1、第一章第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化蛋白质（酶）、核酸的分离纯化第三章第三章 层析技术层析技术第二章第二章 离心技术离心技术第四章第四章 电泳技术电泳技术第一章第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化蛋白质（酶）、核酸的分离纯化第一节第一节 引言引言 一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序第二节第二节 蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理 一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理 二、细胞的破碎二、细胞的破碎 三、细胞器的分离三、细胞器的分离 四、提取四、提取第三节第三节 分离纯
2、化分离纯化 一、一、粗提纯粗提纯 二、二、精提纯精提纯 三、三、纯度鉴定纯度鉴定第四节第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存生物大分子的浓缩、干燥及保存 第一节第一节 引言引言n蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子；是非常重要的生物大分子；n蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能；识别等多种生理功能；n核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋白质的合成。各种蛋白质的
3、合成。性质性质 方法方法v分子大小分子大小 透析、超滤、差速离心、凝胶过滤透析、超滤、差速离心、凝胶过滤v溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀v电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析v吸附性质吸附性质 吸附层析吸附层析v对配体分子对配体分子 的生物亲和力的生物亲和力 亲和层析亲和层析生物大分子的分离纯化的方法很多，主要是根据分子之间特异生物大分子的分离纯化的方法很多，主要是根据分子之间特异性的差异，如分子大小性的差异，如分子大小、溶解度、电荷等建立起来的。、溶解度、电荷等建立起来的。一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核
4、酸，研究其从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义；生命现象的本质有重大意义；工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂；工业，需要大量的高活性的酶制剂；（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等）（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等）医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病；医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病；基因工程的需要。基因工程的需要。二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求1 1、纯度纯度：主要取决于研究的目的
5、和应用上的要求。如作：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2 2、活性活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。活性。3 3、收率收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有：希
6、望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：材料的选择和预处理；材料的选择和预处理；破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）；破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）；分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。第二节第二节 蛋白质（酶）、核酸蛋白质（酶）、核酸 分离
7、纯化的前处理分离纯化的前处理一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理n选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。虑上述问题，只要能达到实验目的即可。n实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪
8、组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。二、细胞的破碎二、细胞的破碎n分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体
9、液择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。行组织细胞的破碎。n组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同件也不同。v一般动物组织和细胞可用一般动物组织和细胞可用电动捣碎机电动捣碎机或或匀浆器匀浆器破碎或用破碎或用超声波超声波处理破碎；处理破碎；v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成
10、的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起起研磨研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的；的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的；v细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。三、细胞器的分离三、细胞器的分离n细胞器包括细胞核、
11、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。还有叶绿体。n如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。n细胞器的分离一般采用细胞器的分离一般采用差速离心法差速离心法，即将破碎后的细胞在，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠蔗
12、糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分分步离心后，即可获得所需组分。四、提取四、提取n组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备持原来的天然状态，避免因长久放
13、置造成制备物的分解破坏，这就是物的分解破坏，这就是提取提取。提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂）。或有机溶剂）。1、蛋白质（酶）的提取蛋白质（酶）的提取n大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L20-50m mol/
14、L的的磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5pH7.0-7.5）或）或0.1mol/L Tris-HCl0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。）缓冲液作提取液。n对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。异丙醇、正丁醇等。2、核酸的提取核酸的提取nDNADNA和和RNARNA在细胞中常与蛋白质结合，
15、以核蛋白在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。的形式存在。nDNADNA的提取的提取：一般是利用：一般是利用DNA-DNA-核蛋白（核蛋白（DNPDNP）易）易溶于溶于1mol/L NaCl1mol/L NaCl溶液。溶液。nRNARNA的提取的提取：利用：利用RNA-RNA-核蛋白（核蛋白（RNPRNP）易溶于）易溶于0.14mol/LNaCl0.14mol/LNaCl溶液，先提取得到溶液，先提取得到RNPRNP。提取得到提取得到DNPDNP或或RNPRNP后，再将蛋白质除去即可得后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。到相应的核酸。n蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。蛋白质的去
16、除可以选择去污剂法或有机溶剂法。n去污剂法去污剂法是利用是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余蛋白质复合物沉淀，并使多余的的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。n有机溶剂法有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯
17、仿而变性，与核成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。蛋白质的去除蛋白质的去除 第三节第三节 分离纯化分离纯化n从细胞中提取得到的生物大分子往往是不从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分粗分级分离
18、和细分级分离级分离两步进行。两步进行。一、粗提纯一、粗提纯1.蛋白质的粗提纯蛋白质的粗提纯 主要是利用主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。这些方法的特点是简便，的杂蛋白分开。这些方法的特点是简便，处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。蛋白质，但分辨率低。（1）盐析盐析l 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NHNH4 4)2 2SOSO4 4，NaNa2 2SOSO4 4，NaClNaCl，使蛋白质脱去水
19、化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。l 盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白破坏蛋白质分子表面的水化层质分子表面的水化层。l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水性基团的种类、数目以及排布的不同，其水
20、化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使不同的蛋白质分不同的蛋白质分别别沉淀。如：沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析（2）等电点沉淀等电点沉淀n蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液量有关，随溶液pHpH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pHpH值等值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。于蛋白质等电点时，蛋白质的
21、溶解度最小。n不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液溶液pHpH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。（3）有机溶剂法有机溶剂法n与水互溶的极性有机溶剂如与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。n有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：v降低水的介电常数降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程
22、度减弱，水化程度降低，促进基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。了蛋白质分子的聚集沉淀。v是极性有机溶剂是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水与蛋白质争夺水化水，而使蛋，而使蛋白质分子沉淀。白质分子沉淀。n室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。解决变性问题。不同的蛋白不同的蛋白质质由
23、于水化层厚度不同，发生沉淀由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。度的有机溶剂分离不同的蛋白质。2.核酸的粗提纯核酸的粗提纯n从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。提纯。n粗提纯中，进一步将蛋白质除去粗提纯中，进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。溶剂多次反复提取。n从从RNARNA除去混杂的除去混杂的DNADNA，可用，可
24、用DNAaseDNAase将将DNADNA降解掉。降解掉。n从从DNADNA中除去混杂的中除去混杂的RNARNA，可用，可用RNAaseRNAase将将RNARNA降解掉。降解掉。二、精提纯二、精提纯1.蛋白质精提纯蛋白质精提纯一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳柱层析及电泳方法。方法。常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析。吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电
25、聚常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。焦电泳。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。n核酸样品进行精提纯，一般常用核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电超离心、电泳、柱层析泳、柱层析等方法。等方法。n超离心包括超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心速度区带离心、沉降平衡超离心。n电泳包括电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。前者凝胶孔径小，适合分离前者凝胶孔径小，适合分离10001000个核苷酸以下的核个核苷酸以下的核酸分子。后
26、者孔径大，适合分离较大的核酸分子。酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。n柱层析主要有柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析析、羟基磷灰石柱层析。2.核酸核酸精提纯精提纯三、三、纯度鉴定纯度鉴定n生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。的纯度。n蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。超速离心沉降分析法等。v选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确
27、定蛋选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用白质的纯度，必须同时采用2-32-3种不同的方法种不同的方法才能确定。才能确定。n核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A A260260/A/A280280）等方法。）等方法。v同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-32-3种方法才能确定。种方法才能确定。第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存一、浓缩一、浓缩1.1.吸收法吸收法2.2.超滤法超滤法
28、二、干燥二、干燥1.1.真空干燥真空干燥2.2.冷冻真空干燥冷冻真空干燥三、样品的保存三、样品的保存1.1.干态保存干态保存2.2.液态保存液态保存 离心技术概论离心技术概论 一般制备离心一般制备离心 超离心技术超离心技术第二章第二章 离心技术离心技术台式高、超台式高、超速离心机速离心机0.6-10万万rpm离心机离心机制备性制备性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机台式（或台式（或地面式）地面式）普通离心普通离心机机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.6万万rpm高速冰冻高速冰冻离心机离心机0.6-2.5万万超速冰冻超速冰冻离心机离心机
29、2.5-8万或万或更高更高(分析性超速离心主要用于检测大分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等分子物质的沉降特征和结构等)概述概述一般制备离心一般制备离心v 一般制备离心是指在分离、浓缩、提纯样品中，一般制备离心是指在分离、浓缩、提纯样品中，不必制备密度梯度的不必制备密度梯度的一次完成的离心操作一次完成的离心操作，实验室用，实验室用低、高速离心机可应用于此项技术。低、高速离心机可应用于此项技术。台式或地面式普通离心机台式或地面式普通离心机高速冰冻离心机高速冰冻离心机科研人员将采集的脐带血放置到低温科研人员将采集的脐带血放置到低温超速离心机内进行技术处理超速离心机内进行技术处理超
30、速冰冻离心机超速冰冻离心机应用范围：应用范围：病毒及亚细胞组份分离病毒及亚细胞组份分离 蛋白梯度分离蛋白梯度分离 脂蛋白分离脂蛋白分离 RNA梯度沉淀梯度沉淀 质粒质粒DNA提纯提纯 v制备性超速离心主要制备性超速离心主要利用离心机转子高速旋转时所产生利用离心机转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质分开。系数或浮力密度差的物质分开。v沉降系数指单位沉降系数指单位(cm)(cm)离心场中颗粒沉降的速度，用离心场中颗粒沉降的速度，用s s表表示，其单位是示，其单位是1 11010-13-13秒，
31、简称秒，简称S S，即，即1 1S S1 11010-13-13秒。秒。v沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。动的距离。v制备超离心的关键是制备超离心的关键是如何根据颗粒和介质的性质以及转如何根据颗粒和介质的性质以及转子的某些参数来子的某些参数来确定确定转速和离心时间转速和离心时间。v颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形状和密度、沉降介质的密度和粘度。状和密度、沉降介质的密度和粘度。超离心技术超离心技术一、一、原理和计算原理和计算二、二、转子离心管及选择转子离心管及
32、选择三、三、离心技术类型离心技术类型四、四、梯度回收梯度回收一、原理和计算一、原理和计算（一）离心力和相对离心力（一）离心力和相对离心力v当离心机转头以一定的角速度当离心机转头以一定的角速度w w（弧度（弧度/秒）旋转，颗粒的旋秒）旋转，颗粒的旋转半径为转半径为r r（厘米）时，任何颗粒均受一个向外的离心力，此离（厘米）时，任何颗粒均受一个向外的离心力，此离心力为：心力为：F=mF=m2 2r r 式中，式中，F F通常以地心引力表示，称为相对离心力（通常以地心引力表示，称为相对离心力（RCFRCF），相对），相对离心力指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力离心力指在离心力场中，作用
33、于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度的倍数，单位是重力加速度g g（980980厘米厘米/秒秒2 2），这时），这时RCFRCF可表示可表示如下：如下：RCF=RCF=2 2r/980r/980 v实际上，这一关系式常用每分钟转数实际上，这一关系式常用每分钟转数n n（或（或rpmrpm），以更通用），以更通用表达式来表示，由于表达式来表示，由于=2n/60 =2n/60 于是：于是：RCF=4RCF=42 2（rpmrpm）2 2r/3600r/3600*980 980 简化得：简化得：RCF=1.119RCF=1.1191010-5-5 （rpmrpm）2 2r r v一般
34、低转速时常用一般低转速时常用rpmrpm来表示，高转速离心则以来表示，高转速离心则以g g表示。表示。半径半径相对离心力相对离心力转速转速方法：方法：三点一线，三点一线，左对左，左对左，右对右右对右v为了便于为了便于进行转速和进行转速和相对离心力相对离心力之间的换算之间的换算，人们在式，人们在式的基础上的基础上制作了三者制作了三者关系的列线关系的列线计算图计算图RCF=1.119RCF=1.1191010-5-5 （rpmrpm）2 2r r二、转子离心管及选择二、转子离心管及选择（一）离心管（一）离心管v常见的玻璃离心管质硬且脆，不能承受超离心的压力。常见的玻璃离心管质硬且脆，不能承受超离心
35、的压力。v用于超离心机转子中的离心管分为塑料管及不锈钢管两类。用于超离心机转子中的离心管分为塑料管及不锈钢管两类。v离心时样品一般应装满离心管，否则将可能因有气泡而使管离心时样品一般应装满离心管，否则将可能因有气泡而使管的外部受压不均，造成离心管破裂，使转子不平衡产生事故。的外部受压不均，造成离心管破裂，使转子不平衡产生事故。（二）离心管帽（二）离心管帽v超离心机所用离心管一般都附有管帽，离心时离心管需戴上超离心机所用离心管一般都附有管帽，离心时离心管需戴上管帽。管帽。（三）转子及选择（三）转子及选择v 主要有角转子、水平转子、垂直转子、区带转子等几种主要有角转子、水平转子、垂直转子、区带转子
36、等几种类型。类型。1 1、角转子、角转子指离心管腔与转轴成一定倾角的转子，角度越大，沉降越指离心管腔与转轴成一定倾角的转子，角度越大，沉降越结实，分离效果越好，相反，角度越小，颗粒沉降距离短，结实，分离效果越好，相反，角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积，称为一侧会出现颗粒沉积，称为“壁效应壁效应”。最适合差速离心，。最适合差速离心，强度大、方便，但加速或减速时，对样品有搅动。强度
37、大、方便，但加速或减速时，对样品有搅动。2 2、水平转子、水平转子转子活动管套内的离心管，旋转时随着转子的转动，从转子活动管套内的离心管，旋转时随着转子的转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约垂直悬吊上升到水平位置（约200200800rpm800rpm）时。颗粒在）时。颗粒在水平转子中的沉降是沿管子方向的，梯度离心中颗粒沉降水平转子中的沉降是沿管子方向的，梯度离心中颗粒沉降区带横过离心管，离心后区带不必重新定位，但只有处于区带横过离心管，离心后区带不必重新定位，但只有处于样品区带中心的颗粒才直接向管底沉降，其它颗粒则撞向样品区带中心的颗粒才直接向管底沉降，其它颗粒则撞向壁的两侧，产生壁的两侧，产
38、生“壁效应壁效应”，但受振动和变速搅乱后对流，但受振动和变速搅乱后对流现象小得多。现象小得多。3 3、垂直转子、垂直转子角式转子的特殊形式，主要用于等密度梯度离心，这种转角式转子的特殊形式，主要用于等密度梯度离心，这种转子颗粒移动距离短，比水平式和角式转子节约大量时间，但子颗粒移动距离短，比水平式和角式转子节约大量时间，但速度剧变容易产生对流扰乱。速度剧变容易产生对流扰乱。4 4、区带转子、区带转子 三、离心技术类型三、离心技术类型v 常用离心技术一般包括差速离心法，速度区带法和等密常用离心技术一般包括差速离心法，速度区带法和等密度梯度沉降法。度梯度沉降法。（一）差速离心法（一）差速离心法原理
39、原理：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。下分批分离的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的大转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀沉淀”及含小和轻颗
40、粒及含小和轻颗粒“上清液上清液”，如此多次离心处理，即，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，能把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心（需经再悬浮和再离心（2 23 3次），才能得到较纯颗粒。次），才能得到较纯颗粒。用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。内质网与高基体、最后为核蛋白体。已破碎的细胞已破碎的细胞 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核
41、）上清液上清液 沉淀（细胞膜碎片、沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）线粒体、溶酶体）上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白体）沉淀（核糖核蛋白体）上清液（可溶上清液（可溶性组分）性组分）500 g，10 10 000 g，10 100 000 g，3h（二）速度区带法（二）速度区带法速度区带主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器速度区带主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各生物颗
42、粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。（三）等密度梯度沉降法（三）等密度梯度沉降法原理原理：等密度梯度沉降（：等密度梯度沉降（isopycnicisopycnic sedimentation sedimentation）适用）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细等的介质处，并停留在那
43、里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。胞或细胞器分离。等密度梯度离心一般常用等密度梯度离心一般常用CsClCsCl、RuClRuCl、蔗糖、甘油等做介、蔗糖、甘油等做介质。介质梯度不质。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。中进行再分配。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。四、梯度回收四、梯度回收1 1、穿刺法、穿刺法 这是一种简易的手工操作法，采用针穿刺离心管底部，使这是一种简易的手工
44、操作法，采用针穿刺离心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法适用于薄梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法适用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小试管中，经分析决定取舍或壁塑料管，流出液部分收集于小试管中，经分析决定取舍或合并。合并。此法对梯度扰动小，但离心管不能再用，不适合回收管底此法对梯度扰动小，但离心管不能再用，不适合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢或厚壁塑料管。有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢或厚壁塑料管。2 2、取代法、取代法 回收梯度中最常使用的一种方法，分为向上及向下取回收梯度中最常使用的一种方法，分为向上及向下取代两种。取代法优点是不破坏离心管，能用于较粘
45、梯度，代两种。取代法优点是不破坏离心管，能用于较粘梯度，可借光学（放射性）系统进行流出液跟踪，简化分析化验可借光学（放射性）系统进行流出液跟踪，简化分析化验工作。缺点是开始取代操作时易引起扰乱，操作需特别小工作。缺点是开始取代操作时易引起扰乱，操作需特别小心，梯度粘度太大时也不合适。心，梯度粘度太大时也不合适。浓浓取取代代液液 稀稀 浓浓通入空气、轻液体通入空气、轻液体收集收集 浓浓 稀稀收集收集3 3、虹吸法、虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不损伤离心管，尤其适用于不锈钢管中梯度，它也不损伤离心管，尤其适用于不锈钢管中物质的分
46、级分离，但虹吸时易引起分离区带扰乱，物质的分级分离，但虹吸时易引起分离区带扰乱，最好使用专门的装置。最好使用专门的装置。除取代法和虹吸法外，有时从管上部直接仔细除取代法和虹吸法外，有时从管上部直接仔细地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。4 4、切割法、切割法 适用于极粘梯度，就是用离心管切割器将冻结适用于极粘梯度，就是用离心管切割器将冻结的塑料管切成薄片，从而将梯度分部收集，此法仅的塑料管切成薄片，从而将梯度分部收集，此法仅适用于赛璐璐或硝酸纤维素管。适用于赛璐璐或硝酸纤维素管。梯度的分析梯度的分析分析梯度中的回收物质常用紫外吸收法、酶活力测
47、定法、放射分析梯度中的回收物质常用紫外吸收法、酶活力测定法、放射标记法。标记法。蛋白质、核酸或某些含蛋白质、核酸占优势的细胞器、病毒蛋白质、核酸或某些含蛋白质、核酸占优势的细胞器、病毒可用紫外吸收法测定。细胞器一般可测定标志酶活性，通常每可用紫外吸收法测定。细胞器一般可测定标志酶活性，通常每一组分至少选二种标志酶，如一时找不到更好的测定目的物，一组分至少选二种标志酶，如一时找不到更好的测定目的物，也可测光吸收来推断分布的组分，对于同位素标记物，最好是也可测光吸收来推断分布的组分，对于同位素标记物，最好是测定其放射活性。此外，某些情况下也可用免疫法，电泳法测测定其放射活性。此外，某些情况下也可用
48、免疫法，电泳法测定物质在梯度中的分布，亚细胞成分可用电镜或光学显微镜观定物质在梯度中的分布，亚细胞成分可用电镜或光学显微镜观察分析各分部的组分，最后分析结果。察分析各分部的组分，最后分析结果。第三章第三章 层析技术层析技术引言引言层析法的基本原理层析法的基本原理层析法的分类层析法的分类第一节第一节 吸附层析技术吸附层析技术第二节第二节 分配层析技术分配层析技术第三节第三节 凝胶过滤层析技术凝胶过滤层析技术第四节第四节 离子交换层析法离子交换层析法第五节第五节 亲和层析法亲和层析法第六节第六节 高压液相层析（高压液相层析（HPLCHPLC）引言引言n层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是190
49、61906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为名为“色谱法色谱法”（Chromatography)Chromatography)。n后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。n19441944年出现纸层析。年出现纸层析。n以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压以后层析法不断发展，相继出现气
50、相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法的基本原理层析法的基本原理n层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。到分离的目的。层
