1、第三章第三章 免疫原和抗血清的制备免疫原和抗血清的制备第一节第一节 免疫原的制备免疫原的制备 免疫原免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体是能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与抗体或致敏淋巴细胞或致敏淋巴细胞，并能与抗体或致敏淋巴细胞发生反应的物质发生反应的物质颗粒性抗原颗粒性抗原细胞、细菌、寄生虫细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原可溶性抗原蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸抗原的制备对免疫学技术的意义：抗原的制备对免疫学技术的意义：制作诊断试剂的需要制作诊断试剂的需要制备抗体的需要制备抗体的需要精品资料 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，
2、你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”免疫原的制备流程免疫原的制备流程选材预处理选材预处理细细 胞胞 粉粉 碎碎提提 取取 纯纯 化化 鉴鉴 定定冷冷 藏藏 保保 存存细胞抗原：绵羊红细胞细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵寄生虫体抗原：虫卵一、颗粒性抗原的制备一、颗粒性抗原的制备1.1.绵羊红细胞：配成绵羊红细胞：配成 2 25 5的细胞悬液。的细胞悬液。 2.2.细菌免疫
3、原：鞭毛抗原需甲醛处理；菌体抗细菌免疫原：鞭毛抗原需甲醛处理；菌体抗 原应加温去除鞭毛抗原（原应加温去除鞭毛抗原（100100 加热加热2-2.52-2.5小时）。小时）。 3.3.虫卵：制备成悬液虫卵：制备成悬液（一）可溶性抗原的制备（一）可溶性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化二、可溶性抗原的制备和纯化 可溶性抗原包括蛋白质、脂多糖、核酸等，多来源于人可溶性抗原包括蛋白质、脂多糖、核酸等，多来源于人和动物的组织或细胞，需先将组织或细胞破碎，再提取和纯化，和动物的组织或细胞，需先将组织或细胞破碎，再提取和纯化，才能获得所需的可溶性抗原（体液、组织液中抗原直接提取）。才能获得所需的可溶性抗原
4、（体液、组织液中抗原直接提取）。组织抗原的制备组织抗原的制备细胞的破碎细胞的破碎 酶处理法：溶菌酶溶解酶处理法：溶菌酶溶解G G- - 菌的细胞壁；纤维素酶能溶解真菌的细胞壁；纤维素酶能溶解真 菌的细胞壁。作用条件温和，不易破坏内含物的成分，条菌的细胞壁。作用条件温和，不易破坏内含物的成分，条 件可控。件可控。 反复冻融法（快冻慢溶）：冷冻使细胞内水分形成冰晶或反复冻融法（快冻慢溶）：冷冻使细胞内水分形成冰晶或 剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，适用于组织细胞破碎剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，适用于组织细胞破碎 ，对微生物作用差。，对微生物作用差。 超声波破碎法：作用较温和，对大多数组织细胞破
5、碎效果超声波破碎法：作用较温和，对大多数组织细胞破碎效果 好，重复性好，节省时间。对细菌和厚膜孢子效果差。好，重复性好，节省时间。对细菌和厚膜孢子效果差。 表面活性剂处理法：通过改变膜的通透性和渗透压，多用表面活性剂处理法：通过改变膜的通透性和渗透压，多用 于细菌破碎和提取核酸。于细菌破碎和提取核酸。超速离心法：根据抗原比重特点进行分离超速离心法：根据抗原比重特点进行分离差速离心法低速和高速离心交替进行差速离心法低速和高速离心交替进行适用用于分离大小差别较大的抗原：大分子抗原适用用于分离大小差别较大的抗原：大分子抗原（IgM(800kD)IgM(800kD)、C1q(410kD),C1q(41
6、0kD),小分子抗原（载脂蛋白小分子抗原（载脂蛋白A28.3kD)A28.3kD)特点：方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量特点：方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。制品提取。密度梯度离心法区带离心法密度梯度离心法区带离心法 离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料（蔗糖、甘油）形离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料（蔗糖、甘油）形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中梯度柱中 可以同时使样品
7、中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率 （二）可溶性抗原的纯化（二）可溶性抗原的纯化选择性沉淀法：根据蛋白质理化特性差异选择性沉淀法：根据蛋白质理化特性差异核酸去除法：氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素核酸去除法：氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素 盐析法：高浓度盐离子在蛋白质溶液中与蛋白质竞争水分子，盐析法：高浓度盐离子在蛋白质溶液中与蛋白质竞争水分子，破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质从液体中沉淀出来。不同蛋破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质从液体中沉淀出来。不同蛋白质在不同盐浓度中有不同的溶解度，白质在不同盐浓度中有不同的溶解度，33% -50%33% -50%硫
8、酸铵硫酸铵特点：方法简单、有效，不影响抗原活性；盐析法提纯特点：方法简单、有效，不影响抗原活性；盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化 有机溶剂沉淀法：降低溶液的电解常数，增加蛋白质的静电有机溶剂沉淀法：降低溶液的电解常数，增加蛋白质的静电引力，是蛋白质溶解度降低，蛋白质聚集而沉淀。引力，是蛋白质溶解度降低，蛋白质聚集而沉淀。特点：分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，特点：分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，常采用降低温度的方法
9、进行有效控制质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制 聚合物沉淀法：聚乙二醇聚合物沉淀法：聚乙二醇，能够破坏蛋白质分子表能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀面的水化层而发生沉淀, ,蛋白分子量越大需要的蛋白分子量越大需要的PEGPEG浓度越低浓度越低, PEG, PEG浓度在浓度在3 34 4时沉淀免疫复合物，时沉淀免疫复合物，6 67 7可沉淀可沉淀IgMIgM，8 81212可沉淀可沉淀IgGIgG，12121515可沉淀其他球蛋白，可沉淀其他球蛋白，2525可沉淀白蛋白。最突可沉淀白蛋白。最突出的应用是用出的应用是用3 34 4的的PEGPEG沉淀免疫复合物，未结沉淀免疫复合物，
10、未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定比浊法和循环免疫复合物测定法。测定比浊法和循环免疫复合物测定法。 凝胶层析法：凝胶层析法： 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离进行分离 层析法层析法：离子交换层析法：离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂（带有离子基团）：在惰性载体上引入带有离子交换剂（带有离子基团）：在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂电荷的活性基团即离子交换剂离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂离子交换纤维素
11、、离子交换凝胶、离子交换树脂 阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换增加离子强度（增增加离子强度（增加介导常数）或减加介导常数）或减少少pH(pH(减少蛋白质电减少蛋白质电荷），使蛋白质从荷），使蛋白质从离子交换剂上解吸离子交换剂上解吸附附亲和层析法：亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 抗原抗原抗体抗体受体受体配体配体电泳法：电泳法： 利用分子量和电荷量不同进行分离利用分子量和电荷量不同进行分离 （三）纯化抗原的鉴定（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量
12、测定：蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：分子量测定：SDS-PAGESDS-PAGE、凝胶过滤、凝胶过滤纯度鉴定：纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGESDS-PAGE、毛细管电泳、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、双向免疫扩散、免疫电泳、ELISAELISA三、人工抗原的制备三、人工抗原的制备 半抗原半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等
13、载体载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质赋予半抗原以免疫原性的物质人工结合抗原、人工合成抗原和基因工程抗原人工结合抗原、人工合成抗原和基因工程抗原人工结合抗原人工结合抗原蛋白质：蛋白质：牛血清白蛋白牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白 牛甲状腺球蛋白牛甲状腺球蛋白 血蓝蛋白血蓝蛋白多肽聚合物：多肽聚合物：多聚赖氨酸多聚赖氨酸（polylysine） 大分子聚合物：大分子聚合物：羧甲基纤维素羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC) 聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP） （一
14、）载体（一）载体物理方法：物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原利用通过电荷和微孔吸附半抗原 吸附的载体有吸附的载体有CMCCMC、PVPPVP、硫酸葡聚糖等、硫酸葡聚糖等 （二）半抗原与载体的连接方法（二）半抗原与载体的连接方法化学方法：化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法 戊二醛法戊二醛法 混和酸酐法混和酸酐法 过碘酸氧化法过碘酸氧化法 不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使
15、其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与载体连接基的衍生物，再与载体连接 半抗原半抗原-NH-NH2 2 + COH-+ COH-（CHCH2 2）3 3-COH + NH-COH + NH2 2- -载体载体（三）半抗原性免疫原的鉴定（三）半抗原性免疫原的鉴定 一个载体分子至少要连接一个载体分子至少要连接2020个以上的半抗原分子，个以上的半抗原分子，才能有效的刺激产生免疫应答才能有效的刺激产生免疫应答 半抗原与载体的比例测定：半抗原与载体的比例测定：吸收光谱分析法吸收光谱分析法放射性核素标记半抗原渗入法放射性核素标记半抗原渗入法第二节第二节 免疫佐剂免疫佐剂免疫佐剂免疫佐剂（immun
16、oadjuvant）：预先或与预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂称为免疫佐剂, ,简称佐剂简称佐剂（adjuvant）。）。 化合物（本身不具有免疫原性）化合物（本身不具有免疫原性）: :氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80-80、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸 胞苷酸胞苷酸(poly I C)、脂质体脂质体 生物制剂生物制剂（本身具有免疫原性）本身具有免疫原性） : :处理改造的细菌及代谢产物
17、，处理改造的细菌及代谢产物，如卡如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTBCTB、LPSLPS和类脂和类脂A A、胞壁酰二肽等；细、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白胞因子及热休克蛋白 用于人体的佐剂：用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、氢氧化铝、明矾、poly ICpoly IC、胞壁酰二肽、细、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂弗氏佐剂(Freunds adjuvant) 一、佐剂的种类一、佐剂的种类 弗氏佐剂弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)：弗氏不完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物
18、弗氏不完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗乳化方法：乳化方法： 研磨法和搅拌混合法研磨法和搅拌混合法 改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。刺激单核刺激单核- -吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。刺激淋巴细胞增殖和分化。刺激淋巴细胞增殖和分化。 改变抗体的产生类型及诱导迟发超敏反应改变抗体的产生类型及诱导迟发超敏反应二、佐剂的作用机制二、佐剂的作用机制第三节第三节 抗血清的制备抗血清的制备 抗血清的制备是将制备抗
19、血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个的抗原刺激下，体内多个B B细细胞克隆被激活并产生针对某胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体其混合物为多克隆抗体 一、免疫动物的选择一、免疫动物的选择 我要制备抗人我要制备抗人HSP70HSP70抗体，我不能选择什么样动物？抗体，我不能选择什么样动物？ 我要制备抗鸡我要制备抗鸡IgGIgG抗体，我不能选择什么样动物？抗体，我不能选择什么样动物？抗原来源与
20、动物种属关系远的抗原来源与动物种属关系远的动物个体必须适龄、健康、体重合适动物个体必须适龄、健康、体重合适抗原的性质：抗原的性质：蛋白质抗原对大部分抗原皆适用，常用羊、兔蛋白质抗原对大部分抗原皆适用，常用羊、兔有些物质动物体内有类似物质或者蛋白抗原对这些动物免疫原有些物质动物体内有类似物质或者蛋白抗原对这些动物免疫原性差，如性差，如IgEIgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶对山羊，免疫后对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶对山羊，免疫后不出现抗体。不出现抗体。抗血清用量和要求：抗血清用量和要求：R R型血清（家兔）：抗原抗体反应比例合型血清（家兔）：抗原抗体反应比例合适范围宽适范围宽, ,适用于诊断。适
21、用于诊断。H H型血清（马）：抗原抗体反应比例合型血清（马）：抗原抗体反应比例合适范围窄，适用于免疫治疗。适范围窄，适用于免疫治疗。一、免疫动物的选择一、免疫动物的选择免疫原的剂量：由免疫原性的强弱、免疫动物种的免疫原的剂量：由免疫原性的强弱、免疫动物种的个体状态、免疫时间决定。个体状态、免疫时间决定。 中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 高特异性抗体：低剂量短程免疫高特异性抗体：低剂量短程免疫 高效价抗体：高剂量长程免疫高效价抗体：高剂量长程免疫免疫间隔时间免疫间隔时间 第一次和第二次间隔第一次和第二次间隔10102020天，三次及以
22、后间隔天，三次及以后间隔7 71010天天免疫途径免疫途径 皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结 颗粒性抗原选择静脉免疫颗粒性抗原选择静脉免疫二、免疫方法二、免疫方法颈动脉采血法：颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊家兔、绵羊、山羊 心脏采血法：心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法：静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊家兔、山羊、绵羊 三、动物采血法三、动物采血法第四节第四节 抗血清的鉴定和保存抗血清的鉴定和保存抗体特异性的鉴定：抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：抗体效价的鉴定：凝集试验凝集试验 、双向免疫扩散试
23、验、双向免疫扩散试验、ELISA ELISA 抗体纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE SDS-PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲和性的鉴定：抗体亲和性的鉴定：平衡透析法、平衡透析法、ELISAELISA、RIARIA竞争结合试验竞争结合试验 一、抗血清的鉴定一、抗血清的鉴定 抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合 强度强度 用亲和常数用亲和常数KaKa表示表示( (表示表示1mol1mol抗体稀释至多少升，才能使抗原抗体稀释至多少升，才能使抗原- -抗抗 体结合下降体结合下降
24、50%50%。 单位为稀度单位（单位为稀度单位（LMLM-1-1） KaKa值高（值高（10109 91212L/molL/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度）有助于提高灵敏度、精确度和准确度 第五节第五节 抗血清的纯化抗血清的纯化 抗原免疫动物制备的抗血清是成分复抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。杂抗体干扰试验结果。盐析法：盐析法：硫酸铵盐析法提取硫酸铵盐
25、析法提取球蛋白球蛋白 离子交换层析法：离子交换层析法：QAE-sephadex带正电荷，带正电荷，IgG带正电荷。带正电荷。亲和层析法：亲和层析法：纯化抗原或纯化抗原或SPA交联交联Sepharose 4B制成亲和层析制成亲和层析柱柱 2288保存：短期保存保存：短期保存冰冻保存：保存冰冻保存：保存5 5年年真空干燥保存：保存真空干燥保存：保存5 51010年年二、抗血清的保存二、抗血清的保存多克隆抗体的实际意义多克隆抗体的实际意义：预防：治疗感染性疾病（人工被动免疫）预防：治疗感染性疾病（人工被动免疫） 如：破伤风抗毒素血清（副作用是超敏反应）如：破伤风抗毒素血清（副作用是超敏反应）诊断：肥大氏反应（诊断伤寒、副伤寒）诊断：肥大氏反应（诊断伤寒、副伤寒）抗血清的有点：抗血清的有点：来源广，制备容易来源广，制备容易抗血清的缺点：抗血清的缺点：特异性不高，容易发生交叉反应特异性不高，容易发生交叉反应产量有限产量有限免疫原弱的抗原很难产生抗体免疫原弱的抗原很难产生抗体
