进行破碎（高压匀浆、超声波破碎等），为了提 高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。（2）离心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低浓度的变性剂（如脲和盐酸）离心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低浓度的变性剂（如脲和盐酸 胍）、去垢剂（如胍）、去垢剂（如Triton X-100）、脱氧胆酸钠等化合物的缓冲液进行）、脱氧胆酸钠等化合物的缓冲液进行 洗涤，如果需要对包含体进行纯化，一般多采用蔗糖密度梯度离心法洗涤，如果需要对包含体进行纯化，一般多采用蔗糖密度梯度
35、离心法。二、包含体的分离和溶解二、包含体的分离和溶解2.包含体的溶解包含体的溶解 包含体的溶解一般都用强的变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，或包含体的溶解一般都用强的变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，或去垢剂如去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等；对于含有半胱氨酸的、正十六烷基三甲基铵氯化物等；对于含有半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇及蛋白质，还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇及半胱氨酸。温度一般选择在半胱氨酸。温度一般选择在30以促进溶解。此外，由于金属离子具以促进溶解。此外，由于金属离子具有氧化催化作用，还常常需要加入金属螯合剂如有氧化催化
36、作用，还常常需要加入金属螯合剂如EDTA以除去金属离以除去金属离子。子。三、包含体蛋白复性方法三、包含体蛋白复性方法有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点： 活性蛋白质的回收率高。活性蛋白质的回收率高。正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。折叠复性方法易于放大。折叠复性方法易于放大。复性过程耗时较少。复性过程耗时较少。 第九节第九节 基因工程药物的质量控制基因工程药物的质量控制一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点一、医药生
37、物技术产品质量保证的一般性要点二、生物材料的质量控制二、生物材料的质量控制三、培养过程的质量控制三、培养过程的质量控制四、纯化过程的质量控制四、纯化过程的质量控制五、目标产品的质量控制五、目标产品的质量控制一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点1. 产品安全性评价产品安全性评价 根据各个具体品种的情况，提出各不相同的安全性评价要求，这类制品根据各个具体品种的情况，提出各不相同的安全性评价要求，这类制品安全性临床试验设计方案与试验范围须根据不同情况作不同规定。安全性临床试验设计方案与试验范围须根据不同情况作不同规定。一、医药生物技术产品质量保证的一般性要
38、点一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点2. 产品本身的结构产品本身的结构 基因工程产品或人的多肽和蛋白质相同，或其氨基酸序列或翻基因工程产品或人的多肽和蛋白质相同，或其氨基酸序列或翻 译后修饰上存在差异，或是非人源性或外源多肽和蛋白质，如病毒、译后修饰上存在差异，或是非人源性或外源多肽和蛋白质，如病毒、细菌抗原。对上述后两类产品，视其特点作药动学、毒理学研究。对细菌抗原。对上述后两类产品，视其特点作药动学、毒理学研究。对 基因修饰产品，要作一般毒性、长期毒性以及致突变、致癌变和致畸基因修饰产品，要作一般毒性、长期毒性以及致突变、致癌变和致畸变等遗传毒理研究。变等遗传毒理研究。一、医药生物技
39、术产品质量保证的一般性要点一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点3. 严格控制条件严格控制条件 宿主细胞中表达的天然基因，转录或翻译后，或精制、工艺放大过宿主细胞中表达的天然基因，转录或翻译后，或精制、工艺放大过 程中，都有可能发生变化，故从原料到制成品制备全过程的每一步都程中，都有可能发生变化，故从原料到制成品制备全过程的每一步都须严格控制条件与鉴定质量，确保符合标准规格、安全有效。须严格控制条件与鉴定质量，确保符合标准规格、安全有效。二、生物材料的质量控制二、生物材料的质量控制 原材料的质量控制是要确保编码药品的原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，序列的正确性，重组微生
40、物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性，所以原材料的质量控制主要是对目的基因、表达安全性和一致性，所以原材料的质量控制主要是对目的基因、表达载体以及宿主细胞的检查。载体以及宿主细胞的检查。1.目的基因目的基因 根据指控要求，需明确目的基因的来源、克隆经过；对于改造根据指控要求，需明确目的基因的来源、克隆经过；对于改造过的基因应说明被修改的密码子、被切除的肽段及拼接的方法；过的基因应说明被修改的密码子、被切除的肽段及拼接的方法；使用使用PCR技术扩增得到的基因，应说明扩增的模板、引物及酶反应技术扩增得到的基因，应
41、说明扩增的模板、引物及酶反应条件等情况，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列等分析方法条件等情况，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列等分析方法确证基因结构的正确无误。确证基因结构的正确无误。二、生物材料的质量控制二、生物材料的质量控制2. 表达载体表达载体 应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分(如复制如复制子、启动子子、启动子)的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物等。标记物等。二、生物材料的质量控制二、生物材料的质量控制3.宿主细胞宿主细胞 应提供宿主细胞的名
42、称、来源、传代历史、检定结果及其应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性等；需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主生物学特性等；需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，是否整合到染色体内及拷贝数，并证明宿主细细胞内的状态，是否整合到染色体内及拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。二、生
43、物材料的质量控制二、生物材料的质量控制 在贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过积中，要求质粒在贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过积中，要求质粒稳定，始终无突变；重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排稳定，始终无突变；重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。除外源微生物污染。三、培养过程的质量控制三、培养过程的质量控制 1.生产用细胞库生产用细胞库 需证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污需证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污染，由原始种子批建生产用工作细胞库。染，由原始种子批建生产用工作细胞库。 在同一实验室工作区内，不得同时操作两种
44、不同的细胞或菌种，在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同的细胞或菌种，一个工作人员也不得同时操作两种不同的细胞或菌种。一个工作人员也不得同时操作两种不同的细胞或菌种。 建原始种子批须确证克隆基因建原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。 对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞控制微生物污染；提
45、供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞/载体系统稳定性确定最高允许传种代数。载体系统稳定性确定最高允许传种代数。三、培养过程的质量控制三、培养过程的质量控制 2.培养过程培养过程 培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；长期培养后的基因型特征； 依宿主细胞依宿主细胞/载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。并定期评价细胞系统和产品。 培养周期结束时，应监测宿主细胞培养周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性。载体系统的特性。三、培养过
46、程的质量控制三、培养过程的质量控制 分离纯化过程中，常用分级沉淀、超滤、电泳和色谱等技术，分离纯化过程中，常用分级沉淀、超滤、电泳和色谱等技术，其质量控制要求能保证去除微量其质量控制要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质及热原质，或者将这类杂质都控制在纯化过程带入的有害化学物质及热原质，或者将这类杂质都控制在规定限度以下。规定限度以下。四、纯化过程的质量控制四、纯化过程的质量控制 纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和
47、蛋白回收率进行检测。获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和蛋白回收率进行检测。 要明确使用的纯化方法的原理、目的以及预期的去除杂质的效果，要明确使用的纯化方法的原理、目的以及预期的去除杂质的效果，在不同纯化步骤中能去除不同性质的杂质，并进行相应的工艺验证。在不同纯化步骤中能去除不同性质的杂质，并进行相应的工艺验证。 纯化方法的设计应考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂纯化方法的设计应考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖以及纯化过程带入的其他有害物质。蛋白、糖以及纯化过程带入的其他有害物质。 纯化工艺过程中应尽量不加入对人体有害的物质。纯化工艺过程中应尽量不加入对人体有害的物
48、质。四、纯化过程的质量控制四、纯化过程的质量控制 如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实从柱上如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实从柱上不会掉下有害物质。不会掉下有害物质。 上样前应清洗除去热原质等。上样前应清洗除去热原质等。 若用亲和层析技术，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。若用亲和层析技术，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。 如在反相纯化步骤中用到乙腈或甲醇等有机溶剂，用如在反相纯化步骤中用到乙腈或甲醇等有机溶剂，用Protein A亲亲和层析纯化抗体，有机溶剂和和层析纯化抗体，有机溶剂和Protein A等这些对人体有害的物质应加等这些对人体有害的物质应加以去除和
49、控制。以去除和控制。四、纯化过程的质量控制四、纯化过程的质量控制 基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求： 产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 需要综合利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学需要综合利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论与技术，保证基因工程药品的和分子生物学等多门学科的理论与技术，保证基因工程药品的安全有效。安全有效。五、目的产品的质量控制五、目的产品的质量控制 1生物活性测定生物活性测定多肽和蛋白质药物的生物学活性是蛋白质药物的重要质量
50、控制指标。多肽和蛋白质药物的生物学活性是蛋白质药物的重要质量控制指标。效价测定必须采用国际上通用的方法，测定结果必须用国际或国家标效价测定必须采用国际上通用的方法，测定结果必须用国际或国家标准品进行校正，以国际单位表示或折算成国际标准单位。准品进行校正，以国际单位表示或折算成国际标准单位。生物学效价的测定往往需要进行动物体内试验或通过细胞培养进行体生物学效价的测定往往需要进行动物体内试验或通过细胞培养进行体外效价测定。外效价测定。体内生物活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学体内生物活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型。模型。体外生物活性测定的方法有细胞培养计
