1、临床分子诊断与个体化治疗xx暨南大学附属珠海/珠海市人民医院1谢谢观赏2019-6-29分子诊断o 狭义分子诊断：狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断，包括肿瘤分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断等。o 广义分子诊断：广义分子诊断：指应用分子生物学方法，对受检者体内各类生物分子（包括DNA、RNA、蛋白质等）进行定性和定量分析，确定其结构或表达水平，从而为个性化预防、治疗提供依据的一种诊断技术，包括肿瘤分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断、单基因诊断、易感基因检测以及天赋基因检测等。 2谢谢观赏2019-6-29PCR国内回顾o
2、1990年:PCR技术在国内开始用于临床检测o 90年代中期:假阴性?/假阳性?,引发思考o 1996年:卫生部科研课题o 1998年3月20日:临床PCR实验室管理专家咨询会o 1998年4月16日:卫生部下发3谢谢观赏2019-6-29国内回顾2o 1999年4月29-30日:,针对临床开展PCR检验的问题,达成八点意见.o 1999年8月17-24日:(在北京卫生部临床检验中心举办.o 2002年1月14日:卫生部下发(卫医发200210号)4谢谢观赏2019-6-292010年:o 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发【2010】194号）o 医疗机构临床基因扩增检验室工
3、作导则（卫办医政发【2010】194号）5谢谢观赏2019-6-29o 截止到2014年1月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实验室共2670余家。采用所编写的培训教材和培训模式共举办了培训班280多期，培训实验室技术人员21000多人。涉及全国28个省、直辖市和自治区。6谢谢观赏2019-6-29目前国内临床分子诊断现状o 绝大部分用于病原体核酸检测o 较少部分用于遗传病的产前诊断o 个体化用药的分子诊断正在兴起7谢谢观赏2019-6-29一些常见的认识误区o 临床实验室=检验科o 基因（遗传携带、突变等）与病原体核酸检测完全不同o 临床PCR检验在病理科、药剂科或肿瘤科做，不
4、属于临床检验管理？o 必须达成一点共识：实验不管在哪做，都属于检验管理，必须有严格的质量控制。8谢谢观赏2019-6-29问题与思考o 问题：o 应用o 实验室分区o 质量管理：分析前，分析中，分析后o 人员：（医生、实验室技术人员）：均需“洗脑”严格的培训o 出现问题，即分析问题产生的原因，采取措施加以改进o 质理管理的习惯养成需要时间。9谢谢观赏2019-6-29几个策略比较o 家族病史研究与基因研究相比较o 说法不一，孰优孰劣？各有所长。o 肿瘤早期诊断带来的真正收益有没有我们所希望的那么大？10谢谢观赏2019-6-29WHO has developed three principle
5、s for cancer issues o Current prevention strategies could block up to one-third of all new cancero Improved early sreening could result in the detection of one-third of cancer at an early stage。o A comprehensive treatment could improve survial aquality another one-third of pattients with cancer国家自然科
6、学基金委医学部主任、国家肝癌科学中心主任王红阳院士，11谢谢观赏2019-6-29中国肿瘤治疗现状o 治愈率130mg/dl、HCV RNA600000U/ml,预期治愈率可能大于80%22谢谢观赏2019-6-29个性化检测的局限性o 一些疾病是由一个或多个基因突变引起o 基因检测方法确实能对这些疾病的患病风险、确诊和治疗起指导作用o 大多数疾病发生、发展及预后可能涉及更多的基因以及这些基因和环境因素相互作用o 仅通过基因检测盒基因表达谱的检测有很大局限性23谢谢观赏2019-6-29CLIA：分子检测有关的主要质控要求o对于每一个检测系统，实验室由此又控制程序的责任监控整个分析过程的准确性
7、和精密度。(42 CFR 493.1256（A）)控制程序必须是：o检出即时误差由检测系统故障、不利于环境和操作者能力导致(42 CFR 493.1256（C）（1）) o监控检测性能的准确性和精密度检测系统能和环境的改变以及操作者的能力都可能会影响检测性能。o实验室必须确定使用检测物质的数量、类型和频率，如果适用，由实验室验证或建立性能规范(42 CFR 493.1256（b）)o如果实验室引进了未经FDA认可或批准的检测系统包括自主研制的方法在报告病人检测据结果前，必须建立检测系统的性能规范，如果适用，包括下面的性能特征：o准确性，o精密度，o分析灵敏性，o分析特异性，包括干扰物质。检测系
8、统对检测结果的可报告区间，o参考区间（正常值），和o检测性能要求的其他性能特征。 (42 CFR 493.1253（b）（2）)o包括提取过程中的检测系统包括两种质控物质，其中之一可以检出提取过程的错误。 (42 CFR 493.1256（d）（3）（iv）)o每一扩增过程，包括两种质控材料，如果反应的抑制是假阴性结果的重要来源一个质控材料能够检出该抑制作用。 (42 CFR 493.1256（d ）（3）（v）)24谢谢观赏2019-6-29国际相关机构的PT计划oCAP 美国病理家协会oCDC 美国疾病预防控制中心（基因检测质量控制物计划GTQC）oQCMD 分子诊断的质量控制oEMQN
9、欧洲分子遗传实验质控网oENVID 欧洲重要病毒性疾病诊断网oEQAP 西班牙室间质评计划oEQUAL 欧盟质量控制一致行动（现在被称作分子诊断的质量控制QCMD ）oINQAT 意大利肿瘤标志物质量保证网oNEQAS 英国国家质量保证计划25谢谢观赏2019-6-29临床基因扩增实验室的质量控制（一）o 实验室各种常规工作的规章制度o 实验室技术人员的生物安全制度和保护措施o 防止实验室PCR交叉污染的实验（每月一次）o 实验室的清洁和消毒制度（每周4-5次）o 实验室的原始数据、报告单的归档和信息保密制度o 实验室专业人员的培训和考核制度o 实验室结果差错的记录和纠正措施o 计算机的系统维
10、护和管理制度26谢谢观赏2019-6-29临床基因扩增实验室的质量控制（二）o 样本接收和拒收标准：抗凝剂，采集时间/量，病史。o 接收标本必须有专用的登记表，并核对样本登记表中的所有信息，2人复核和签字。o 每批样本核酸提取的过程中加入质控标本以保证标本处理的过程中的正确性，同时建立用于不同技术平台的标准化的DNA/RNA浓度范围。o 定量PCR检测的操作过程包括4个不同浓度的对照物，以及阴性和阳性对照。o 样本的保存和存储（4和-80 冰箱）27谢谢观赏2019-6-29临床基因扩增实验室质量控制（三）o 室内质控标本的来源：包括参加国内和国际质控标本，细胞株和已知实验结果的样本。o 在每
11、批实验中和每个技术平台上均加入了质控样本，从样本抽提，基因扩增，杂交和测序已知跟踪到整个实验结果，每次实验结果分析后有专门的质控报告。o 实验室的技术人员每一个月，在每一个技术平台上都有一次盲样样本的质控实验，并以此评价技术人员的实验技能。28谢谢观赏2019-6-29分析的有效性p准确性o与参考方法比较o设定CUT-OFF值的方法p精密度/再现性o重复性：利用分子检测方法和同一个仪器对单个样本进行重复性研究。o再现性：再现性研究评估天与天、操作与操作间的精密度、如果使用多个仪器，要评估仪器与仪器之间的再现性；如果在多个实验室开展检测，也要评估不同实验室间的再现性。O靠近临床cut-point
12、和整个分析检测区间内的性能p分析的线性、回收率和高剂量钩子效应p检出限值和定量限值（在高和低的范围内）p分析特异性（交叉反应，干扰）p基质效应p影响分析结果的分析前因素p分析输出（读数区间或阴阳性） 29谢谢观赏2019-6-29临床有效性和临床有用性o临床有效性：检测特性（敏感性、特异性、预测值和拟然比）o临床有用性：利用检测结果可以获得有效治疗或其他具体的临床获益l筛选有症状个体的检测：基因LRRK2-G2019S突变帕金森症。l用于诊断和监控的检测：Heptimax-由Quest Diagnostics研制的实验室自制检测。该检测用于确认活动性丙肝病毒（HCV）感染、监控HCV治疗反应和
13、确认感染的消退。l确定预后和指导治疗的检测：OncotypeDX 利用实时荧光定量PCR检测乳腺癌肿瘤组织样本中21个基因的表达水平。l调整用药剂量的检测：指导华法林剂量的基因检测-基因CYP2C9（编码细胞色素P4502c9）和VKORC1（编码维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1）的多态性。30谢谢观赏2019-6-29o 病理说明：1.包括“尸体病理学诊断”、“细胞病理学检查与诊断”、“组织病理学检查与诊断”、“分子病理学技术与诊断”、“特染和免疫组织化学染色与诊断”、“电子显微镜技术与诊断”和“其他”项目七个部分，共计53项。o 检验说明：1.包括“临床血液学检验”、“临床体液检验”、
14、“临床化学检验”、“临床免疫学检验”、“临床微生物与寄生虫学检验”和“临床分子生物学检验”项目六个部分，共计1104项。2.组织器官移植所需的各项检验（如HLA检查等）列入“临床血液学检验”类的“血型、输血及人类组织相关性抗原检验”类中。3.”实验室诊断”中的项目不含静脉采血，需单独收费，但微量采血管（指尖采血、耳垂采血）包含在各检验项目中，不得单独收费。31谢谢观赏2019-6-29（四）分子病理学技术与诊断oBDAA0001 组织部/细胞原位杂交检查诊断 石蜡包埋组织，新鲜冷冻组织，细胞涂片，组织切片机切片，进行二甲苯脱蜡，系列乙醇水化，微波炉、高压锅及蛋白酶处理，标记探针杂交反应，洗涤，
15、酶或亲和物结合反应，显色，判读结果，含上述过程中所产生的废液、废物的处理。oBDAB0001 组织部/细胞荧光原位杂交检查诊断 荧光素标记探针杂交反应（一种探针）。oBDAB0002 组织部/细胞多色荧光原位杂交检查诊断 荧光素标记探针杂交反应（二种或以上探针）.oBDAB0003 组织部/细胞荧光原位杂交技术计量分析诊断 荧光素标记探针杂交反应（二种或以上探针），图像定量分析。oBDAC0001 组织部/细胞原位脱氧核糖核酸（DNA）多聚酶链式反应检查诊断 原位PCR反应，亲和物结合，显色，复染，观察，诊断。oBDAD0001 组织部/细胞原位核糖核酸（RNA）多聚酶链式反应检查诊断 原位逆
16、转录PCR反应，亲和物结合，显色，复染，观察，诊断。oBDAE0001 组织部/细胞荧光定量脱氧核糖核酸（DNA）多聚酶链式反应检查诊断 甲醛固定组织，石蜡包埋组织，新鲜或冷冻组织，离心收集细胞；组织粉萃机匀浆化，组织裂解，经反复离心及相应化学试剂去除蛋白，回收DNA，于荧光PCR仪进行荧光素PCR反应，分析结果，诊断。oBDAF0001 组织部/细胞荧光定量核糖核酸（RNA）多聚酶链式反应检查诊断 回收RNA，于于荧光PCR仪进行荧光素逆转录-PCR反应，分析结果，诊断。oBDAG0001 肿瘤组织脱氧核糖核酸（DNA）测序 PCR反应产物琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，产物纯化，测序反应，于D
17、NA测序仪分析，观察结果，诊断。甲醛固定组织，石蜡包埋组织，新鲜或冷冻组织，血液或体液的处理，DNA提取，PCR反应及最后的测序反应纯化。32谢谢观赏2019-6-29临床分子生物学及细胞遗传学检验uCLAY8000 HIV-核糖核酸扩增定量检测uCLAZ8000 HIV-核糖核酸非扩增定性检测uCLBA8000分枝杆菌菌种鉴定uCLBB8000结核/非结核分枝杆菌核酸检测uCLBC8000巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测uCLBD8000巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测uCLBE8000多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测uCLBF8000多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测uCLBG8000E
18、B病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测uCLBH8000EB病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测uCLBJ8000细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测uCLBK8000细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定量检测uCLBL8000腺病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测uCLBM8000腺病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测uCLBN8000淋球菌脱氧核糖核酸扩增检测uCLBP8000沙眼衣原体脱氧核糖核酸扩增检测uCLBS8000人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸扩增检测uCLBT8000人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测uCLBU8000人乳头瘤病毒基因分型检测uCLBV8000流感病毒核糖核酸检测uCLAA8000病原体脱氧核糖核酸扩增定
19、性检测uCLAB8000病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测uCLAC8000病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测uCLAD8000病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测uCLAE8000病原体核糖核酸扩增定性检测uCLAF8000病原体核糖核酸扩增定量检测uCLAG8000病原体核糖核酸非扩增定性检测uCLAH8000病原体核糖核酸非扩增定性检测uCLAJ8000乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测uCLAK8000乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测uCLAL8000乙型肝炎病毒基因分型检测uCLAM8000乙型肝炎病毒C区变异检测uCLAN8000乙型肝炎病毒基因变异检测uCLAP8000丙型肝炎病毒核
20、糖核酸扩增定性检测uCLAQ8000丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测uCLAR8000丙型肝炎病毒基因分型检测uCLAS8000丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测uCLAT8000丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测uCLAV8000戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测uCLAW8000庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测uCLAX8000 HIV-核糖核酸扩增定性检测33谢谢观赏2019-6-29疾病相关分子生物学及细胞遗传检验CLDA8000 染色体核型分析染色体核型分析 包括外周血染色体等；包括外周血染色体等；标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理，经培养、收获、制片、染色等步骤，分析染色体核型，审核结
21、果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。CLDB8000 脆性X染色体核型分析染色体核型分析。CLDD8000 姊妹染色体核型分析染色体核型分析 CLDF8000 肝豆状核变性基因分析CLDG8000 血友病基因分析分析。CLDH8000 脆性X综合基因分析分析 CLDJ8000 Y染色体性别基因分析CLDK8000 脱氧核糖核酸倍体分析CLDL1000 血细胞荧光原位杂交分析 包括21、13和X、Y等染色体。CLDM4000 未经处理的羊水细胞荧光原位杂交分析；CLDN 8000 染色体荧光原位杂交分析染色体荧光原位杂交分析CLDP8000 羊水细胞染色体
22、分析染色体分析 CLDQ8000 绒毛组织染色体分析CLDR8000 染色体分析CLDS8000 白血病融合基因检测CLDT8000 单基因遗传病基因突变检查 可检测线粒体基因、a地中海贫血基因、B地中海贫血基因、丙酮酸尿症基因等。标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。CLDU8000 遗传性耳聋基因检测 可检测GJB基因、SLC26A4基因、GJB3基因、线粒体DNA
23、12SrRNA基因等。标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。34谢谢观赏2019-6-29CLFA8000 乙型肝炎耐药基因检测乙型肝炎耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发
24、放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。CLFB8000 结核分支杆菌耐药基因检测结核分支杆菌耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。CLFC8000 万古霉素耐药基因检测万古霉素耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等
25、，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。CLFD8000 耐甲氧西林葡萄球菌耐药基因检测耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。用药指导的分子生物学检验CLFE8000 化学药物用药指导的基因检测化学药物用药指导的基因检测 可检测CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4基因等。本
26、采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。CLFF8000 病原体用药指导的基因检测病原体用药指导的基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果。CLFG6000 基因表达水平对肿瘤预后的判断基因表达水平对肿瘤预后的判断 标本类型：组织；芯片
27、上作为判断标准的全部基因作为一次检测。CLFH6000 基因表达水平对肿瘤药物敏感性的判断基因表达水平对肿瘤药物敏感性的判断 标本类型：组织；用芯片扫描仪进行检测。CLFJ8000肿瘤细胞化疗药物敏感试验肿瘤细胞化疗药物敏感试验 标本类型：血液、骨髓、分离淋巴细胞；制备肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度，接种96孔板，分别加抗癌药物，设置空白对照组，孵育、培养，离心，去上清液，加试剂震荡，用酶标仪测吸光度。CLFK9000 联合药物敏感试验联合药物敏感试验 样本类型：分离菌株；制备菌悬液，加入包括不同浓度药物定量反应液，孵育，人工判读细菌生长结果。35谢谢观赏2019-6-29o 其他 CLZA800
28、0 载脂蛋白E基因分型 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组DNA， 与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。 36谢谢观赏2019-6-29技术平台o PCR技术o 测序技术o 基因芯片技术37谢谢观赏2019-6-29疾病诊断与个体化医疗1o 常见肿瘤的分子诊断与个体化医疗（徐剑锋）o 染色体微缺失、微重复综合征的分子诊断（邬玲仟）o 肝豆核变性的分子诊断与个体化医疗（崔天盆）o 线粒体病的分子诊断与个体化医疗（郑红云）o 糖尿病的分子诊断与个体化医疗（包安裕）38谢谢观赏2019-6-29疾病诊断与个体化医疗2o 心血管疾病的分子诊断与个体化医疗（吕永楠）o 脑胶质瘤的分子诊断与个体化医疗（童永清）o 血液肿瘤的分子诊断与个体化医疗（吴薇）o 病毒性肝炎的分子诊断与个体化医疗（汪明）39谢谢观赏2019-6-2940谢谢观赏2019-6-29Thank you for your attention 41谢谢观赏2019-6-29
