1、免疫胶乳浊度分析在自动生化分析仪上的应用n免疫比浊回顾n免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）n在生化分析仪上进行测定的有关问题2免疫比浊3免疫检测的基础 抗原抗体间的特异性反应抗原抗体间的特异性反应 手工操作 自动化分析核心核心基础基础n免疫比浊技术是在免疫沉淀反应（Precipitation）检测法的基础上建立的。n最早应用的免疫沉淀反应是Ouchterlony在1948年建立的琼脂双向扩散法。n1965年Mancini等和Fahey等分别建立了可以定量的单向（辐射状）免疫扩散技术。nLaurell等1966年建立了电免疫扩散法，使报告结果的时间由单向免疫扩散
2、法的24h缩短到4-5h。4免疫比浊n经典的免疫沉淀试验通常是在抗原与相应抗体反应的终点判定结果，存在费时、操作繁琐、敏感度低（10100mg/L）、不能自动化等缺陷。n根据沉淀反应时，抗原抗体结合后可使反应系统透光度发生改变，建立了以测定透光度为特征的微量免疫沉淀测定法法，既免疫浊度测定技术。5免疫比浊n1967年由Richie首次报告，20世纪70年代逐步完善，80年代初期初步应用临床常规检查。n抗原抗体在液相（特殊的缓冲液）中快速结合，形成抗原抗体复合物，反应液出现浊度。6免疫比浊n液相中抗原与抗体的反应结果与两者的浓度比例有关。抗原或抗体显著过量时，都只能生成少量的可溶性免疫复合物，分
3、子极小，不适于免疫比浊法检测。 n免疫比浊技术要求溶液中抗体要保持中等过量，此时免疫复合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。n在这种情况下，抗原与抗体的反应遵循质量作用定律（Ag+AbAg.Ab），形成IC的量是抗原或抗体的函数。n当抗体固定时，IC的量与抗原的量成正比。7免疫比浊8LIGHTSOURCEFILTERREACTIONCUVETTETURBIDIMETRIC DETECTORNEPHELOMETRICDETECTORICIC散射比浊、透射比浊光路图 透射光透射光+ +散射光散射光散散光光射射平光线平光线n目前，国内开展的各项免疫检验，均求使用国家食品药品监督管理局
4、（SFDA）准入和批准的仪器和试剂。这样做不仅能使各项检查更加统一，规范，各实验室之间检查结果更具可比性，而且也可避免很多不必要的医疗纠纷。n免疫比浊技术中散射比浊法目前均用获国家食品药品监督管理局（SFDA）批准进口的自动化分析仪器和配套的各种检测项目的专用试剂。n透射比浊法（生化分析仪）可用国产试剂。9全国临床检验操作规程 第3版透射还是散射n散射比浊 专用仪器 专用配套试剂 原装进口试剂昂贵n透射比浊 生化分析仪 开放试剂 （可用国产试剂）10a) 速率法和终点法测定；b) 速率法的灵敏度和特异性优于终点法；终点法的稳定性较好；透射还是散射n目前，由于技术的发展，两种比浊法的灵敏度和特异
5、性已接近，而全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比浊仪，透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。生化分析仪通过免疫比浊法技术，架起了现代生化检验和现代免疫技术的桥梁。n免疫化学是免疫学技术和生物化学技术的结合。既具有免疫学抗原抗体结合的特异性，又具有生物化学反应动力学特点。11透射还是散射透射免疫比浊n可溶性抗原与其特异性抗体，在一定缓冲液中形成的复合物，经一段时间聚合后出现浊度，人射光在渗过反应液时，由于溶液内IC粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，可用吸光度A表示。n用已知浓度的标准参考品建立标准曲线，测出待测抗原的含量。n透射比浊法主要用于生化分析仪。12透射免疫比浊n免疫复
6、合物直径为35lOOnm，这一范围要求近紫外光处入射光发出最大的干扰(最大吸收峰)，选择290410nm波长测定最佳。n由于抗原抗体结合后在短时间内(19s)形成可见的复合物，才能进行比浊。n为了提高复合物形成速度，加入促聚剂，如4聚乙二醇(MW：60008000)，可使复合物形成在310min完成。13n比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。n为解决快速反应及微量化的要求，建立了免疫胶乳浊度法（immunolatex turbidimetry）。14免疫胶乳浊度分析（immunolatex tur
7、bidimetry）n其基本原理是：a)将特异性抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。b)单个胶乳颗粒在入射光波之内，不阻碍光线透过；两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少。c)免疫微球凝聚的程度为被测物浓度的函数，由此可测出标本中待测物的含量。15免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）16(a)带抗体的胶乳在带抗体的胶乳在1个波长之内可透过光线个波长之内可透过光线 (b)结合后，则形成光线衰减结合后，则形成光线衰减该技术的关键在于两个方面：n首先是选择适用的胶乳，其大小（直径）要稍小于波长。用500nm波长者，选择
8、100nm颗粒较适合；用585nm波长者，则选用100200nm颗粒为好。目前多用200nm的胶乳颗粒。n其次，胶乳与抗体结合时用化学交联虽好，但失活也较严重；一般用吸附法即可。17免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）18免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）n胶乳颗粒多为惰性微球和羧基化微球n氨基化高分子纳米微球氨基化纳米微球的颗粒大小较传统的微球更小（约0.1m），它与抗体的结合是通过其表面的氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结
9、构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。与采用惰性纳米微球的传统技术相比，检测的灵敏度得到了极大的改善，最高可达到1.0ng/ml。19免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）（1）操作简单，可在几分钟内快速、准确地检测血清蛋白含量，真实反映病情进展和评估治疗效果，对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义；（2）不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性都很好；（3）能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。20免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）n胶乳比浊分析n颗粒增强透射免疫比浊法（
10、particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）n胶乳增强免疫浊度测定（Latex enhanced turbidimetric immunoassay , LETIA ）n粒子强化免疫浊度测定21免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）22生化仪上开展的免疫项目serum proteins 血清蛋白类IgA（免疫球蛋白A）IgG（免疫球蛋白G）IgM（免疫球蛋白M）IgE（免疫球蛋白E）C3（补体C3）C4（补体C4）Microalbumin （微量白蛋白）2-microglobulin （ 2球蛋白）-1-
11、acid glycoprotein （ -1酸性糖蛋白）Ferritin（铁蛋白）Transferrin（转铁蛋白） 心血管疾病监测Apo A-1（载脂蛋白A1）Apo B（载脂蛋白B）Lp(a)（脂蛋白a）h-CRP(超敏感C反应蛋白）Homocysteine （同型半胱氨酸）D-Dimer（D二聚体）Myoglobin（肌红蛋白）cTnI（肌钙蛋白I）23生化仪上开展的免疫项目Rheuma 风湿病RF（类风湿因子）ASO（抗链O）CRP（C-反应蛋白）肾小球过滤率最敏感的指标cystatin C （胱抑素C ）24生化仪上开展的免疫项目25TDM治疗药物监测Phenobarbital （苯
12、巴比妥）Phenytoin（苯妥英纳）Valproic acid（丙戊酸）Carbamazepine （卡马西平）Theophylline（茶碱）Gentamicin（庆大霉素）Digoxin（地高辛）Digitoxin（洋地黄）Vitamins维生素Vitamin B12 （维生素B12）Folate（叶酸）infectious Diseases 传染性疾病TOXO（弓形体）RUBELLA（风疹病毒）生化仪上开展的免疫项目26免疫比浊法试剂的组成免疫比浊法试剂的组成R1（试剂试剂 I）: 缓冲液缓冲液R2（试剂试剂 II）: 启动试剂启动试剂 ( (带或不带乳胶颗粒带或不带乳胶颗粒) )ST
13、ANDARDS（标准液标准液） ( (一点或多点标准一点或多点标准) )CONTROLS（质控液质控液）27免疫比浊法试剂的组成免疫比浊法试剂的组成R R1 1缓冲液缓冲液 R R2 2启动试剂启动试剂 校准血清校准血清反应类型（不需要乳胶）AgAb (Reagent)28反应类型（需要乳胶）LATEX PARTICLEAg2930试剂成份的功用试剂成份的功用缓冲液: 使反应有最大限度的敏感性使反应有最大限度的敏感性 避免非特异的结果避免非特异的结果 降低反应时间降低反应时间启动试剂: 产生抗原产生抗原-抗体反应抗体反应标准液: 建立浓度与信号（吸光度）之间的关系建立浓度与信号（吸光度）之间的
14、关系质控液: 检查定标的情况检查定标的情况CRM470-全新的国际蛋白标准全新的国际蛋白标准3132nCRM 欧共体参考局（ BCR ）的认可参考品。nCRM470是14种（血清）蛋白分析物的参考制品。nCRM470基于人血清（人血清蛋白参考制备物 lot 5 ，RPPHS lot 5）的Certified Reference Materialn由以下组织共同发展： IFCC BCR Brussels CAP USA CRM470-全新的国际蛋白标准全新的国际蛋白标准33nCRM 470在欧洲由BCR制备提供。在美国则由美国病理协会（CAP）提供材料。n生产厂家用CRM470对自己的定标液和质
15、控液进行标化。nCRM和SRM（Standard Reference Material标准参考材料）可以认为是目前可以提供的最高质量的材料。SRM主要用于USA（国家标准和技术研究院NIST）。 CRM470-全新的国际蛋白标准全新的国际蛋白标准基于基于CRM470参考物的成人参考范围参考物的成人参考范围CRM470参考物及其参考范围血浆蛋白质每个CRM470的参考范围（g/L）白蛋白3552-1-抗胰蛋白酶0.92.0（-1-抗胰蛋白酶抑制剂）C3C-补体0.91.8C4-补体0.10.4铜兰蛋白0.20.6C-反应蛋白（CRP）0.005-1-酸性糖蛋白（类粘蛋白）0.51.2触珠蛋白0.
16、32.0IgA0.74.0IgG716IgM0.42.3-2-巨球蛋白1.33.0前白蛋白（transthyretin）0.20.4转铁蛋白2.03.6 注：C3C在新鲜样本中可期望较低的参考范围3435a)a)对实验室的生化分析仪尽可能充分的掌握并理对实验室的生化分析仪尽可能充分的掌握并理解。解。b)b)理解各个检测项目的方法学原理。理解各个检测项目的方法学原理。c)c)仔细认真阅读商品化试剂的说明书。仔细认真阅读商品化试剂的说明书。d)d)销售商或者厂家技术部门的支持。销售商或者厂家技术部门的支持。“所谓生化分析仪就是将实验参数输入仪器，由仪器按照试验指令来完成整个试验。参数设置，基本功在
17、仪器之外，如果对分析化学、对酶动力学、仪器性能没有一定的掌握，是很难设置好参数的。”在自动生化分析仪上的应用在自动生化分析仪上的应用36免疫浊度法在生化分析仪上常见的测定（分析）方式FINAL POINT DFINAL - SAMPLE BLANK D - AFINAL - INITIAL D - BKINETIC (C - B)/ timeR2 (LATEX OR ANTISERA)SAMPLEAND R1 (BUFFER)TIME OD increment37测定CRP分析方式 采用双试剂、两步终点法采用双试剂、两步终点法37 5min37 5minA1A2SampleenR1R2R1R2
18、End38Heidelberger & Kendall ExperienceExcess antibodyzone Equivalence zoneExcess antigen zoneAntigen concentration TURBIDITY ( OD )（useful zone）ABC免疫浊度测量多点定标免疫浊度测量多点定标n依据抗原抗体反应特性，免疫比浊测量选择在A区，IC的浊度随着抗原的增加而增加，但不是呈线性的对应关系（曲线往往有截距或呈S形），要得到正确的结果，必须做一个多点定标的标准曲线。n自动生化分析仪多推荐5点或6点定标，然后选择适当的数学模型作曲线拟合，如：Logit-
19、Log变换； y=d+cx+bx2+ax33940多点定标：RF、CRPREAL RELATION AND CURVEOF CALIBRATIONSTRAIGHT LINE CALIBRATION(THERE IS AN ERROR)concentrationOD increment41CONCENTRATIONOD incrementREAL RELATIONSTRAIGHT LINECALIBRATION一点定标：例如ASO免疫浊度测量多点定标免疫浊度测量多点定标校准曲线的选择和拟合效果检验：a.选择何种校准曲线作数据处理，是试验成功的关键之一。b.一般用试剂厂家提供的或文献介绍的校准模式
20、。c.应该对拟合曲线作检验和比较。42带现象带现象（zone phenomenon）的影响的影响n抗原或抗体过剩使免疫复合物部分或全部解离的现象，称为带现象。n免疫浊度测定中常表现为抗原过剩时免疫复合物形成的量反而下降，又称钩状效应（hook effect）。n克服办法：a)采用高质量试剂b)设置仪器监测c)减少血清用量43双试剂测量方法双试剂测量方法n运用合理的双试剂测量方法，可以消除血清中许多物质的干扰，如脂肪、黄疸、溶血、循环免疫复合物等。n非特异性光散射的影响。n伪浊度的影响。4445单、双试剂法反应过程的光密度变化曲线图单、双试剂法反应过程的光密度变化曲线图A：双试剂法；：双试剂法；
21、 B：单一试剂法：单一试剂法R1-SR2双试剂法反应过程AB实际工作中常见的一些问题实际工作中常见的一些问题n仪器的保养维护、水质、清洗剂等n仪器参数设置n校准时的操作过程n试剂存放及试剂空白（水空白）n低水平测量值不稳定甚至出现负值等a)试剂的质量b)标本处理c)低浓度的标本461.叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京:东南大学出版社,20062.韩志钧,黄志锋,卢业成.临床化学常用项目自动分析法.沈阳:辽宁科学技术出版社,2005.83.焦连亭.我国生化分析仪临床应用中应注意的若干问题.中华医学检验杂志,2005,28(5):4724.黄文方,刘华.实用医学分析技术与应用.第一版.北京:人民卫生出版社,2002.105.管卫,沈永明,李忠信.医学实验室量值的溯源性.江西医学检验,2004,22(1)6.吕世静,陈玉民.免疫学检验.第二版.北京:人民卫生出版,2006.647参考文献谢谢大家！谢谢大家！
