1、2022-7-121一、基因诊断的概念和特点一、基因诊断的概念和特点三、常见的基因异常及其检测三、常见的基因异常及其检测五五、基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用2022-7-122通常是通常是指利用分子生物学的方法技指利用分子生物学的方法技术，直接检测体内术，直接检测体内DNADNA的的或或RNARNA的的，从而对疾病作出诊断的方法。，从而对疾病作出诊断的方法。 适用于遗传性疾病遗传性疾病、感染性疾病感染性疾病、肿瘤肿瘤等多种疾病的诊断，以及个体识别个体识别和亲子鉴定亲子鉴定等法病学领域。2022-7-123（l）特异性强）特异性强：直接检测导致疾病发生的基因变化；：直接检测导致
2、疾病发生的基因变化；（2）灵敏度高）灵敏度高：所采用的分子杂交和聚合酶链反应：所采用的分子杂交和聚合酶链反应 等技术都具有信号放大作用；等技术都具有信号放大作用；（3）取样便利）取样便利：一般不受组织或时相的限制；：一般不受组织或时相的限制；（4）早期诊断）早期诊断：易在疾病尚无临床表现时作出诊断；：易在疾病尚无临床表现时作出诊断；（5）应用广泛）应用广泛：可检测自体基因和外源基因。：可检测自体基因和外源基因。2022-7-124 42022-7-1254.DNA 芯片(DNA chip)技术 Southern/DNASouthern/DNA印迹印迹、Northern/RNANorthern/
3、RNA印迹印迹 (第七/六章)和Western/Western/蛋白质印迹蛋白质印迹(第九/二章)1.斑点印迹(dot blotting)与狭缝杂交2. 组织原位杂交组织原位杂交(tissure in situ hybridization )3. 等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交 (allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH)2022-7-126 6将核酸(DNA或RNA)样品点在NC膜上，变性后与标记探针结合，显影或显色，密度测量，与对照品比较确定所测核酸量的高低。方法：方法：应用：应用： 主要用于检测细胞基因拷
4、贝数的变化或者mRNA含量的变化。便于大规模检测和筛选；容易出现假阳性。特点：特点：Slot-blot结果GS-670型光密度扫描仪(Bio-Rad) 2022-7-128 8组织或细胞 (新鲜组织切片、细胞涂片或石蜡切片)样品做适当处理(如固定剂、蛋白酶，使其通透性增大，标记探针进入细胞内与核酸杂交。方法：方法：应用：应用：被检测基因或mRNA在细胞内的检测及定位。特点：特点：被检被检细胞内定位。2022-7-1292022-7-1210原癌基因原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因扩增基因扩增荧光原位杂交检测荧光原位杂交检测2022-7-12112022-7-1212根据已知基因突变位点
5、的碱基序列突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型野生型或突变型突变型基因序列片段互补的两种探针两种探针，分别与被检DNA进行杂交，确定基因突变存在与否，分辨纯/杂合子。方法：方法：应用：应用：基因结构变异基因结构变异所致疾病的诊断。特点：特点：杂交条件要求严格，以避免出现假阳性或假阴性。2022-7-1213N N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM2022-7-1214DNADNA点阵点阵 (DNA array)(DNA array)把多种已知序列的DNA片段排列在固体支持物上，同时对样品中的多种核酸进行检测和分析。方法：
6、方法：应用：应用：单核苷酸多态性(SNP)、基因表达谱和遗传性疾病的分析；病原微生物的大规模检测。DNADNA微阵列微阵列 (DNA microarray)(DNA microarray)通过计算机控制点样和图像扫描的高密度集成探针的杂交技术。2022-7-1215(第七/七章) 以以DNADNA分子为分子为模板模板，加入与拟扩增，加入与拟扩增DNADNA片段两片段两端分别互补的一对寡核苷酸链作为端分别互补的一对寡核苷酸链作为引物引物，在，在 DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，按照半保留复制的形式分别合的催化下，按照半保留复制的形式分别合成两股新的成两股新的DNADNA互补链，可使两引物间的互
7、补链，可使两引物间的DNADNA片段片段拷贝数增加一倍。拷贝数增加一倍。 多次重复这一过程，可使这段多次重复这一过程，可使这段 DNADNA拷贝数随拷贝数随复制次数以指数形式扩增。复制次数以指数形式扩增。2022-7-1216(1) (1) 的微量分析的微量分析 总RNA(或mRNA) ss-cDNA ds-cDNA PCR扩增 PCR法灵敏度高，对模板DNA纯度要求不高，且样品用量极微(如一滴血、一根头发等)。2022-7-121717(3)(3)巢式巢式-PCR(nested PCR)-PCR(nested PCR) 用2对引物(外引物、内引物)扩增，大大提高提高了扩增的特异性了扩增的特异
8、性(4) (4) 不对称不对称PCR(asymmetric PCR )PCR(asymmetric PCR ) 2个引物浓度不等，一般采用50:1或100:1 的摩尔比，主要获取单链获取单链DNADNA作构象分析或用作探针。2022-7-121818(5)(5)多重多重PCR(multiplex PCR) PCR(multiplex PCR) 在同反应体系中加入多对引物多对引物，同时扩增同一 DNA样品中的多个不同序列区域不同序列区域，且每对引物所扩增的产物长度都不同，可根据电泳结果判断是否存在某些基因片段的缺失或长度改变。(6)(6)等位基因特异性等位基因特异性PCR(AS-PCR) PCR
9、(AS-PCR) 针对等位基因的序列差异区域设计引物，使引物的 33端端与等位基因序列的差异碱基差异碱基对应，仅能与突变型或野生型互补。2022-7-12192022-7-1220 PCR扩增时，Taq酶的5- 35- 3外切酶活性外切酶活性将探针酶切降解，使报报告荧光基团告荧光基团和淬灭荧光淬灭荧光基团基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号； 每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2022-7-122121( (三三) ) 单链构象多态性分析单链构象多态性分析 利用利用单个或多个碱基不同单个或多个碱基不同、但序列长度相等的、但序列长度相
10、等的双链核酸分子，经变性成单链后双链核酸分子，经变性成单链后可可具有具有不同的构象不同的构象而在中性而在中性PAGEPAGE电泳中的电泳中的迁移率不同迁移率不同； 与正常的电泳图型对照，出现新条带即可判定与正常的电泳图型对照，出现新条带即可判定存在碱基变异。存在碱基变异。2022-7-12222022-7-1223231.1.限制性片段长度多态性的检测限制性片段长度多态性的检测3.3.单核苷酸多态性单核苷酸多态性2.2.数目可变的数目可变的串联重复序列多态性的检测串联重复序列多态性的检测(DNA polymorphism )(DNA polymorphism )(single nucleoti
11、de polymorphism, SNPSNP )(variable number of tandem repeatstandem repeats, VNTRVNTR)(restriction fragment length polymorphism, RFLP RFLP )2022-7-122424VNTRVNTR的的小卫星小卫星DNADNA(minisatellite DNA):(minisatellite DNA):重复单元长度重复单元长度为为6 670bp70bp；微卫星微卫星DNADNA(microsatellite DNA ):(microsatellite DNA ):重复单元长
12、重复单元长度为度为1 16bp6bp。短串联重复短串联重复DNADNA(short tandem repeat DNA,STR (short tandem repeat DNA,STR DNA):DNA):重复单元长度为重复单元长度为2 26bp6bp。2022-7-122525限制酶识别位点限制酶识别位点 限制酶识别位点限制酶识别位点 2022-7-122626 当某种限制酶的切点切点改变时(由点突变、单个碱基的插入或缺失引起)，用该种限制酶切割后得到的DNA片段的大小大小和数目数目都随之发生变化，通过电泳分析即可作出判断。PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制
13、性内切酶识别序列，在 PCR扩增后用该限制酶切割 PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。2022-7-1227ABCDEFGDEFBGCA-GAATTC-CTTAAG-EFBG C +DAEcoR 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化2022-7-122828(microdissection)(microdissection) 是应用是应用激光捕获显微镜激光捕获显微镜，在高倍镜下选择，在高倍镜下选择几几个甚至一个细胞个甚至一个细胞进行分析；可用于石蜡包埋组织进行分析；可用于石蜡包埋组织进行回顾性诊断。进行回顾性诊断。 是切割是切割分裂中期的染色体分裂中期的染色体的目的区
14、域，如某的目的区域，如某些断裂或易位、倒位位点的染色体片段，再进行些断裂或易位、倒位位点的染色体片段，再进行后续分析。后续分析。2022-7-1229 瑞士瑞士 MII CellCut MII CellCut 全自动激光显微切割（荧光）系统全自动激光显微切割（荧光）系统 可通过紫外激光紫外激光切割需要分离的组织，然后通过有黏性的有黏性的EppendorffEppendorff管盖管盖进行收集，这样就可以将特定类型的细胞从组织切片上分离下来。2022-7-1230 可以准确、快速、可以准确、快速、无损伤地分离出纯净无损伤地分离出纯净的特定细胞或组织，的特定细胞或组织，保持细胞内生物分子保持细胞内
15、生物分子的完整性的完整性，以便用于，以便用于后续的后续的DNADNA、RNARNA和蛋和蛋白质分析。白质分析。 配有近红外激光配有近红外激光( (波长波长810nm)810nm)；紫外；紫外激光激光( (波长波长349nm)349nm)；红色、绿色、蓝色三红色、绿色、蓝色三种荧光滤光片。种荧光滤光片。美国美国Arcturus公司的公司的VeritasVeritas激光捕获显微分离仪激光捕获显微分离仪2022-7-1231PICS Altra II流式细胞仪(分析分选)2022-7-123232 该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最可靠的可靠的种。缺点：费
16、时、费力、种。缺点：费时、费力、费用高费用高。2022-7-1233332022-7-123434 狭义的点突变指碱基替代，分为单点突变和狭义的点突变指碱基替代，分为单点突变和多点突变；广义的点突变还包括少数核苷酸的缺多点突变；广义的点突变还包括少数核苷酸的缺失或插入。失或插入。 突变位点已被阐明的遗传病，可采用检测。检测。2022-7-1235检测检测: : (1) (1)根据突变点上下游的序列设计合成引物，根据突变点上下游的序列设计合成引物，PCR PCR 扩增扩增出突变区的出突变区的DNADNA片段。片段。2022-7-1236N N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基
17、因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM检测示意图检测示意图) )2022-7-1237初筛：初筛：PCR-SSCP分析法分析法确认：确认：DNA sequencing。2022-7-12382022-7-1239 可供选择的方法：可供选择的方法：PCR-RFLP分析分析、AS-PCR、PCR-SSCP及及DNA测序等测序等2022-7-1240 原因：原因：-珠蛋白链第珠蛋白链第 6位密码子位密码子GAGGTG，造，造 成成GluVal所致。所致。 方法：设计一对引物方法：设计一对引物PCR扩增可得扩增可得294bp，Oxa NI 消化，电泳。消化，电泳。294191103bpA
18、 A：正常人BB：纯合子病人CC：杂合子病人结果：结果：2022-7-1241 1. 2. 。5 33 5（多重多重PCR的引物设计示意图的引物设计示意图）2022-7-1242 DMD DMD基因定位于人类基因定位于人类 X X染色体短臂染色体短臂 Xp21.2Xp21.2上。上。位于该区的位于该区的基因基因的的突变或部分缺失，是导致突变或部分缺失，是导致DMDDMD的原发病因。的原发病因。9 9个易发生缺失的热点个易发生缺失的热点区片段区片段, ,它们分别位于外显子它们分别位于外显子4 4、8 8、1212、1717、1919、4444、4545、4848和和5151。(Duchenne
19、muscular dystrophy, DMD)2022-7-1243 同时用同时用双重扩增双重扩增外外显子显子1717和和4848区域内的区域内的2 2个片段，可检测出个片段，可检测出7575左左右的基因缺失型患者；右的基因缺失型患者； 若同时用若同时用9 9对引物多重对引物多重扩增，则可以检测到扩增，则可以检测到9090左右的基因缺失型患者。左右的基因缺失型患者。2022-7-1244 基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置称基因易位或重排体的某个位置称基因易位或重排。 可用可用，可在染色，可在染色体上定位基因或体上定位基因或DNADN
20、A片段及它们彼此间的排序。片段及它们彼此间的排序。 前提条件是已知重排基因和位点的序列。前提条件是已知重排基因和位点的序列。2022-7-1245荧光原位杂交荧光原位杂交（双色FISH）2022-7-1246 基因扩增指基因拷贝数增加的现象基因扩增指基因拷贝数增加的现象, ,可可增加几十到上千倍。增加几十到上千倍。 可用待测基因的可用待测基因的 DNADNA片段或片段或cDNAcDNA片段为片段为探针，基因组探针，基因组DNA DNA 采用采用适当的限制酶酶切适当的限制酶酶切后后作作SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交分析。分析。2022-7-1247 1 1.限制性片段长度多态性
21、限制性片段长度多态性(RFLP)(RFLP)2.2.数目可变串联重复序列数目可变串联重复序列(VNTR)(VNTR)多性多性 多态性位点周围DNA序列已知时，可用PCR/ RFLP分析。 针对串联重复序列两侧的DNA序列设计引物，PCR 扩增后电泳。2022-7-12481 1 .mRNA mRNA 的相对定量分析的相对定量分析 放射或非放射标记的放射或非放射标记的cDNAcDNA探针与待测探针与待测RNARNA杂交，杂交，经显影或显色，与正常对照比较即可定量待测经显影或显色，与正常对照比较即可定量待测RNARNA。 对电泳凝胶中的扩增产物对电泳凝胶中的扩增产物cDNAcDNA行光密度扫描，行
22、光密度扫描，计算模板计算模板mRNAmRNA的量；若的量；若dNTPs dNTPs 带放射性标记，作带放射性标记，作放射活性测定，并由此推算放射活性测定，并由此推算mRNAmRNA的含量。的含量。2022-7-1249 (1)(1)采用一系列已知不同浓度的与待测采用一系列已知不同浓度的与待测mRNAmRNA序列相同序列相同但长度不同的内对照但长度不同的内对照mRNAmRNA，在同一体系中一同进行，在同一体系中一同进行RT-RT-PCR(PCR(加加3232p p-dCTP)dCTP)，扩增产物经电泳分离，分别测定两者扩增产物经电泳分离，分别测定两者放射性强度，绘制标准曲线即可查出特异放射性强度
23、，绘制标准曲线即可查出特异mRNAmRNA的量。的量。 (2) (2)。 (2) (2)先分析先分析RT-PCRRT-PCR产物电泳条带长度，后产物电泳条带长度，后测序测序确认。确认。 (1) (1)采用采用NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交法检测某种特异的法检测某种特异的mRNAmRNA的长的长度有否改变；度有否改变； 2022-7-12502022-7-1251 人类基因组人类基因组DNADNA序列中存在众多的多态遗传标序列中存在众多的多态遗传标记，除非同卵双生，几乎没有任何两个人的记，除非同卵双生，几乎没有任何两个人的DNADNA分分析图谱会完全相同，称为析图谱会完全相同，
24、称为DNADNA指纹。指纹。 人类基因组中存在有大量的人类基因组中存在有大量的；可分为小卫星；可分为小卫星 DNADNA、微卫星、微卫星DNA/DNA/短串联短串联重复重复(STR) (STR) 。 VNTR VNTR位点的平均杂合度在位点的平均杂合度在70% 70% 左右，存在极为广泛，左右，存在极为广泛，分布十分理想，且检测方法简便，以取代分布十分理想，且检测方法简便，以取代RFLPRFLP而成为构建而成为构建连锁图谱的新标记。连锁图谱的新标记。2022-7-1252 1985 1985年，英国遗传学年，英国遗传学家家JeffreysJeffreys等用串联重复等用串联重复序列序列(TR)
25、(TR)的核心序列为探的核心序列为探针进行针进行RFLPRFLP分析，检测到分析，检测到许多高度可变区许多高度可变区(HVR)(HVR)，所得图谱具有高度的个体所得图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专一性，指纹那样的高度专一性，称为称为DNADNA指纹图谱指纹图谱( (D N A D N A fingerprinting)fingerprinting)。 Alec John JeffreysOxford, United Kingdom 2022-7-1253 法医学中基因诊断的目的主要是法医学中基因诊断的目的主要是个体识别个体识别和和亲子鉴定亲子鉴定。
26、 以往法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋以往法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白型、红细胞酶型和HLAHLA分型、分型、单位点特异性单位点特异性探针探针RFLPRFLP分析分析；个体分辨力不够，只能排除，；个体分辨力不够，只能排除，不能做到统一认证。不能做到统一认证。2022-7-1254法医案检中的基因诊断技术法医案检中的基因诊断技术 VNTR（可变数目串联重复序列（可变数目串联重复序列/小卫星）的小卫星）的核酸分子杂交核酸分子杂交分析分析 STR（短串联重复序列（短串联重复序列/微卫星）的微卫星）的PCR分析分析 SNP的的基因芯片检测基因芯片检测2022-7-1255亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。为养女。 2022-7-1256血迹中的血迹中的DNA
