1、1 免疫学检测技术免疫学检测技术.2第一节第一节 体外抗原抗体结合反体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素应的特点及影响因素3一一. . 体外抗原抗体反应的特征体外抗原抗体反应的特征 高度特异性：高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。点结构互补。 表面化学基团之间的可逆性结合表面化学基团之间的可逆性结合适宜的抗原抗体浓度和比例适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应的两个阶段抗原抗体反应的两个阶段4高度专一性的结合高度专一性的结合5可逆性结合可逆性结合Equivalence Lattice formation6抗原抗体比例对反应现象抗原抗体比例对反应现象的影响的
2、影响7抗原抗原抗体反应的抗体反应的影响因素影响因素电解质：可促进抗原与抗体的结合。电解质：可促进抗原与抗体的结合。 常用生理盐水。常用生理盐水。温度温度：最适温度为：最适温度为37。酸碱度酸碱度：最适：最适p pH =6-8。8第二节第二节 检测抗原或抗体的检测抗原或抗体的体外试验体外试验9（一）凝集反应（一）凝集反应 颗粒性抗原（颗粒性抗原（RBCRBC、细菌等）与相应抗体、细菌等）与相应抗体 结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1 1直接凝集试验直接凝集试验玻片凝集试验：用于玻片凝集试验：用于定性测抗原定性测抗原。如。如ABOABO血型鉴定，血型鉴定，细
3、菌的鉴定、分型等。细菌的鉴定、分型等。试管凝集试验：用于试管凝集试验：用于定量测抗体定量测抗体，如肥达氏反应。如肥达氏反应。 2 2间接凝集试验间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。如类风湿因子的测定等。1011（二）二）沉淀反应沉淀反应 可溶性抗原（可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与血清蛋白、组织浸液等）与 相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。 因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故 又称为又称为琼脂扩散试验或免疫扩散琼脂扩散试验或免疫扩散。 12琼脂凝胶琼脂凝胶131单向免疫扩散单向免疫扩散 用于用于定量测抗原定量测
4、抗原。 如检测血清免疫球蛋白、如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。等含量。 142 2双向免疫扩散双向免疫扩散 主要用于主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两定性检测抗原或抗体，抗原组成及两 种抗原相关性分析种抗原相关性分析153 3免疫电泳免疫电泳 其方法是其方法是先电泳、后扩散。主要用于先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析抗原成分的分析，亦可，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断 16（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术 =抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的
5、主要特点：标记免疫技术的主要特点：高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术 + 标记技术标记技术17常用的标记物常用的标记物181)免疫酶测定法免疫酶测定法 （Enzyme Immunoassay, EIAEIA）p利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法或抗体的方法p特点：利用抗原特点：利用抗原- -抗体反应的高度特异性，抗体反应的高度特异性，以及酶催化底物反应的生物放大作用以及酶催化底物反应的生物放大作用, , 最后用酶标仪测定光密度值（最后用酶标仪测定光密度值（ODOD），评），评定抗原定抗原- -抗体的含量。抗体的含量。19常用酶及其底
6、物常用酶及其底物辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP） 20分类21双抗体夹心法双抗体夹心法在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等等 22特点：特点：v非竞争结合反应非竞争结合反应v常用于抗原的检测常用于抗原的检测v适用于分子中具有至少两个抗原决定簇适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测的检测v所用两种抗体分别针对同一个抗原分子所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原
7、决定簇的不同抗原决定簇 23间接法间接法ELISAELISA乙肝标志物中乙肝标志物中抗抗HBs的检测的检测常采用本法常采用本法 242 )免疫荧光技术免疫荧光技术 (Immunofluorescence Technique) 25常用荧光素常用荧光素 异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC），）， 显黄绿色。显黄绿色。 藻红蛋白（藻红蛋白（PE），显红色。），显红色。用途：细胞表面用途：细胞表面CD分子分子 抗核抗体抗核抗体 262728293 )放射免疫测定法（放射免疫测定法（RIA）p敏感度可达敏感度可达pgpg水平，水平， 其标记物为其标记物为125125I I、131131I I等。
8、等。p常用于常用于微量物质的检测微量物质的检测，如激素、，如激素、IgEIgE等。等。 304 )发光免疫分析发光免疫分析 (luminescence immunoassay LIA)u将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。免疫分析技术。u优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。高灵敏度。 31p化学发光免疫测定化学发光免疫测定吖啶酯、鲁米诺吖啶酯、鲁米诺p生物发光免疫测定生物发光免疫测定萤火虫、发光水母萤火虫、发光水母p化学发光酶免疫测定化
9、学发光酶免疫测定辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）p电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定325 )免疫胶体金技术免疫胶体金技术336 )免疫印迹法免疫印迹法（Western blottingWestern blotting） 该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。再用酶免疫、放射免疫技术测定。 常用于常用于检测多种蛋白质检测多种蛋白质3435364.蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列又
10、称蛋白质微阵列是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA蛋白蛋白质、质、RNA蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。等。37原理：原理：是将各种是将各种蛋白质蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相
11、匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。达数量。38第三节第三节 免疫细胞功能的检测免疫细胞功能的检测 3940免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离41( (一一) )外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和包括淋巴细胞和单核细胞
12、（单核细胞（monocyte）。）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。 42细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同43不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 44
13、用用1.0770.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离 45密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)离心离心46（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析免疫吸附分离法免疫吸附分离法 免疫磁珠法免疫磁珠法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法（(Fluorescence Activated Cell Sorting)，FACS ）抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子四聚体技术分析分子四聚体技术分析CTLCTL 472.免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分离离4849免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程503.荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪
14、分离法 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry, FCM) 51全自动细胞分选系统全自动细胞分选系统52流式细胞分析仪流式细胞分析仪53流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构p待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。入样品管，吸入流动室。p流动室充满流动室充满IsoFlow ，作用：约束样品在喷嘴中心，防止，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。形成细胞液柱。p液柱与激光
15、束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。p荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。544.4.抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子分子四聚体四聚体 是一种是一种药品药品的名字，可应用于免疫学研究和检测、的名字，可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面55抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子四聚体分子四聚体技术分析技术分析CTLCTL56二二 细胞免疫功能检测细胞免疫功能检测uT细胞功能测定uB细胞功能测定.57（1 1）T T淋巴细胞增殖试验淋
16、巴细胞增殖试验原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松581 1）形态学检查法）形态学检查法%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率592 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。放射性核素污染问题。均值对照孔A均值试验孔A570nm570nmSI 603H-TdR或或1
17、25I-UdR掺入法掺入法613）MTT比色法比色法62(2)迟发型超敏反应检测632.B细胞功能测定细胞功能测定单扩单扩 ELISA 速率比浊法测定各类速率比浊法测定各类免疫球蛋白含量免疫球蛋白含量抗体形成细胞测定抗体形成细胞测定64（2 2）溶血空斑试验）溶血空斑试验原理：原理：65临床应用与评价临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。生抗体的能力。 66 B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶
18、联免疫斑点法原理：原理：67应用与方法学评价：应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。68ELISPOT技术简介技术简介 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验( Enzyme linked ( Enzyme linked immunospotimmunospot assay) assay) 80 80
19、 年代，国外的科研工作者根据年代，国外的科研工作者根据 ELISA ELISA 技术的基本原理，技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK CK 分泌细胞的固相分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（酶联免疫斑点技术（ELISPOTELISPOT）。因其具有较高的特异性和）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。病发病机制具有重要意义。 69ELISPOT的基本原理的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子
20、被特异单克隆抗因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF 孔孔板出现板出现“紫色紫色”的斑点表明细胞产的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过生了细胞因子，通过 酶联斑点分析酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。系统对斑点分析后得出结果。 70p稳定、特异，且抗原用量少p可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测p可检测
21、组织切片中分泌抗体的单个细胞ELISPOT检测抗体分泌检测抗体分泌71ELISPOT分析系统分析系统酶联斑点读板仪酶联斑点读板仪723.3.细胞毒试验细胞毒试验原理：原理：靶细胞抗原靶细胞抗原T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTL靶细胞靶细胞73 淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）+ +含含5151Cr Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 5151Cr Cr 释放释放 测定测定射线射线意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 （1） 5151CrCr释放法释放法74图图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图细胞细胞毒试验示意图7
22、5（2）乳酸脱氢酶释放法7677（3）细胞染色法7879(4) 凋亡细胞检测法凋亡细胞检测法生理性凋亡生理性凋亡病理性凋亡病理性凋亡非遗传控制的的意外的细胞非遗传控制的的意外的细胞坏死（坏死（accidental cell death）80 细胞受到急性强力伤害时，细胞受到急性强力伤害时，立即出现的早期反应。立即出现的早期反应。周围炎症周围炎症多细胞有机体为调控机体发育、多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。因控制的细胞主动性死亡过程。(programmed cell death, PCD). 从严格的词学意义上来说，从严格的词学意义上
23、来说，PCD与凋亡是有很大区别的与凋亡是有很大区别的81细胞坏死细胞坏死细胞凋亡细胞凋亡82细胞凋亡检测方细胞凋亡检测方形态学方法形态学方法电泳法电泳法原位缺口末端标记法原位缺口末端标记法流式细胞术测定法流式细胞术测定法83形态学方法形态学方法细胞坏死细胞坏死细胞凋亡细胞凋亡8485 86p细胞凋亡时，细胞凋亡时，Annexin V （一种分子量在（一种分子量在35-36kD的钙离的钙离子依赖性磷脂结合子依赖性磷脂结合蛋白蛋白）能与细胞凋亡过程翻转到膜外的）能与细胞凋亡过程翻转到膜外的磷磷脂酰丝氨酸脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。以标记高亲和力特异性结合。以标记FITC的的Annexin V作为
24、探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。发生。PI(Propidium iodide)是一种核酸染料，它不能透过完整的是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过而使能够透过而使细胞核染成红色。将细胞核染成红色。将Annexin V 与与PI匹配使用，可以将凋亡匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。87 散点图散点图 密度图密度图二维等高图二维等高图直方图直方图884.吞噬功能测定吞噬功能测定（1）四唑氮蓝还原试验（）四唑氮蓝还原试验（NBT试验）试验） 主要检测了解中性粒细胞的胞内杀菌能力。主要检测了解中性粒细胞的胞内杀菌能力。正常正常NBT阳性细胞在阳性细胞在5%10%，免疫缺陷，免疫缺陷时其值下降，如慢性肉芽肿常时其值下降，如慢性肉芽肿常5%. 89（2）巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 905.细胞因子检测生物活性检测法生物活性检测法免疫学检测法：免疫学检测法：ELISA ELISAPOT 蛋白芯片蛋白芯片分子生物学检测法：分子生物学检测法：PCR91 谢 谢9293
