1、免疫学检测技术免疫学检测技术一、一、免疫学检验原理免疫学检验原理抗原抗原- -抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度生高度特异性结合特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（于血清中，故又称血清学反应（serological serological reaction)reaction)应用：应用：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原：用已知抗体检测未知抗原：定性或定量检测体内各种分子；定性或定量检测体内各种分子；用已知抗体检测半抗原物质。用已知抗体检测半抗原物质。1
2、.1.特异性和交叉反应特异性和交叉反应 特异性特异性：一种抗原通常仅能与：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：分子基础：抗原表位与抗体分抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性子高变区之间空间构型的互补性。（一）抗原（一）抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点交叉反应交叉反应（cross reactioncross reaction）性：若两种抗原）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应。反应。 结合价：结合价：
3、 天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多个抗体分子结合，为多价多价。单体形式的抗体分。单体形式的抗体分子有两个子有两个FabFab段，能结合两个相同的抗原决定基，段，能结合两个相同的抗原决定基，为为两价两价。2.2.比例性比例性比例合适：比例合适： 若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个FabFab段段分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合网格状复合体体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形，则反应体系中基本不存在游离的
4、抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。 因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。前带现象（前带现象（prozone）和后带现象）和后带现象(postzone) v Ab过剩和过剩和Ag过剩过剩前带现象（前带现象（prozoneprozone）和后带现象）和后带现象(postzone)(postzone)AbAb过剩和过剩和AgAg过剩过剩网格学说网格学说（lattice theory）抗体过剩抗体过剩抗原过剩抗原过剩抗体抗体比例合适抗体抗体比例合适抗原抗原抗体抗体 抗原抗原- -
5、抗体反应为分子表面的非共价结合，结抗体反应为分子表面的非共价结合，结合合虽稳定但可逆虽稳定但可逆。在一定条件下（如低。在一定条件下（如低pHpH、高浓、高浓度盐、冻融等），抗原度盐、冻融等），抗原- -抗体复合物可被解离。抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。学活性。 根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。体。3.3.可逆性可逆性4.4.阶段性阶段性特异性结合阶段：特异性结合阶段：可见的反应阶段：可见的反应阶段：1.1.电解质电解质 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并抗
6、原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原- -抗抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体多用生理盐水稀释抗原或抗体。（二）、抗原（二）、抗原- -抗体反应的影响因素抗体反应的影响因素2.2.酸碱度酸碱度 抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pHpH是是6-86-8。3.3.温度温度最适温度为最适温度为3737。有些例外，如冷凝集素在。有些例外，如冷凝集素在 44左右与红细胞结合最好，左右与红细胞结合最好，2020以上反而以上反而解
7、离。解离。 4.4.抗原和抗体的性质抗原和抗体的性质 抗体的特异性和亲和力是决定抗原抗体的特异性和亲和力是决定抗原- -抗体抗体反应的关键因素。反应的关键因素。 此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原种类等均可影响抗原- -抗体反应。抗体反应。抗体分子上一个抗抗体分子上一个抗原结合点与对应的原结合点与对应的抗原决定基之间的抗原决定基之间的结合能力结合能力亲和力亲和力( (affinity) 根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：应的成分等因素分类： 1.凝集反应凝集反应 2.沉淀反应沉
8、淀反应 3.补体参加的反应补体参加的反应 4.免疫标记技术免疫标记技术（三）、免疫学检验方法（三）、免疫学检验方法 反应类型反应类型实验技术实验技术非非标标记记凝集反应凝集反应直接凝集试验、间接凝集试验、间接直接凝集试验、间接凝集试验、间接抑制凝集试验、协同凝集试验抑制凝集试验、协同凝集试验沉淀反应沉淀反应液相内凝集试验、凝胶内凝集试验液相内凝集试验、凝胶内凝集试验补体参与的反应补体参与的反应补体溶血试验、补体结合试验补体溶血试验、补体结合试验中和反应中和反应病毒中和试验、毒素中和试验病毒中和试验、毒素中和试验标标记记标记免疫反应标记免疫反应荧光免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术放射免疫技术酶免
9、疫技术酶免疫技术发光免疫技术发光免疫技术金免疫技术金免疫技术 颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应反应(agglutination)(agglutination) 。用于凝集反应中的抗原称用于凝集反应中的抗原称凝集原凝集原(agglutinogen)(agglutinogen)。用于凝集反应中的抗体称用于凝集反应中的抗体称凝集素（凝集素（agglutinin)agglutinin)。 凝集反应（凝集反应（Agglutination TestsAggluti
10、nation Tests）直接凝集（直接凝集（direct agglutination) ： 细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。红细胞凝集现象。2 2间接凝集间接凝集（indirect or passive agglutination) ： 检测针检测针 对可溶性对可溶性AgAg的的AbAb3 3间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验 (direct agglutination inhibition test)4. 4. 协同凝集试验协同凝集试验（co-agglutination test） 载体为金葡菌，其细胞壁蛋白载体为金葡菌
11、，其细胞壁蛋白A A与与IgG IgG 的的FcFc结合，用结合，用于细菌、病毒的快速检测。于细菌、病毒的快速检测。妊娠免疫诊断试验妊娠免疫诊断试验 v孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）含量明显增）含量明显增高。（高。（HCGHCG是可溶性抗原是可溶性抗原 ）v反之，非孕妇尿中反之，非孕妇尿中HCGHCG含量甚微，不足以消耗掉抗含量甚微，不足以消耗掉抗HCGHCG抗体。抗体。 HCGHCG检测为间接凝集试验的应用检测为间接凝集试验的应用Definition:Definition:可溶性抗原可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗
12、体结合，在一定条件下，细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。沉淀反应（沉淀反应（Precipitation Tests）用于沉淀反应中的抗原称用于沉淀反应中的抗原称沉淀原沉淀原(precipitonogen)(precipitonogen)。用于沉淀反应中的抗体称用于沉淀反应中的抗体称沉淀素沉淀素（precipitin) precipitin) 。 v大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行进行琼脂扩散琼脂扩散或或免疫扩散免疫扩散，即可溶性抗原与，即可溶性抗原与抗
13、体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。成可见的白色沉淀。1 1单向免疫扩散单向免疫扩散(single immunodiffusion)(single immunodiffusion)2 2双向免疫扩散双向免疫扩散(double immunodiffusion)(double immunodiffusion)沉淀反应沉淀反应单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)(Single Immunodiffusion)v是将一定量已知抗体混于是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔
14、后将抗原加适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心遇，形成以抗原孔为中心的的沉淀环沉淀环，环的直径与抗，环的直径与抗原含量成正比相关。本法原含量成正比相关。本法常用于测定血清常用于测定血清IgGIgG、IgMIgM、IgA IgA 和和 C C 3 3等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环双向免疫扩散双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)Double Immunodiffusion)v是将抗原与抗体分别加入是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者琼脂凝胶的小
15、孔中，二者自由向周围扩散并相遇，自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成在比例合适处形成沉淀线沉淀线。如果反应体系中含两种以如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或淀线。本法常用于抗原或抗体的定性抗体的定性 、组成和两、组成和两种抗原相关性分析的检测。种抗原相关性分析的检测。补体结合试验补体结合试验（Complement Fixation test, CFT)Complement Fixation test, CFT)补体结合试验补体结合试验(complement fixation test，CFT )
16、将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应应 系统中抗原或抗体的传统方法。系统中抗原或抗体的传统方法。试验原理试验原理作用原理：作用原理：利用补体的溶细胞作用进行各种利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定物理状态的抗原抗体测定5种成分，种成分，3个系统个系统 反应系统（溶菌系统）：反应系统（溶菌系统）：已知已知抗原抗原（或抗体）（或抗体） 与待测与待测抗体抗体（或抗原）（或抗原） 补体补体系统：系统： 指示系统（溶血系统）：指示系统（溶血系统）：SRBC与相应与相应溶血素溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞试验时常将其预先结合，成为致
17、敏绵羊红细胞（sensitized sheep red blood cell,SRBCS）。溶溶菌菌系系统统反应分两步进行反应分两步进行 第一步第一步: :反应系统与补体的作用反应系统与补体的作用 第二步第二步: :指示系统利用剩余补体的反应指示系统利用剩余补体的反应不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性已知抗原加入血清（检测抗体）已知抗原加入血清（检测抗体）加入标准量补体加入标准量补体加入包被抗体的红细胞加入包被抗体的红细胞检测红细胞溶解情况检测红细胞溶解情况AgPatientsserum AbNo AbAg 用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物
18、质等用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原标记抗体或抗原，进行抗原- -抗体反应的检测，是抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。点。免疫标记技术免疫标记技术（Immunolabelling techniqueImmunolabelling technique） 用荧光素与抗体连接成用荧光素与抗体连接成荧光抗体荧光抗体，再与待，再与待
19、检标本中抗原反应，置检标本中抗原反应，置荧光显微镜荧光显微镜下观察，抗下观察，抗原原- -抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。性或定位。 1免疫荧光法免疫荧光法(immunofluorescence, IF)（1 1）直接荧光法：）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。一抗原均须制备相应荧光抗体。（2 2）间接荧光法：）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该
20、法优点是敏感用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测用于多种抗原的检测, ,但非特异性反应亦增强。但非特异性反应亦增强。免疫荧光法分类免疫荧光法分类免疫荧光法图示免疫荧光法图示 此法将抗原此法将抗原- -抗体反应的特异性与抗体反应的特异性与酶催化作用酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（ODOD）值）值可反映抗原含量，灵敏度达可反映抗原含量，灵敏度达ng/mlng/
21、ml甚至甚至pg/mlpg/ml水平。水平。常见的标记物为：辣根过氧化物酶（常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRPHRP）和碱）和碱性磷酸酶（性磷酸酶（APAP） 酶免疫测定酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)常用的方法如下：常用的方法如下：（1 1）酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验 (enzyme linked (enzyme linked immunosorbent assayimmunosorbent assay，ELISA) ELISA) 是酶免疫测定中应用最广的技术，用于是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定测定可溶性抗原或抗体。可溶性抗原或抗体。优点：灵优
22、点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。成分、细胞因子等。 分类：（1 1）放射免疫分析法）放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)(radioimmunoassay, RIA)（2 2）免疫放射分析法（）免疫放射分析法（immunoradiometric assay, immunoradiometric assay, IRMA IRMA） 3放射免疫技术放射免疫技术 乃用放射性核
23、素标记抗原或抗体进行免疫学乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原- -抗体反应的特异性，检测灵敏度达抗体反应的特异性，检测灵敏度达pgpg水平。常用水平。常用于标记的放射性核素为于标记的放射性核素为125125I I和和131131I I，分为液相和固，分为液相和固相两种方法。相两种方法。 该法常用于测定该法常用于测定微量物质微量物质，如胰岛素、生长，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgEIgE等。等。 放射免疫分析法放射免疫分析法(radioimm
24、unoassay, RIA) 属于非竞争性放射性配体结合分析技术。他与属于非竞争性放射性配体结合分析技术。他与RIARIA为代表的竞争性放射性配体分析技术的区别主为代表的竞争性放射性配体分析技术的区别主要有两点：一，放射性核素标记的是抗体而不是抗要有两点：一，放射性核素标记的是抗体而不是抗原，其二是采用过量抗体而不是限量抗体。原，其二是采用过量抗体而不是限量抗体。RIMARIMA与与RIARIA相比较，提高了检测的灵敏度并使检测范围增相比较，提高了检测的灵敏度并使检测范围增宽，特异性和精确度进一步提高。宽，特异性和精确度进一步提高。 免疫放射分析法（免疫放射分析法（immunoradiomet
25、ric assay, IRMAimmunoradiometric assay, IRMA） 免疫放射分析法有以下特点：免疫放射分析法有以下特点：1.1.以标记抗体作为示踪剂以标记抗体作为示踪剂2.2.反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性 的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIARIA快。快。3.3.灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的1010100100倍。倍。4.4.标准曲线工作范围宽。标准曲线工作范围宽。5.5.特异性高。特异性高。6.6
26、.稳定性好。稳定性好。金标记免疫技术金标记免疫技术 胶体金标记技术胶体金标记技术 (Immunogold labeling (Immunogold labeling technique) technique) 是以胶体金作为示踪标记物，应是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。免疫胶乳试验应用免疫胶乳试验应用胶乳凝集试验胶乳凝集试验原理：原理： 胶乳凝集试验是一种间接凝集试验，它是以聚胶乳凝集试验是一种间接凝集试验，它是以聚苯乙烯胶乳微粒作为惰性载体。胶乳为人工合成的苯乙烯胶乳微粒作为惰性载体。胶乳为人工合成的载体，因此其性能
27、比生物来源的红细胞稳定，均一载体，因此其性能比生物来源的红细胞稳定，均一性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏感度不及血凝试验。感度不及血凝试验。 胶乳凝集试验胶乳凝集试验方法：v传统的胶乳凝集试验分试管法与玻片法。v试管法先将受检标本在试管中以缓冲液作倍比稀释，然后加入致敏的胶乳试剂，反应后观察胶乳凝集结果。v玻片法操作简便，1滴受检标本和1滴致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后，连续摇动23min即可观察结果。出现大颗粒凝集的为阳性反应，保持均匀乳液状为阴性反应
28、。 抗链球菌溶血素抗链球菌溶血素“O”（ASO）原理：原理： 胶乳凝集试验原理相同，在受检者胶乳凝集试验原理相同，在受检者血清中，加入溶血素血清中，加入溶血素“O O”, ,出现凝集颗粒，出现凝集颗粒，即为阳性。即为阳性。参考值：参考值： ASO250U/LASO250U/L临床意义：临床意义：1.ASO1.ASO测定对于诊断测定对于诊断A A族链球菌感染很有价值，其存在族链球菌感染很有价值，其存在及含量可反映感染的严重程度。及含量可反映感染的严重程度。2.2.风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、急性扁桃体炎等急性扁桃体炎等ASOASO明显升
29、高。明显升高。3.3.少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病人亦可使人亦可使ASOASO增高。增高。 4.4.当效价当效价250U/L250U/L时，才被认为有诊断价值。时，才被认为有诊断价值。 抗链球菌溶血素抗链球菌溶血素“O”（ASO）类风湿因子（类风湿因子（rheumatoid factor,RF） 类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（RA）是由自身抗体免是由自身抗体免疫复合物引起的自身免疫性疾病。疫复合物引起的自身免疫性疾病。 类风湿因子是由于感染因子（细菌、病类风湿因子是由于感染因子（细菌、病毒等）引起体内产生的以变性毒等）引起体内产生的
30、以变性IgG为抗原的为抗原的一种抗体，故又称抗抗体。一种抗体，故又称抗抗体。 原理：原理： 将变性将变性IgGIgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种致敏胶乳在与待测血清中的致敏胶乳在与待测血清中的RFRF相遇时，即发生肉眼相遇时，即发生肉眼可见的凝集。可见的凝集。参考值：参考值： 正常人正常人1 1：2020稀释血清为阴性。稀释血清为阴性。 类风湿因子（类风湿因子（rheumatoid factor,RF） 临床意义：临床意义：1.1.约约90%90%类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（RARA）患者的）患者的RFRF呈阳呈阳性。性。 2.2.某些自身免疫病，如冷球蛋白
31、血症、进行性某些自身免疫病，如冷球蛋白血症、进行性全身性硬化症、干燥综合征、全身性硬化症、干燥综合征、SLESLE等。等。 3.3.一些其他疾病如血管炎、一些其他疾病如血管炎、肝病肝病、慢性感染也、慢性感染也可出现可出现RFRF。 类风湿因子（类风湿因子（rheumatoid factor,RF） 酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：原理：v使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。免疫活性。 v使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的种酶标抗原或
32、抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。活性。v结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关接相关 。ELISA主要有以下几种类型：主要有以下几种类型：1.1.双抗体夹心法测抗原（常用）双抗体夹心法测抗原（常用）2.2.双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体3.3.间接法测抗体（常用）间接法测抗体（常用）4.4.竞争法测抗原竞争法测抗原5.5.竞争法测抗体竞争法测抗体6.6.
33、捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体7.7.亲和素亲和素- -生物素生物素 ELISAELISA法法包被特异性抗体包被特异性抗体加入待测样品加入待测样品加酶标特异性抗体加酶标特异性抗体底物显色底物显色洗涤孵育洗涤孵育双抗体夹心法测抗原v待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。v此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单价抗原的测定。双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体v反应模式与双抗体夹心法类似。v用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相
34、应的抗体。v此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。v乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。 间接法测抗体间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法。原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的 受检抗体，故称为间接法。操作步骤： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相 抗原，洗涤。 （2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固 相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 间接法的特点间接法的特点v本法主要用于对病原体抗
35、体的检测而进行传染本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。病的诊断。v间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。一酶标抗体检测相应抗体。v间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。响包被效果。竞争法测抗原竞争法测抗原 操作步骤操作步骤 ：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗
36、 体洗涤。体洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的 混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗 涤。涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原 最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标 本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管 颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。竞争法测抗体竞争法测抗体v当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得当抗原材料中的干扰物质不易除
37、去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。体。v标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。反应。 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体v样品中针对某些抗原的特异性样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性常和特异性IgG同时存在，后者会干扰同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。抗体的测定。因此测定因此测定IgM抗本多用捕获法。抗本多用捕获法。v
38、先将所有样品先将所有样品IgM（包括特异性（包括特异性IgM和非特异和非特异性性IgM）固定在固相上，在去除）固定在固相上，在去除IgG后再测定后再测定特异性特异性IgM。 操作步骤： （1）将抗）将抗IgM抗体抗体连接连接在固相载体上，形成固相抗在固相载体上，形成固相抗 IgM，洗涤。，洗涤。 （2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM抗体被、抗体被、 固相抗体捕获，洗涤。固相抗体捕获，洗涤。 （3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性IgM 结合，洗涤。结合，洗涤。 （4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结
39、合在固相上）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上 的抗原反应结合，洗涤。的抗原反应结合，洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在、）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在、 特异性特异性IgM抗体，是为阳性反应抗体，是为阳性反应。 亲和素亲和素-生物素生物素-ELISA法法v亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。v生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。v亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。v把亲和
40、素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。 乙型肝炎血清学检验临床意义乙型肝炎血清学检验临床意义 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBVHBV）引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。转化为肝硬化或肝癌。传播途径：传播途径：血液传播、性接触传播和母婴传播血液传播、性接触传播和母婴传播vHBV的抗原有的抗原有3种：表面抗原（种：表面抗原（HBsA
41、g）、核心抗）、核心抗原（原（HBcAg）和）和e抗原（抗原（HBeAg）。表面抗原大量）。表面抗原大量存在于感染者血液中，是存在于感染者血液中，是HBV感染以及检测的主要感染以及检测的主要标志。标志。v核心抗原是乙肝病毒核心颗粒的唯一结构蛋白。由核心抗原是乙肝病毒核心颗粒的唯一结构蛋白。由于它存在于于它存在于Dane颗粒核心结构表面，被表面抗原颗粒核心结构表面，被表面抗原覆盖，故不易在血循环中检出。可刺激机体产生抗覆盖，故不易在血循环中检出。可刺激机体产生抗-HBc。ve抗原为可溶性蛋白质，在病理上认为是抗原为可溶性蛋白质，在病理上认为是HBV复制复制以具有强感染性的一个指标。抗以具有强感染
42、性的一个指标。抗-HBe的出现，是预的出现，是预后良好的征象。后良好的征象。HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗HBe抗抗-HBc临床意义临床意义过去和现在均未感染过去和现在均未感染HBV 曾感染曾感染HBV，急性感染恢复，急性感染恢复期期 过去和现在均已感染过过去和现在均已感染过HBV 预防注射疫苗预防注射疫苗 既往感染；急性既往感染；急性HBV感染恢感染恢复期复期 既往感染；急性既往感染；急性HBV感染已感染已恢复恢复 急性急性HBV感染；慢性感染；慢性HBsAg携带者携带者 HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗HBe抗抗-HBc临床意义临床意义急性急性HBV感染趋向恢复；慢性感染趋向恢复
43、；慢性HBsAg 携带者携带者，传染性弱；，传染性弱；长期持续易长期持续易癌变癌变 急性或急性或慢性乙肝慢性乙肝，传染性极强，传染性极强 急性急性HBV感染早期，感染早期，HBsAg携带者携带者 急性急性HBV感染早期，传染性强感染早期，传染性强 急性感染中期急性感染中期 急性感染趋向恢复；慢性急性感染趋向恢复；慢性携带携带者者 急性感染趋向恢复急性感染趋向恢复 急性感染趋向恢复急性感染趋向恢复 艾滋病实验室检验艾滋病实验室检验 艾滋病是一种危害性极大的传染病，由艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒（感染艾滋病病毒（HIVHIV病毒）引起。病毒）引起。HIVHIV是一是一种能攻击人
44、体免疫系统的病毒。它把人体免种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的疫系统中最重要的T T淋巴细胞作为主要攻击目淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能， HIVHIV在人体内的潜伏期平均为在人体内的潜伏期平均为8 89 9年年 。艾滋病从感染到发病的一般过程艾滋病从感染到发病的一般过程感染分期感染分期临床分期临床分期维持时间维持时间感染标志物感染标志物传染性传染性原发感染原发感染潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期2-42-4周周 抗体阴性抗体阴性 (窗口期窗口期)传染传染危险性高危险性高原发感染原发感染症状期症状期急性急性HIV
45、感染感染1-21-2周周 传染传染危险性高危险性高慢性感染慢性感染潜伏期潜伏期无症状无症状HIV感染感染2 21515年年( (平均平均 8-10 8-10 年年) )抗体阳性抗体阳性有传染性有传染性临床临床发病期发病期艾滋病艾滋病0 03 3年年( (平均平均 1-21-2 年年) )抗体阳性抗体阳性抗原阳性抗原阳性传染性强传染性强检验标志物检验标志物检验目的检验目的检检 验验 方方 法法HIV(1+2) HIV(1+2) 抗体抗体筛查试验筛查试验金标法、硒标法金标法、硒标法 快速诊断试验快速诊断试验明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验(PA)(PA) 微孔板法微孔板法酶联免疫试验酶联免疫试验（
46、ELISAELISA） 第三代：双抗原夹心法第三代：双抗原夹心法 第四代：增加检测第四代：增加检测P24P24抗原抗原确证试验确证试验免疫印迹法免疫印迹法(WB)(WB) 手工手工/ /仪器仪器HIV抗体筛查试验抗体筛查试验明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验的操作和结果判断的操作和结果判断5 5 450/630nm450/630nm下测定下测定ODOD值值混匀，加盖，混匀，加盖，3737温育温育 洗板洗板3 3 加入底物加入底物第二次特异性结合第二次特异性结合4 4 加入终止液加入终止液1 1 加入样品加入样品 洗板洗板2 2 加入酶标记物加入酶标记物 加盖，加盖，3737温育温育加盖，加盖，3
47、737温育温育第一次特异性结合第一次特异性结合酶联免疫分析酶联免疫分析 ELISAELISA（双抗原夹心、两步法）（双抗原夹心、两步法）HIV抗体检测结果处理规范抗体检测结果处理规范检测方法检测方法检测结果检测结果检验报告检验报告处理处理筛查试验筛查试验阴性阴性HIVHIV抗体阴性抗体阴性阴性告知阴性告知阳性阳性HIVHIV抗体待复查抗体待复查上送确证上送确证确证试验确证试验阴性阴性HIVHIV抗体阴性（抗体阴性（- -）阴性告知阴性告知阳性阳性HIVHIV抗体阳性（抗体阳性（+ +）阳性告知，个案调查阳性告知，个案调查不确定不确定HIVHIV抗体不确定（抗体不确定（）告知，告知，3 3个月后
48、复查共个月后复查共2 2次次样品初筛检测初筛检测阳性反应阴性反应筛查试剂复查复查原有试剂加另一种筛选试剂均阳性反应一阴一阳均阴性反应送确认实验室确认报告阴性HIV抗体确证试验抗体确证试验 Western Blot 免疫印迹法免疫印迹法全自动免疫印迹仪全自动免疫印迹仪肿瘤标志物检测的临床应用肿瘤标志物检测的临床应用肿瘤标志物的定义肿瘤标志物的定义 肿瘤标志物肿瘤标志物（tumor marker，TM）是是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，而
49、产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺等。包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺等。可在肿瘤患者血液或体液中检测到肿瘤标志可在肿瘤患者血液或体液中检测到肿瘤标志物。物。肿瘤标志物的分类肿瘤标志物的分类癌胚抗原类标志物癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物糖类抗原标记物酶类标志物酶类标志物激素类标志物激素类标志物蛋白类标志物蛋白类标志物胚胎抗原类标志物胚胎抗原类标志物1 1、甲胎蛋白、甲胎蛋白AFPAFP 胎儿发育早期，由肝脏和卵黄囊合成的胎儿发育早期，由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，电泳时位于白蛋白和一种血清糖蛋白，电泳时位于白蛋白和1 1球球蛋白之间，胎儿出生
50、后不久即逐渐消失。成蛋白之间，胎儿出生后不久即逐渐消失。成人血清中含量甚微。人血清中含量甚微。 临床意义临床意义（1）原发性肝细胞癌患者血清中）原发性肝细胞癌患者血清中AFP浓度明显升高，约浓度明显升高，约77.1%的患者的患者AFP300ng/mL，但也有，但也有18%的病人的病人AFP并不并不升高。升高。（2）良性肝病，如病毒性肝炎、肝硬化患者）良性肝病，如病毒性肝炎、肝硬化患者AFP浓度有不同浓度有不同程度的升高，但其水平通常低于程度的升高，但其水平通常低于100ng/mL。 其升高原因主要是由于受损伤的肝细胞再生而形成幼稚其升高原因主要是由于受损伤的肝细胞再生而形成幼稚化细胞，幼稚化的
