1、动物细胞与组织动物细胞与组织培养技术培养技术第一节第一节 概述概述第二节第二节 动物细胞、组织培养的基本方法动物细胞、组织培养的基本方法 第三节第三节 培养细胞的检测和特性鉴定培养细胞的检测和特性鉴定 第四节第四节 动物细胞体外培养举例动物细胞体外培养举例 第五节第五节 细胞同步化细胞同步化v 一、动物细胞与组织培养的基本概念一、动物细胞与组织培养的基本概念 v 二、动物细胞体外培养的特点二、动物细胞体外培养的特点 v 三、发展历史三、发展历史 v 四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件v 五、体外培养细胞生物学特性五、体外培养细胞生物学特性 第一节第一节 概概 述述 一
2、、基本概念一、基本概念1动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture)：用：用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。存、生长并维持结构和功能的一门技术。l 动物细胞工程的基础。动物细胞工程的基础。v分类：细胞培养 Cell Culture组织培养 Tissue Culture器官培养 Organ Culture2 2、原代培养、原代培养(Primary Culture)(Primar
3、y Culture)：初代培养，直接从初代培养，直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。机体取出的细胞或组织进行培养的过程。3 3继代培养（继代培养（Secondary CultureSecondary Culture ）：传代培养，：传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.4 4、细胞系细胞系(cell line)(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯化，由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。的细胞群体，一般为有限细胞系。
4、5 5、细胞株细胞株(cell strain)(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方法：细胞系经过克隆或其他方法获得、由获得、由单细胞形成单细胞形成的的单一类型单一类型的细胞群体的细胞群体。有限细胞系有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的不能连续培养的细胞系细胞系。无限细胞系无限细胞系(finited cell line)：能够连续培养的细能够连续培养的细胞系，大多已异倍化，异倍体核型，或成为恶胞系，大多已异倍化，异倍体核型，或成为恶性细胞。性细胞。限定性细胞系限定性细胞系：具有特定实验指标的细胞系。：具有特定实验指标的细胞系。限定性细胞株限定性细胞株
5、：具有特定实验指标的细胞株。：具有特定实验指标的细胞株。二、动物细胞体外培养特点二、动物细胞体外培养特点v动物细胞动物细胞生长缓慢生长缓慢，培养时间长。，培养时间长。v更易受微生物污染更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体），（包括细菌、真菌、病毒、支原体），需要需要防治污染问题防治污染问题。v对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括pHpH值、温值、温度、剪切力度、剪切力v对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。乳糖外，一般还需要血清。v原代细胞一般繁殖原
6、代细胞一般繁殖5050代左右退化死亡。代左右退化死亡。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。形态多种多样：形态多种多样：圆形、椭圆形、圆形、椭圆形、正方形、柱形、正方形、柱形、扁平形、梭形、扁平形、梭形、星形和多边形等星形和多边形等平滑肌细胞平滑肌细胞神经元细胞神经元细胞血红细胞血红细胞三、动物细胞培养的发展历史三、动物细胞培养的发展历史v1885年，年，Wilhelm Roux（德国）最先尝试离体（德国）最先尝试离体培养鸡胚神经板，存活了数月。建立培养鸡胚神经板，存活了数月。建立“组织培养组织培养”概念。概念。v1907年，美
7、国胚胎学家年，美国胚胎学家Ross Harrison 培养蛙胚培养蛙胚神经细胞长出了轴突，神经细胞长出了轴突，存活了几周存活了几周（盖玻片覆盖盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法凹窝玻璃悬滴培养法）；创立了体外观察和研究动创立了体外观察和研究动物组织的方法。物组织的方法。公认为动物组织培养的公认为动物组织培养的开山鼻祖开山鼻祖。v法美学者法美学者Alexis Carrel1912年年 将外科无菌概念和无菌操作技术引入到组织将外科无菌概念和无菌操作技术引入到组织培养中；培养中；采用鸡胚匀浆采用鸡胚匀浆组织液组织液与血浆混合使用，培养了各与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块；种动物组织的组织块；采用
8、更新培养基和分离组织的传代措施，使鸡胚心采用更新培养基和分离组织的传代措施，使鸡胚心肌细胞维持生存肌细胞维持生存34年，传代年，传代3400次，证明离体的动次，证明离体的动物组织在培养条件下有可能无限地生长和繁殖。物组织在培养条件下有可能无限地生长和繁殖。1923年，他设计了年，他设计了卡氏培养瓶，卡氏培养瓶，首先首先鸡胚心肌组织鸡胚心肌组织取得成功以后，已使多种动物组织培养获得成功取得成功以后，已使多种动物组织培养获得成功。v1913年，年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。建立了单盖片悬滴培养法。v1925年，年，Maximow采用双盖片法。采用双盖片法。v1934年，年，Gey
9、和和Lewis 用旋转管培养了许多用旋转管培养了许多细胞系细胞系。相继，。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。人们设计了多种类型的培养瓶。v1940年，年，Earle首创首创单个细胞克隆单个细胞克隆培养的方法，建立了可培养的方法，建立了可无无限传代限传代的的C3H小鼠小鼠结缔组织结缔组织细胞系。细胞系。v1948年，年，Sanford创立了创立了单层细胞培养单层细胞培养法，建立了各种细胞法，建立了各种细胞系。他还创建了系。他还创建了单个细胞培养单个细胞培养方法。方法。v1951年，年，Dulbecco等采用等采用胰蛋白酶胰蛋白酶消化处理和应用液体培养消化处理和应用液体培养基的方法，获得了基的方法
10、，获得了单层细胞培养单层细胞培养。单层培养法的出现，极大。单层培养法的出现，极大地推动细胞培养的发展，利用该技术建立了很多细胞系。地推动细胞培养的发展，利用该技术建立了很多细胞系。单单层培养层培养成了细胞培养成了细胞培养普遍普遍应用的技术。应用的技术。v1951年，年，Pomerat设计了细胞培养设计了细胞培养灌流小室灌流小室技术，使细胞生技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究。谢等研究。v1951年，年，Earle发明了体外培养动物细胞的发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基人工合成培养基。v1952年，年，
11、Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌Hela细细胞系胞系。v1960年，年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合培养物中等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。发现有自发的融合细胞。v1962年，年，Okada又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。失，恶性特征受到抑制。培养器皿培养器皿：从：从载玻片载玻片发展到发展到培养瓶、培养皿、培养板培养瓶、培养皿、培养板。培养液培养液：从：从
12、天然动物血浆、胚胎渗出液天然动物血浆、胚胎渗出液发展到发展到人工合成人工合成培养基培养基(或称限定培养基或称限定培养基)；促细胞生长物质从；促细胞生长物质从胎汁胎汁改改用用动物血清动物血清、近几年发展起来的、近几年发展起来的无血清无血清培养系统。培养系统。培养技术培养技术：从实验室：从实验室小规模小规模培养发展到微载体、微囊、培养发展到微载体、微囊、中空纤维式、悬浮式等中空纤维式、悬浮式等大型生物反应器大型生物反应器培养，促进了培养，促进了细胞培养技术的应用与发展。细胞培养技术的应用与发展。四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件1.无污染环境无污染环境 培养环境的培养环境
13、的无毒和无菌无毒和无菌是保证培养细胞生存是保证培养细胞生存的首要条件。的首要条件。细胞培养室：福尔马林高锰酸钾或过氧乙细胞培养室：福尔马林高锰酸钾或过氧乙酸酸蒸气熏蒸蒸气熏蒸进行消毒；进行消毒；培养器皿及用品：培养器皿及用品：高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌进行灭菌；进行灭菌；培养液：培养液：0.22 0.22 m m微孔滤膜微孔滤膜过滤过滤除菌。除菌。滤 器2 2、温度温度v恒定适宜的温度。恒定适宜的温度。v培养细胞对低温的耐受力高于高温，温度不超过培养细胞对低温的耐受力高于高温，温度不超过3939时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；v人体细胞培养的标准温度为人体细胞培养的标准温度为
14、36.536.50.50.5，偏离此范围，偏离此范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。一般鱼类细胞最适细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。一般鱼类细胞最适温度不超过温度不超过3030，鸟类细胞要求温度为，鸟类细胞要求温度为38.538.5；低温使细胞代谢速率降低，低温使细胞代谢速率降低，20-2520-25能缓慢生长繁殖。能缓慢生长繁殖。44下能维持下能维持相当长时间，无明显损害相当长时间，无明显损害;人体细胞在人体细胞在39-40 139-40 1小时，受到一定损伤，但仍可能恢复；小时，受到一定损伤，但仍可能恢复；40-41140-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数可能恢复；小时，
15、细胞会普遍受到损伤，仅小半数可能恢复；41-42141-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；有恢复可能；当温度在当温度在4343以上以上1 1小时，细胞全部死亡。小时，细胞全部死亡。3 3、pHpH：最适：最适7.27.27.47.4 v大多数细胞的适宜大多数细胞的适宜pHpH为为7.2-7.47.2-7.4，偏离该范围对细胞培养将产生有害的影响；，偏离该范围对细胞培养将产生有害的影响；每种细胞都有其最适每种细胞都有其最适pHpH值；值；v细胞耐酸性比耐碱性强，偏酸环境中更利于细胞生长；细胞耐酸性比耐碱性强，偏酸
16、环境中更利于细胞生长；v有些细胞也喜欢偏碱环境中生长有些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合如成纤维细胞最适合pHpH是是7.4-7.67.4-7.6；vpHpH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时生长会受到影响，甚至死亡。时生长会受到影响，甚至死亡。v常用常用磷酸磷酸缓冲剂，适用于缓冲剂，适用于封闭式培养；封闭式培养；vHanksHanks平衡盐溶液中含有高浓度的平衡盐溶液中含有高浓度的NaHCONaHCO3 3，打开培养瓶时，打开培养瓶时，COCO2 2迅速逸出迅速逸出而导致培养液而导致培养液pHpH变碱，酚红指示剂变红；变碱，酚红指示剂变红；vHEPES HEPES 对细胞无
17、毒性，能防止对细胞无毒性，能防止pHpH迅速变动，其最大优点是在进行活细胞观迅速变动，其最大优点是在进行活细胞观察时能维持较恒定的察时能维持较恒定的pHpH。4 4、气体气体v气体：需要气体：需要O O2 2、COCO2 2 （95%95%空气、空气、5%CO5%CO2 2）O O2 2 ：参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增：参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。v低低于大气压的氧压适于于大气压的氧压适于细胞株细胞株生长；生长；v高高氧压（高达氧压（高达95%95%）适于）适于器官培养器官培养，但对于胚胎组，但对于胚胎
18、组织及细胞株单层的生长会产生致死性的伤害织及细胞株单层的生长会产生致死性的伤害COCO2 2 ：既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁：既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，主要作用在于维持培养基的殖所需成分，主要作用在于维持培养基的pHpH值值v在细胞代谢中，在细胞代谢中，COCO2 2是三羧酸循环的最终产物之是三羧酸循环的最终产物之一，被培养基中的阳离子所固定，或与丙酮酸一，被培养基中的阳离子所固定，或与丙酮酸结合生产草酸，这些反应均可促进三羧酸循环结合生产草酸，这些反应均可促进三羧酸循环v培养系统中培养系统中COCO2 2张力的维持，能使细胞培养物存张力的维持，能使细胞培养物存活期延长，
19、提高细胞培养技术活期延长，提高细胞培养技术v二氧化碳培养箱，定时补充二氧化碳培养箱，定时补充COCO2 2 ，维持一定的，维持一定的COCO2 2张力张力 5 5、营、营 养养要求高，需要：要求高，需要：碳水化合物、碳水化合物、氨基酸、脂类氨基酸、脂类无机盐、维生素、辅酶无机盐、维生素、辅酶核酸、激素、生长因子核酸、激素、生长因子 v碳水化合物碳水化合物细胞培养的主要能量来源；细胞培养的主要能量来源；合成某些氨基酸的原料；经过乙酰辅酶合成某些氨基酸的原料；经过乙酰辅酶A(CoA)A(CoA)可合可合成脂肪；经过糖解磷酸通路能合成核酸；成脂肪；经过糖解磷酸通路能合成核酸；葡萄糖葡萄糖最重要、最常
20、用，最重要、最常用，4.5g/L4.5g/L高糖或高糖或1.0g/L 1.0g/L 低糖；低糖；果糖、甘露糖、磷酸葡萄糖及半乳糖等单糖也可作果糖、甘露糖、磷酸葡萄糖及半乳糖等单糖也可作为细胞培养的能源；为细胞培养的能源；双糖或多糖先分解为单糖也可用于细胞培养双糖或多糖先分解为单糖也可用于细胞培养。氨基酸与蛋白质氨基酸与蛋白质 绝大多数细胞培养物不能利用蛋白质，细胞本身所需要的蛋绝大多数细胞培养物不能利用蛋白质，细胞本身所需要的蛋白质是由摄取的氨基酸合成的；白质是由摄取的氨基酸合成的；1212种种必需氨基酸必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋
21、氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸。酸、酪氨酸、缬氨酸。所有细胞都需要所有细胞都需要谷氨酰胺谷氨酰胺，能促进各种氨基酸进入细胞，能促进各种氨基酸进入细胞膜；膜；氨基酸可作为细胞培养的能量来源；氨基酸可作为细胞培养的能量来源；培养基中常加入蛋白质和多肽，能促进细胞迅速生长。培养基中常加入蛋白质和多肽，能促进细胞迅速生长。维生素维生素细胞的生长繁殖需要多种细胞的生长繁殖需要多种B B族维生素，大多族维生素，大多数是与合成和代谢活动密切相关的各种辅酶数是与合成和代谢活动密切相关的各种辅酶、辅基；、辅基；必需维生素：肌醇、硫胺素、核黄
22、素、吡哆必需维生素：肌醇、硫胺素、核黄素、吡哆醇、泛酸、叶酸、烟碱酸、生物素、胆碱、醇、泛酸、叶酸、烟碱酸、生物素、胆碱、对氨基苯甲酸；对氨基苯甲酸；常用限定培养基中已成为固定组成成分。常用限定培养基中已成为固定组成成分。v细胞培养的辅助因素细胞培养的辅助因素非必需氨基酸：非必需氨基酸：虽然细胞能合成这些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、虽然细胞能合成这些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸，适量加入能促进细胞的生长，特别是当细胞接种量很小时；脯氨酸，适量加入能促进细胞的生长，特别是当细胞接种量很小时；其它维生素及辅酶其它维生素及辅酶 ：维生素：维生素A A对于纤毛圆柱上皮细胞的分化很重要对于纤毛圆柱上皮
23、细胞的分化很重要；如果用辅酶的形式代替；如果用辅酶的形式代替B B族维生素加入培养基中，细胞生长会更好，族维生素加入培养基中，细胞生长会更好，如辅酶如辅酶A A、腺嘌呤核黄素；腺嘌呤核黄素；核酸核酸：虽然细胞能利用简单的分子如甘氨酸、二氧化碳、甲酸钠等合：虽然细胞能利用简单的分子如甘氨酸、二氧化碳、甲酸钠等合成核酸，但它们会优先利用培养基中的核甘酸；成核酸，但它们会优先利用培养基中的核甘酸；激素激素：促进细胞的生长与增殖，影响细胞的生长与分化。细胞组织：促进细胞的生长与增殖，影响细胞的生长与分化。细胞组织培养技术也是研究激素作用的重要工具；培养技术也是研究激素作用的重要工具；血清：血清：可以提
24、供细胞生长所需的各种激素和生长因子，是维持细胞有可以提供细胞生长所需的各种激素和生长因子，是维持细胞有丝分裂不可缺少的物质。丝分裂不可缺少的物质。6.6.培养基培养基v天然培养基天然培养基动物体液、组织提取液：动物体液、组织提取液：血浆、血浆、血清血清、组织提取液组织提取液、鸡鸡胚汁胚汁等；等；优点：营养成分丰富，培养效果良好；优点：营养成分丰富，培养效果良好；缺点：成分复杂，来源受限，个体差异。缺点：成分复杂，来源受限，个体差异。v合成培养基合成培养基 平衡盐溶液；平衡盐溶液；限定培养基；限定培养基；无血清培养基。无血清培养基。v血清血清能提供细胞生存、生长和增生所必需的能提供细胞生存、生长
25、和增生所必需的激素和生长调节因子激素和生长调节因子，如，如胰岛素、肾上腺素、肾上腺皮质激素、类固醇激素、成纤维细胞胰岛素、肾上腺素、肾上腺皮质激素、类固醇激素、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板生长因子等；生长因子、表皮细胞生长因子、血小板生长因子等；能补充基础培养液中没有或量不足的能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分营养成分，如各种氨基酸、，如各种氨基酸、维生素、无机物、多肽、脂类、核酸衍生物等都是细胞生长所需维生素、无机物、多肽、脂类、核酸衍生物等都是细胞生长所需的基本营养物质；的基本营养物质；含有许多含有许多结合蛋白结合蛋白：对激素、维生素、脂类等具有：对激素、维生素、脂类
26、等具有稳定和调节作用稳定和调节作用；同时结合有毒性的金属离子和热原质，起到同时结合有毒性的金属离子和热原质，起到解毒作用解毒作用；含有含有蛋白酶抑制因子蛋白酶抑制因子：保护保护细胞免受环境中蛋白酶的损伤；细胞免受环境中蛋白酶的损伤；还含有一些供贴附型细胞在培养皿表面还含有一些供贴附型细胞在培养皿表面贴附和铺展贴附和铺展的的生长基质生长基质成份，成份，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白等；如纤粘连蛋白、层粘连蛋白等；种类：牛、人、马、兔、猪、羊血清，最常用的是胎牛血清与新生牛种类：牛、人、马、兔、猪、羊血清，最常用的是胎牛血清与新生牛血清；血清；血清的使用浓度一般为血清的使用浓度一般为5 52020，常用
27、浓度为，常用浓度为1010；使用前必须经过鉴定，只有无菌、无支原体、无内毒素、无溶血或低使用前必须经过鉴定，只有无菌、无支原体、无内毒素、无溶血或低溶血、蛋白质及必需营养素达到一定标准以上的血清才能使用。溶血、蛋白质及必需营养素达到一定标准以上的血清才能使用。水解乳蛋白水解乳蛋白和和胶原胶原另外两种较好的天然培养基成分；另外两种较好的天然培养基成分；水解乳蛋白：水解乳蛋白：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，呈淡黄色粉末状，富含氨基酸；物，呈淡黄色粉末状，富含氨基酸；胶原：胶原：从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长
28、的作用。性促使其附着生长的作用。v人工合成培养基人工合成培养基平衡盐溶液平衡盐溶液（Balanced salt solutionBalanced salt solution，BSSBSS）：）：维持细胞维持细胞短期成活短期成活的培养基的培养基v组成：无机盐、葡萄糖、水。组成：无机盐、葡萄糖、水。v作用：保持组织细胞生理状况所要求的渗透压与作用：保持组织细胞生理状况所要求的渗透压与pHpH，维持维持细胞短期成活；洗涤、分散、分离培养的组织细胞；配制细胞短期成活；洗涤、分散、分离培养的组织细胞；配制细胞消化液；用作某些合成培养基的基础液。细胞消化液；用作某些合成培养基的基础液。v种类：弱磷酸缓冲系
29、统有种类：弱磷酸缓冲系统有EarleEarle、HanksHanks、DulbeccoDulbecco、D-D-hankshanks等；强缓冲系统有等；强缓冲系统有Tris-buffered BSSTris-buffered BSS、HEPESHEPES、TRICINETRICINE、甘油磷酸钠。甘油磷酸钠。应用时根据实验目的选择合适的应用时根据实验目的选择合适的BSSBSS 限定培养基限定培养基(defined media)defined media)：满足细胞满足细胞长长期生长期生长的培养基的培养基于平衡盐溶液中加入各种必需代谢物与辅助成分，于平衡盐溶液中加入各种必需代谢物与辅助成分，所有
30、所有成分与含量明确成分与含量明确。现在已有品质均一的各种优。现在已有品质均一的各种优良培养基的商品出售；良培养基的商品出售；ParkerParker（NO.199NO.199）培养基：于培养基：于EarleEarle平衡盐溶液中平衡盐溶液中，根据，根据鸡胚细胞鸡胚细胞的营养要求添加组分研制而成的培的营养要求添加组分研制而成的培养基。这种培养基组成成分达养基。这种培养基组成成分达6161种物质，是当前应种物质，是当前应用最广泛的培养基之一。以此培养基为基础，已研用最广泛的培养基之一。以此培养基为基础，已研制出多种其他型号的培养基；制出多种其他型号的培养基；EagleEagle培养基培养基/基础培
31、养基基础培养基BEMBEM：Eagle Eagle根根据据L L及及HelaHela细胞系的营养需要研制出适合细胞系的营养需要研制出适合哺哺乳动物细胞培养乳动物细胞培养的培养液，其成分较简单；的培养液，其成分较简单；最低必需培养基最低必需培养基MEMMEM：EagleEagle根据根据人源细胞人源细胞的的培养要求研制而成，其特点是培养要求研制而成，其特点是成分简单成分简单，某，某些些氨基酸与维生素氨基酸与维生素的含量显著提高，已成为的含量显著提高，已成为最广泛应用的培养基；最广泛应用的培养基；HamHam培养基培养基：HamHam研制研制 适宜于适宜于中国仓鼠二倍体中国仓鼠二倍体细胞细胞克隆化
32、的培养基克隆化的培养基F F7 7，改进的改进的F F1010和和F F1212，其中其中F F1212培养液培养液在细胞的在细胞的无血清培养无血清培养中发挥了重要作用；中发挥了重要作用；RPMIRPMI培养基培养基：MooreMoore研制，其中研制，其中RPMI1640RPMI1640适合于适合于小鼠白血病小鼠白血病细胞的悬浮培养和单层培养，也可用于细胞的悬浮培养和单层培养，也可用于其他细胞的培养，被认为是培养其他细胞的培养，被认为是培养人癌细胞人癌细胞较适合的较适合的培养液。培养液。不同的细胞系有各自的最适培养基，根据试验不同的细胞系有各自的最适培养基，根据试验确定。确定。无血清培养基无
33、血清培养基(serum-free media)serum-free media)血清成分不够清楚，存在非限定性和血清成分不够清楚，存在非限定性和批间差异批间差异，使，使实验无法在一个控制的条件下进行；可能引起实验无法在一个控制的条件下进行；可能引起污染污染；给以后细胞产物的；给以后细胞产物的纯化纯化带来诸多不便；带来诸多不便；成本昂贵成本昂贵；无血清培养基无血清培养基：基础培养基、生长因子和激素、基：基础培养基、生长因子和激素、基质；质；常用的基础培养基：常用的基础培养基：RPMI1640RPMI1640、DMEMDMEM、HamFHamF1212等，等，最常用最常用1 1:1:1的的HamF
34、HamF1212和和DMEMDMEM的混合培养基。配制用水的混合培养基。配制用水的质量以及培养基新鲜程度至关重要，用的质量以及培养基新鲜程度至关重要，用HepesHepes校正校正溶液的溶液的pHpH值；值；常用常用生长因子与激素生长因子与激素：胰岛素、表皮生长因子、神：胰岛素、表皮生长因子、神经生长因子、生长激素、黄体化激素、促甲状腺释经生长因子、生长激素、黄体化激素、促甲状腺释放激素、前列腺素、维生素放激素、前列腺素、维生素C C、维生素维生素A A醇；醇；常用常用基质基质：纤粘素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶：纤粘素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶原、多聚赖氨酸；原、多聚赖氨酸；酶抑制剂酶抑制
35、剂：培养贴壁生长的细胞，需要胰酶消化传：培养贴壁生长的细胞，需要胰酶消化传代，酶抑制剂能终止酶的消化作用，保护细胞；代，酶抑制剂能终止酶的消化作用，保护细胞；结合蛋白和转运蛋白结合蛋白和转运蛋白：转铁蛋白和牛血清白蛋白。：转铁蛋白和牛血清白蛋白。增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤；增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤；微量元素微量元素：硒：硒从有到无从有到无：在含血清的培养液培养至生长旺盛以后，逐步降低：在含血清的培养液培养至生长旺盛以后，逐步降低，从，从10%10%减少到减少到5%5%，3%3%，1%1%，直至无血清；，直至无血清；处于处于对数生长中期对数生长中期、90%90%活细胞率
36、活细胞率、适应时以适应时以高接种率高接种率；并非所有细胞并非所有细胞都能在无血清培养基中生长，新的无血清培养基都能在无血清培养基中生长，新的无血清培养基的探索、新的可控制的生长因子及其性质研究仍是一个重要的的探索、新的可控制的生长因子及其性质研究仍是一个重要的课题课题 7.附着底物附着底物v玻璃玻璃v一次性塑料一次性塑料v微载体微载体v饲养细胞饲养细胞 原则上讲，凡对细胞无毒性的物质都可用作原则上讲，凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，但不同的细胞，对底物要求各异。底物，但不同的细胞，对底物要求各异。常用底物：常用底物：A.A.玻璃玻璃最常用的底物：具有透明、便于观察、易洗涤和能反复使最常用的底
37、物：具有透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点；用等优点；质地：中性玻璃；质地：中性玻璃；适于各种细胞附着生长；适于各种细胞附着生长；玻璃用强碱如玻璃用强碱如NaOHNaOH处理后，性质能受一定影响，需用酸中处理后，性质能受一定影响，需用酸中和后才可用；和后才可用；缺点：易破碎。缺点：易破碎。聚苯乙烯制品聚苯乙烯制品：适于正常细胞、无限细胞：适于正常细胞、无限细胞系和肿瘤细胞；系和肿瘤细胞；聚四氟乙烯聚四氟乙烯制品：透气性好，可制成制品：透气性好，可制成薄膜薄膜，剪成小块后能置入各种瓶皿中，适于，剪成小块后能置入各种瓶皿中，适于细细胞贴附生长胞贴附生长，便于取出、染色和做电镜切，便于取出、染
38、色和做电镜切片片。C.C.微载体微载体由由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺聚苯乙烯和聚丙烯酰胺以及带有不同以及带有不同基团基团的的葡萄糖葡萄糖交联而成的大分子制成的交联而成的大分子制成的小球体；小球体；优点优点：增大了单位体积内细胞的增大了单位体积内细胞的附着面积附着面积，有，有利于细胞的利于细胞的大量繁殖。大量繁殖。D.D.饲养细胞饲养细胞 (Feeder Cells)(Feeder Cells)制备：成纤维细胞或其它细胞长成单层后，制备：成纤维细胞或其它细胞长成单层后，大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活并保持代谢活动。尚存活并保持代谢活动。用途：作为底物，其
39、它细胞接种其上；饲养用途：作为底物，其它细胞接种其上；饲养细胞的代谢产物利于其它细胞生长，从而细胞的代谢产物利于其它细胞生长，从而被称为饲养细胞。被称为饲养细胞。用于培养特殊难培养细胞。用于培养特殊难培养细胞。（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型（二）培养细胞的生长特点（二）培养细胞的生长特点（三）（三）培养细胞的生长与增殖过程培养细胞的生长与增殖过程五、体外培养细胞生物学特性五、体外培养细胞生物学特性贴壁依赖型细胞贴壁依赖型细胞 非贴壁依赖型非贴壁依赖型成纤维细胞成纤维细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞（一）培养细胞的生长方式及类型（一）
40、培养细胞的生长方式及类型 于悬浮状态下于悬浮状态下即可生长即可生长 贴附于支持物表面贴附于支持物表面才能生长的细胞才能生长的细胞 1、贴壁依赖型细胞、贴壁依赖型细胞贴附贴附-大多数有机体大多数有机体细胞细胞在体内在体内生存生存和和生长发育生长发育的的基基本存在方式本存在方式v含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。基质结合。v细胞在活体内时，细胞在活体内时，形态各异形态各异，而体外培养状态下则，而体外培养状态下则在在形态形态上比较上比较单一单一而而失去失去其在体内其在体内原有特征原有特征。v 单层附壁培养：动物细胞培养中，大多细胞必须附
41、单层附壁培养：动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。v在体外按照培养细胞的在体外按照培养细胞的形态不同形态不同，主要可分为以下几类：，主要可分为以下几类：成成纤维型细胞、上皮型细胞纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞、游走型细胞、多形型细胞 （1 1）成纤维型细胞：）成纤维型细胞：本型细胞的形态本型细胞的形态类似体内类似体内生长的成纤维细胞；生长的成纤维细胞；形态：形态：长梭形长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出细胞核
42、位于中央，胞质向外伸出2-32-3个长短不同的突起，个长短不同的突起，中有中有卵圆形核卵圆形核.生长特点：生长特点：细胞一般并不紧靠相连；生长时呈放射状、漩涡状细胞一般并不紧靠相连；生长时呈放射状、漩涡状走向走向，细胞间间隙较大。，细胞间间隙较大。来源：来源：真正的成纤维细胞真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌心肌，平滑肌 由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织。的组织。如人胚肺细胞如人胚肺细胞人的成纤维细胞人的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞人骨髓间充质细人骨髓间充质细胞（胞（MSCMSC）大鼠血管平滑肌细胞大鼠血管平滑肌细胞成纤维细胞型成纤维细胞型（2 2）上皮型细胞）上皮
43、型细胞形态：形态：扁平状，不规则。扁平状，不规则。细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁圆形核，细胞彼此细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁圆形核，细胞彼此紧密相连紧密相连成单层细胞，呈现成单层细胞，呈现“铺路石状铺路石状”。生长特点生长特点:易相连易相连成片成片 相靠相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状铺石状生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少脱离细胞群脱离细胞群单独行动。单独行动。来源来源:内胚层和外胚层内胚层和外胚层。如皮肤、消化道、呼吸道、肺。如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮细胞等。泡、消化腺上皮细胞，血
44、管内皮细胞等。vHelaHela细胞细胞呈现为典型的上皮型细胞呈现为典型的上皮型细胞。单层扁平上皮细胞单层扁平上皮细胞人口腔皮样癌细胞人口腔皮样癌细胞人宫颈癌上皮细胞（人宫颈癌上皮细胞（HelaHela）成骨肉瘤细胞成骨肉瘤细胞(多角形多角形)上皮细胞型上皮细胞型奶牛肾脏上皮细胞奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型上皮细胞型)v上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能将体外培养的这些并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；细胞与体内同名的细胞完全等同；v用于描述
45、细胞的外形而并非说明细胞的起源用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源；v与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态有差取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态有差异；异；v来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能并不相同并不相同。（3 3）游走型细胞：）游走型细胞：不常见，具有不常见，具有类似巨噬细胞类似巨噬细胞样的特征；样的特征；在支持物上散在生长，一般在支持物上散在生长，一般不连成片不连成片。细胞质经常伸。细胞
46、质经常伸出伪足或突起，呈出伪足或突起，呈活跃活跃的的游走游走或变形运动，速度快且或变形运动，速度快且不规则；不规则；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒；较不稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条较不稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态；或成纤维细胞形态；如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。单 核 巨 噬 细 胞单核巨噬细胞（未刺激状态）单核巨噬
47、细胞（未刺激状态）游走型细胞游走型细胞单核巨噬细胞（活化剂刺激单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足后）：向四周伸展伪足（4 4）多形型细胞）多形型细胞 形态不规则形态不规则的细胞，不常见，一般分胞体的细胞，不常见，一般分胞体和胞突两部分；和胞突两部分；胞突细长形类似丝状伪足；胞突细长形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则；胞体略呈多角形，但较规则；如如神经组织细胞神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。如神经元、神经胶质细胞等。神经细胞（神经细胞（DAB显色）显色）多形型细胞多形型细胞神经细胞神经细胞大鼠大鼠 海马神经细胞海马神经细胞2 非贴附型细胞非贴附型细胞 v悬浮型细胞：细胞
48、在体外培养时悬浮型细胞：细胞在体外培养时不必贴壁不必贴壁，可在培养液中悬，可在培养液中悬浮生长；浮生长；v见于少数特殊的细胞，如血液见于少数特殊的细胞，如血液白细胞白细胞、淋巴组织细胞、杂交、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞瘤细胞转化转化细胞系、某些类型的细胞系、某些类型的癌细胞癌细胞及白血病细胞。胞体及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长；圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长；v形态特点：形态特点：胞体始终为球形；胞体始终为球形；v优点：优点：生存空间大，生存空间大，培养效率高培养效率高，利于大量生产，与培养基，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞；充分接触无需消化传代，
49、易于收获细胞；v缺点：不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞缺点：不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长；都能悬浮生长；v贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养。贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养。细胞形态学特征细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别仅是对培养物判断或识别的一种的一种参考参考性指标；性指标；实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型典型的形态（的形态（2种或更多形态）；种或更多形态）；影响细胞形态的因素很多：细胞来源、培养条影响细胞形态的因素很多：细胞来源、培养条件件如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助
50、如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为于更为特异的鉴定特异的鉴定方法。方法。n影响细胞形态学特征的因素影响细胞形态学特征的因素 血清成分、培养基成分、添加成分、培血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。养基的酸碱度、气相环境、温度等。如：如：HelaHela细胞原本是一种上皮型癌细胞，细胞原本是一种上皮型癌细胞，但在过酸或过碱的条件下培养，可以呈现但在过酸或过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱度适中时又可以恢复上皮型梭形，当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。特征。培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定血清血清 Hela 高血清高血清 低血清低血清 成纤维细胞样
