1、授课人：XX XX XX学院 XX 专业【全套课件全套课件】2第一节第一节 细胞培养的设施、条件细胞培养的设施、条件及方法及方法 3 研究基础：细胞学研究基础：细胞学 操作对象：细胞或组织操作对象：细胞或组织 基本技术：细胞与组织培养基本技术：细胞与组织培养4一、细胞工程的基本原理一、细胞工程的基本原理1.1 细胞工程的概念及研究范畴细胞工程的概念及研究范畴1.2 细胞工程的基础知识细胞工程的基础知识1.3 细胞工程细胞工程的理论核心的理论核心51.1 细胞工程的概念及研究范畴细胞工程的概念及研究范畴 概念概念：应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工
2、程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。有关理论和技术方法的学科。研究范畴研究范畴：广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。根据研究对象不同，细胞工程可分为合和细胞培养技术。根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。
3、动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。61.2 细胞工程的基础知识细胞工程的基础知识生物界有两大类细胞生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞原核细胞与真核细胞。原核细胞原核细胞：DNADNA裸露于细胞质中，不与蛋白质结合，易于人裸露于细胞质中，不与蛋白质结合，易于人们的遗传操作；生长迅速；胞内无膜系构造细胞器；是细们的遗传操作；生长迅速；胞内无膜系构造细胞器；是细胞改造的良好材料。胞改造的良好材料。真核细胞真核细胞：胞内有细胞核和众多膜系构造细胞器；一般都有胞内有细胞核和众多膜系构造细胞器；一般都有明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高度螺明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体
4、呈现高度螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也不利于外源基因的插旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也不利于外源基因的插入。可采取一定的措施诱导真核细胞同步化生长。植物细入。可采取一定的措施诱导真核细胞同步化生长。植物细胞外还有数层以纤维素为主要成分的细胞壁。胞外还有数层以纤维素为主要成分的细胞壁。7动物细胞结构图动物细胞结构图细菌细胞模式图细菌细胞模式图81.3 细胞工程的理论核心细胞工程的理论核心1.3.1 细胞全能性概念细胞全能性概念 19021902年，德国植物学家年，德国植物学家HaberlandtHaberlandt提出了细胞全能性的假想。提出了细胞全能性的假想。19341934年，年，Wh
5、iteWhite首次定义为首次定义为:每个植物活细胞在合适的条件下，都有发每个植物活细胞在合适的条件下，都有发育为胚的能力。育为胚的能力。7070年代，扩大了以上定义范围，认为：植物活细胞不但能形成胚状体，年代，扩大了以上定义范围，认为：植物活细胞不但能形成胚状体，而且能发育为完整植株。而且能发育为完整植株。8080年代初，认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体年代初，认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体植株的那种合成药用成分的能力，即培养细胞的药物生物合成的能力。植株的那种合成药用成分的能力，即培养细胞的药物生物合成的能力。9目前细胞全能性定义：目前细胞全能性定义：
6、每个植物活细胞都具有该物种的每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢新陈代谢、应激性应激性和和自体复制自体复制等生命基本属性，在合适的离等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。体培养条件下，可以展现这些特征属性。101.3.2 植物活细胞具有生命特征属性植物活细胞具有生命特征属性 生命特征属性生命特征属性 细胞具有生命特征属性细胞具有生命特征属性离体培养细胞展现该物种的生命特性离体培养细胞展现该物种的生命特性11 生命特征属性：生命特征属性：新陈代谢新陈代谢、应激性应激性、自我复制自我复制121.1.新陈代谢：是指维持生命各种活动过程中的化学变化的总新陈代谢：是指维持生命各种
7、活动过程中的化学变化的总称。称。生物体总是不断地从环境中摄取物质和能量，来维持自身。生物体总是不断地从环境中摄取物质和能量，来维持自身。又有同等量的能量，以热或者其他形式排出体外。一旦新又有同等量的能量，以热或者其他形式排出体外。一旦新陈代谢停止，生命活动也就停止，生物体就会瓦解。陈代谢停止，生命活动也就停止，生物体就会瓦解。即，生物体要维持生命，必须吐故纳新。即，生物体要维持生命，必须吐故纳新。132.2.应激性：是指生物体随环境变化的刺激而发生相应激性：是指生物体随环境变化的刺激而发生相应反应的特征。应反应的特征。生物体的生存离不开环境条件，而环境又是不生物体的生存离不开环境条件，而环境又
8、是不断变化的。除四季有规律的变化外，还有些急剧断变化的。除四季有规律的变化外，还有些急剧变化，如干旱、涝灾、高温、低温、昆虫侵害等变化，如干旱、涝灾、高温、低温、昆虫侵害等等。生物体具有等。生物体具有“某种机制某种机制”来感知和正确估计来感知和正确估计环境的变化，以便在体内加以校正，保证体内平环境的变化，以便在体内加以校正，保证体内平衡，来应付突变的环境。衡，来应付突变的环境。143.3.自我复制：是指生物体利用自身作模板，通过代自我复制：是指生物体利用自身作模板，通过代谢作用，复制出完全相同的结构，或产生也具有谢作用，复制出完全相同的结构，或产生也具有相同的自体繁殖能力的突变结构。相同的自体
9、繁殖能力的突变结构。前者为前者为“遗传遗传”，后者为，后者为“变异变异”。“遗传遗传”保证了物种的纯化，保证了物种的纯化，“变异变异”为物种的进化提供为物种的进化提供依据。自我复制实现了遗传与变异的矛盾统一。依据。自我复制实现了遗传与变异的矛盾统一。15细胞具有生命特征属性细胞具有生命特征属性 生物体由细胞组成，所以细胞也具有生命特征生物体由细胞组成，所以细胞也具有生命特征属性。属性。细胞是生物体结构和功能的基本单位。核酸是构细胞是生物体结构和功能的基本单位。核酸是构成细胞的重要物质，携带着遗传信息，并具有自成细胞的重要物质，携带着遗传信息，并具有自我复制的能力，但当单独存在时，不能表现出生我
10、复制的能力，但当单独存在时，不能表现出生命特征属性。只有组成细胞时，才能表现完整的命特征属性。只有组成细胞时，才能表现完整的生命活动。生命活动。16 同一个体每一个体细胞所含的基因是相同同一个体每一个体细胞所含的基因是相同的，但细胞结构和功能往往不同（如根细胞的，但细胞结构和功能往往不同（如根细胞具有吸收水分和养分的作用；叶片具有光和、具有吸收水分和养分的作用；叶片具有光和、蒸腾作用等）。蒸腾作用等）。所以说，并非每个细胞能把全部遗传信息所以说，并非每个细胞能把全部遗传信息都表达出来。有的基因在这些细胞中表达，都表达出来。有的基因在这些细胞中表达，另一些基因在另一些细胞中表达。即，生命另一些基
11、因在另一些细胞中表达。即，生命的全部属性在不同的细胞中分别表达。的全部属性在不同的细胞中分别表达。17离体培养细胞展现该物种的生命特性离体培养细胞展现该物种的生命特性1.1.培养细胞的新陈代谢培养细胞的新陈代谢 在适宜条件下，离体细胞能够存活，则在适宜条件下，离体细胞能够存活，则具有新陈代谢特性。如：绿色细胞具有光自具有新陈代谢特性。如：绿色细胞具有光自养能力；培养细胞具有该物种的养能力；培养细胞具有该物种的“药物生物药物生物合成的能力合成的能力”。182.2.培养细胞的应激性培养细胞的应激性 在适宜培养条件下，离体细胞具有应激在适宜培养条件下，离体细胞具有应激性：植物组织切割损伤后，应激于培
12、养条件性：植物组织切割损伤后，应激于培养条件而出现脱分化，并在适宜的条件下再分化而出现脱分化，并在适宜的条件下再分化（芽和根）。（芽和根）。193.3.培养细胞展现自体复制特性培养细胞展现自体复制特性再分化再分化植株植株植物组织植物组织脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织（脱分化细胞）（脱分化细胞）2021 细胞工程是生命科学领域的一个组成部分。就学科而言，细胞工程是生命科学领域的一个组成部分。就学科而言，它是它是涉及细胞生物学、发育生物学和遗传学等多门学科涉及细胞生物学、发育生物学和遗传学等多门学科的综合科学。的综合科学。细胞工程以细胞培养技术、细胞融合技术为基础，现已细胞工程以细胞培养技术、细胞融
13、合技术为基础，现已被广泛应用于多个学科的被广泛应用于多个学科的基础研究工作基础研究工作以及以及农业、医药农业、医药与食品等生产与食品等生产中。中。近年来细胞工程的开发和应用主要集中在细胞杂交，快近年来细胞工程的开发和应用主要集中在细胞杂交，快速无性繁殖和细胞育种等方面。细胞工程在新技术革命速无性繁殖和细胞育种等方面。细胞工程在新技术革命的浪潮中对农业、食品等传统工艺革新有着重大的影响。的浪潮中对农业、食品等传统工艺革新有着重大的影响。22细胞工程所涉及的主要技术有：细胞工程所涉及的主要技术有：细胞培养细胞培养技术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞技术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞重建技术、染色
14、体工程技术、体外授精、重建技术、染色体工程技术、体外授精、胚胎移植技术和生物反应器技术等胚胎移植技术和生物反应器技术等;在食品工业中应用较广泛的细胞工程技术在食品工业中应用较广泛的细胞工程技术主要是主要是细胞培养技术、细胞融合技术、细细胞培养技术、细胞融合技术、细胞重建技术及细胞代谢物的生产技术胞重建技术及细胞代谢物的生产技术等。等。细胞工程的基本技术细胞工程的基本技术23 1细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术是指动物和植物细胞细胞培养技术是指动物和植物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。在体外无菌条件下的保存和生长。即将机体内某一组织取出，使其分即将机体内某一组织取出，使其分散成单个细胞，在
15、体外人工的生长条散成单个细胞，在体外人工的生长条件下培养，使细胞生长和不断增殖。件下培养，使细胞生长和不断增殖。24细胞培养细胞培养25植物组织培养植物组织培养262细胞融合技术细胞融合技术 指两种不同亲株经酶法去除细胞壁得到两个指两种不同亲株经酶法去除细胞壁得到两个原生质体，并在助融剂作用下互相凝集并发原生质体，并在助融剂作用下互相凝集并发生细胞间的融合，进而导致基因重组，获得生细胞间的融合，进而导致基因重组，获得新菌株。新菌株。其融合频率明显高于常规杂交数倍至几十倍。其融合频率明显高于常规杂交数倍至几十倍。对促进基因重组、遗传育种、选育优良品系，对促进基因重组、遗传育种、选育优良品系，以达
16、到高产优质具有重要实践意义。以达到高产优质具有重要实践意义。273细胞器移植和细胞重建技术细胞器移植和细胞重建技术所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。品种的一项技术。克隆羊克隆羊282930 动物细胞工程动物细胞工程主要应用于主要应用于培养有生理活性的物质培养有生理活性的物质，如，如病毒疫病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体苗、干扰素、单克隆
17、抗体等。等。由于动物细胞工程的复杂性及精密性，促进动由于动物细胞工程的复杂性及精密性，促进动物细胞大量培养的新工艺、新技术不断涌现物细胞大量培养的新工艺、新技术不断涌现;其中关键技术包括：其中关键技术包括：无血清细胞培养基的开发，无血清细胞培养基的开发，灌注悬浮培养、贴壁细胞培养、固定化细胞培灌注悬浮培养、贴壁细胞培养、固定化细胞培养养等培养技术的应用等。等培养技术的应用等。31动物细胞结构动物细胞结构32 植物细胞工程植物细胞工程 主要指植物细胞培养技术，以前称之为植物主要指植物细胞培养技术，以前称之为植物组织培养，是一种将植物的组织、器官或细胞组织培养，是一种将植物的组织、器官或细胞在适当
18、的培养基上进行无菌培养技术。在适当的培养基上进行无菌培养技术。最常见的植物细胞培养技术有最常见的植物细胞培养技术有愈伤组织培养、愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、基尖分生组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、基尖分生组织培养、原生质体培养和固体化细胞培养原生质体培养和固体化细胞培养几大类型。几大类型。33植物细胞结构植物细胞结构344、染色体工程、染色体工程 将单个染色体或染将单个染色体或染色体组转入或移出色体组转入或移出受体细胞，从而形受体细胞，从而形成新的染色体组合成新的染色体组合和遗传构成。广泛和遗传构成。广泛用于优良品种的培用于优良品种的培育，如多倍体的育育，如多倍体的育种。种。355
19、、胚胎工程、胚胎工程 胚胎工程是以生殖胚胎工程是以生殖细胞和胚胎细胞为细胞和胚胎细胞为对象进行的细胞工对象进行的细胞工程操作，主要技术程操作，主要技术包括体外受精、胚包括体外受精、胚胎移植、胚胎切割胎移植、胚胎切割等。等。366、干细胞与组织工程、干细胞与组织工程 干细胞是动物体内具有分化潜能、并能自我更干细胞是动物体内具有分化潜能、并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。377、转基因与生物反应器、转基因与生物反应器（1）转基因动物）转基因动物（2）转基因植物）转基因植物38二二 细胞培养的设施、条件及方法细胞培养的设施、条件及方法 主要介绍细胞
20、工程实验室的设置及其所需要主要介绍细胞工程实验室的设置及其所需要的基本条件。的基本条件。细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在于，要求保持严格别在于，要求保持严格无菌环境无菌环境，避免微生，避免微生物及其他有害因素的影响。一般来讲，它应物及其他有害因素的影响。一般来讲，它应能进行能进行六方面六方面的工作：的工作：无菌操作、培养、制无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和贮藏备、清洗、消毒灭菌处理和贮藏。392.1 细胞工程实验室的设置细胞工程实验室的设置1.无菌操作室无菌操作室 无菌操作室是相对无菌操作室是相对密封、防尘、防菌密封、防尘、防菌的工作空
21、间，在结的工作空间，在结构和消毒方面都有构和消毒方面都有基本的要求。基本的要求。2.1.1 动物细胞工程实验室的设备动物细胞工程实验室的设备40超净工作台超净工作台412.培养和观察室培养和观察室 需要清洁无灰尘。需要清洁无灰尘。孵育可在培养箱孵育可在培养箱或可控制温度的或可控制温度的温室中进行，一温室中进行，一般实验室多采用般实验室多采用培养箱进行。培养箱进行。42 3.制备室制备室 该区主要进行培养该区主要进行培养液及有关液体的制液及有关液体的制备，在用天平、备，在用天平、PH计、磁力搅拌器等计、磁力搅拌器等设备下完成制备以设备下完成制备以后，应在无菌操作后，应在无菌操作台进行过滤除菌。台
22、进行过滤除菌。43 4.储藏室储藏室 储藏室的主要储藏室的主要设备有冰箱、设备有冰箱、液氮罐、储物液氮罐、储物柜等，还有一柜等，还有一些器皿等，对些器皿等，对储藏室的要求储藏室的要求是取放方便。是取放方便。44 5.清洗和灭菌室清洗和灭菌室 应与其它区分开，应与其它区分开，主要有消毒柜、主要有消毒柜、干燥箱和纯水制干燥箱和纯水制备等设备，进行备等设备，进行所有细胞培养器所有细胞培养器皿的清洗、准备、皿的清洗、准备、消毒及纯水制备消毒及纯水制备等工作。等工作。452.1.2 植物细胞工程实验室的设置植物细胞工程实验室的设置植物细胞工程实验室除具有与动物细植物细胞工程实验室除具有与动物细胞工程实验
23、室相似的无菌操作室、制胞工程实验室相似的无菌操作室、制备室、清洗和灭菌室外，还有其特殊备室、清洗和灭菌室外，还有其特殊的设置，如具有光照条件的培养室、的设置，如具有光照条件的培养室、温室和驯化室等。温室和驯化室等。461、无菌操作室、无菌操作室2、培养室、培养室培养室的温度应当是可控的，一般保持在培养室的温度应当是可控的，一般保持在25左右。左右。3、鉴定室、鉴定室4、清洗室、清洗室5、灭菌室、灭菌室6、制备室、制备室7、驯化移植室、驯化移植室472.2 常用仪器与设备常用仪器与设备1、超净工作台、超净工作台482、倒置显微镜、倒置显微镜 使用倒置显微镜定期检查培养细胞器皿中的使用倒置显微镜定
24、期检查培养细胞器皿中的细胞生长情况，可及时调整培养条件。若发细胞生长情况，可及时调整培养条件。若发现污染，可根据污染类型决定补救措施和处现污染，可根据污染类型决定补救措施和处理方案。若能配置带有相机系统的高质量相理方案。若能配置带有相机系统的高质量相关显微镜，效果更佳。关显微镜，效果更佳。493、电热干燥箱、电热干燥箱 用于细胞培养中的有些器械、器皿需要烘用于细胞培养中的有些器械、器皿需要烘干时使用，玻璃器皿也需要干燥消毒。实干时使用，玻璃器皿也需要干燥消毒。实验室常用的是鼓风式电热干燥箱，其优点验室常用的是鼓风式电热干燥箱，其优点是温度均匀、效果良好，缺点是升温过程是温度均匀、效果良好，缺点
25、是升温过程较慢。较慢。504、水纯化装置、水纯化装置 细胞培养对水的质细胞培养对水的质量要求很高，所有量要求很高，所有与培养细胞接触的与培养细胞接触的液体均需要液体均需要 纯水配纯水配成。水可采用离子成。水可采用离子交换纯水装置或蒸交换纯水装置或蒸馏器纯化。馏器纯化。515、冰箱、冰箱 细胞培养室必须配备普细胞培养室必须配备普通冰箱或冷藏柜，最好通冰箱或冷藏柜，最好还有一台低温冰箱（还有一台低温冰箱（-20）。前者用于贮存）。前者用于贮存各种溶液和短期保存组各种溶液和短期保存组织标本等，织标本等，-20低温低温冰箱则用于储存需要冷冰箱则用于储存需要冷冻保持生物活性及较长冻保持生物活性及较长时期
26、存放的制剂，如酶、时期存放的制剂，如酶、血清、配置的抗生素等。血清、配置的抗生素等。526、压力蒸汽消毒器、压力蒸汽消毒器7、细胞计数板和电子细胞计数仪、细胞计数板和电子细胞计数仪8、过滤除菌装置、过滤除菌装置9、离心机、离心机10、移液管和吸管、移液管和吸管11、离心管、离心管12、移液器、移液器13、天平、天平532.2.2 动物细胞工程实验室的常用仪器设备动物细胞工程实验室的常用仪器设备1、培养箱、培养箱2、显微操作仪、显微操作仪3、细胞融合仪、细胞融合仪4、细胞冷冻储存器、细胞冷冻储存器5、培养用器皿、培养用器皿6、手术器械、手术器械542.2.3 植物细胞工程实验室的常用仪器设备植物
27、细胞工程实验室的常用仪器设备1、光照培养箱、光照培养箱2、人工气候箱、人工气候箱3、摇床、摇床4、培养瓶、培养瓶552.3 实验室的生物安全实验室的生物安全 在进行细胞与组织培养时，尤其是含在进行细胞与组织培养时，尤其是含有病原的生物材料的培养，不仅要保有病原的生物材料的培养，不仅要保证培养物不受污染，也要保证培养物证培养物不受污染，也要保证培养物不会对实验人员和环境造成污染。不会对实验人员和环境造成污染。56清洗的主要目的目的是清除培养器皿中的杂质和微生物等影响细胞生长的成分。清洗后的玻璃器皿要干净、透明、无油质，且无任何残留物质。清洗完毕后的器皿在消毒前必须进行严密包装，以便消毒及储存，防
28、止落入灰尘及消毒后再次被污染。3 3 清洗与消毒清洗与消毒57严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的。细胞培养过程中主要使用两类消毒方法，即物物理灭菌法和化学灭菌法理灭菌法和化学灭菌法。不同的灭菌方式适用于不同的物品，如紫外线法适用于无菌室或超净工作台的台面等大面积消毒，高压蒸汽消毒适用于玻璃器皿，过滤除菌适于含有不耐热成分的培养基和试剂的消毒，化学消毒适用于实验室、无菌室的桌面、物体表面的消毒。58过滤除菌器593.1 清洗清洗3.1.1 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗3.1.2 胶塞的清洗胶塞的清洗3.1.3 塑料制品的清洗塑料制品的清洗3.1.4 G6除菌滤器的清洗除菌滤器的清洗3
29、.1.5 不锈钢除菌滤器的清洗不锈钢除菌滤器的清洗3.1.6 包装包装603.1.1 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗组织细胞培养中使用量最大的是玻璃器皿。组织细胞培养中使用量最大的是玻璃器皿。一般玻璃器皿的清洗包括一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸浸泡、刷洗、浸酸和冲洗酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿要四个步骤。清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质。质。611、浸泡、浸泡 新瓶使用前都需要先新瓶使用前都需要先用清水浸泡，以软化和溶用清水浸泡，以软化和溶解附着物。新的玻璃器皿解附着物。新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表在生产过程中常使玻璃
30、表面呈碱性，并带有一些对面呈碱性，并带有一些对细胞有毒的物质（如铅和细胞有毒的物质（如铅和砷等），同时常有许多灰砷等），同时常有许多灰尘。可先用自来水简单刷尘。可先用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。洗，后用稀盐酸浸泡过夜。培养后的器皿立即浸入水培养后的器皿立即浸入水中以便刷洗。中以便刷洗。622 2、刷洗、刷洗 将浸泡后的玻璃器皿放到清洗剂溶液中，用软将浸泡后的玻璃器皿放到清洗剂溶液中，用软毛刷沾洗涤剂反复刷洗以去除器皿内外表面的毛刷沾洗涤剂反复刷洗以去除器皿内外表面的杂质。需注意两点：一是防止损伤器皿表面光杂质。需注意两点：一是防止损伤器皿表面光洁度以免影响细胞生长；二是不能有死角。洁度
31、以免影响细胞生长；二是不能有死角。633、浸酸、浸酸 清洗液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制清洗液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。这是关键的强，对玻璃器皿无腐蚀作用。这是关键的一个环节。在配制清洗液的时候要小心，一个环节。在配制清洗液的时候要小心，注意安全，防止烧伤皮肤及烧坏衣服。注意安全，防止烧伤皮肤及烧坏衣服。644、冲洗、冲洗玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗，使之尽量不留污染或清洁液的水充分冲洗，使之尽量不留污染或清洁液的残迹。冲洗最好用洗涤
32、装置，既省力，效果残迹。冲洗最好用洗涤装置，既省力，效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗又好。如用手工操作，则需流水冲洗10次以次以上。上。653.1.2 胶塞的清洗胶塞的清洗 胶塞的清洗胶塞的清洗 新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理。再常规处理。常规清洗方法：水中浸泡常规清洗方法：水中浸泡 2%NaOH煮煮沸沸10-20分钟分钟 自来水冲洗自来水冲洗 1%盐酸浸盐酸浸泡泡30分钟分钟 自来水冲洗自来水冲洗 蒸馏水清洗蒸馏水清洗2-3次次 晾干。晾干。663.1.3 塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料自制
33、品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。但包装，打开包装即可用，多为一次性物品。但用后如用无菌处理后，尚可反复使用用后如用无菌处理后，尚可反复使用2-3次，次，但不宜过多，再用时仍然需要清洗和灭菌处理。但不宜过多，再用时仍然需要清洗和灭菌处理。673.1.4 G6除菌滤器的清洗除菌滤器的清洗新新G6除菌滤器置玻璃洗液中浸泡除菌滤器置玻璃洗液中浸泡24小时，流水缓慢冲小时，流水缓慢冲洗，至洗，至pH值为值为55左右，然后用左右，然后用4倍的蒸馏水缓慢冲洗，倍的蒸馏水缓慢冲洗，再用重蒸馏水缓慢冲洗，烤干，包装消毒备用。用过再用重蒸馏水缓慢冲洗，烤干，包装消毒备用。用过
34、的的G6除菌漏斗立即浸泡水中除菌漏斗立即浸泡水中(注意：滤器千万不能干涸注意：滤器千万不能干涸)过夜，流水缓慢冲洗过夜，流水缓慢冲洗24小时或更长时间，至滤面基本小时或更长时间，至滤面基本疏通时，疏通时，50烤干，滤器再置清洁液中浸泡烤干，滤器再置清洁液中浸泡24小时，小时，或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后的处理同新或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后的处理同新G6除菌滤器。除菌滤器。68针头滤器除菌滤器693.1.5 不锈钢除菌滤器的清洗不锈钢除菌滤器的清洗清洗液刷洗新的或使用后的滤器，然后用清洗液刷洗新的或使用后的滤器，然后用流水冲洗，去离子水浸泡，最后用三蒸水流水冲洗，去离子水浸泡，
35、最后用三蒸水浸泡浸泡24小时，然后干燥。小时，然后干燥。70包装材料有皱纹包装纸、硫酸纸、棉包装材料有皱纹包装纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒及金属消毒筒。布、铝饭盒及金属消毒筒。局部包装。局部包装。全包装全包装 小物品装饭盒，注意期限，小物品装饭盒，注意期限，标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花。端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花。3.1.6 包装包装7172723.2 消毒消毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染。污染主要由于操作者的疏忽而引毒等微生物的污染。污染主要由于操
36、作者的疏忽而引起。常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器起。常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底等。由于有关培养的皿和培养液消毒不合格或不彻底等。由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，细胞培养的每个每个环节的失误均能导致培养失败，细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。消毒方法分为物理灭菌法（紫外线、电离辐射、湿热、消毒方法分为物理灭菌法（紫外线、电离辐射、湿热、干热、过滤等）和化学消毒法（各种化学消毒剂）两干热、过滤等）和化学消毒法（各种化学消毒剂）两类。类。733.2.1 3.2.1 物理消
37、毒法物理消毒法1 1、紫外线消毒、紫外线消毒2 2、电离辐射消毒、电离辐射消毒3 3、湿热消毒、湿热消毒4 4、干热消毒、干热消毒5 5、过滤除菌、过滤除菌74(1)(1)紫外线消毒紫外线消毒 紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能使用其他紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能使用其他方法进行的培养器皿。紫外线直接照射，方便、效果方法进行的培养器皿。紫外线直接照射，方便、效果好，经一定的时间照射后可以消灭空气中大部分细菌，好，经一定的时间照射后可以消灭空气中大部分细菌，但是真菌的抵抗力最强。紫外线的直接作用机制是通但是真菌的抵抗力最强。紫外线的直接作用机制是通过破坏微生物的核酸和蛋白质等而使其失活
38、，间接作过破坏微生物的核酸和蛋白质等而使其失活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。紫外线可产生臭氧，污染空气，对试剂及培养液都紫外线可产生臭氧，污染空气，对试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤、眼睛都有伤害。因此，不能有不良影响，对人皮肤、眼睛都有伤害。因此，不能开着紫外灯进行实验操作。开着紫外灯进行实验操作。75紫紫 外外 灯灯76(2)(2)电离辐射消毒电离辐射消毒这主要是指使用放射性核素产生的这主要是指使用放射性核素产生的X线和加速器等线和加速器等发出的辐射进行灭菌消毒，适用于消毒量大和不适发出的辐射进行灭菌消毒，适用于消毒量大和不适于作
39、高压或滤过等培养用品，如培养瓶、培养板、于作高压或滤过等培养用品，如培养瓶、培养板、注射器、移液器吸头、离子管等。电离辐射的优点注射器、移液器吸头、离子管等。电离辐射的优点是灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装的物品是灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装的物品进行灭菌。但由于电离辐射的诱变作用很强，不适进行灭菌。但由于电离辐射的诱变作用很强，不适合消毒的生物材料。合消毒的生物材料。77电离辐射标志电离辐射标志78(3)(3)湿热消毒湿热消毒即高压蒸汽消毒，是一种使用最广泛、效果最好的即高压蒸汽消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方式。湿热消毒时，消毒物品不能装得过满，消毒方式。湿热消毒时，消
40、毒物品不能装得过满，应保证其内气体的流通，以防止消毒器内气体阻塞应保证其内气体的流通，以防止消毒器内气体阻塞而发生危险。而发生危险。79干热消毒法是将电热烤箱的物品加热到干热消毒法是将电热烤箱的物品加热到160以上，以上，并保持并保持90-120分钟以杀死细菌和芽孢。该方法主要分钟以杀死细菌和芽孢。该方法主要用于消毒玻璃器皿。消毒完毕后不可以马上将烤箱用于消毒玻璃器皿。消毒完毕后不可以马上将烤箱门打开，以免温度骤冷而使箱内玻璃器皿破裂。优门打开，以免温度骤冷而使箱内玻璃器皿破裂。优点是消毒后的器皿干燥、易于储存，缺点是升温较点是消毒后的器皿干燥、易于储存，缺点是升温较慢。金属器械和橡胶、塑料制
41、品不能使用干热消毒慢。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。法。(4)(4)干热消毒干热消毒80(5)(5)过滤除菌过滤除菌过滤除菌是将液体或气体用微孔滤过滤除菌是将液体或气体用微孔滤膜过滤，使大于孔径的细菌等微生膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。物颗粒阻留，从而达到除菌目的。813.2.2 化学消毒法化学消毒法化学消毒法是利用化学消毒剂那些不能用化学消毒法是利用化学消毒剂那些不能用物理消毒法进行消毒的物品和场地，如无物理消毒法进行消毒的物品和场地，如无菌室的空气、台面、操作者的皮肤等，操菌室的空气、台面、操作者的皮肤等，操作简单，方便有效。作简单，方便有效。8
42、2 我们都知道，细菌是有机生物，它的细胞壁和细胞膜是由磷脂质双分子膜组成，带有负电荷；而银作为重金属，带有活性极强的阳离子，也就是正电荷。银的杀菌作用，首先表现在物理学中讲到的“同性电荷相排斥，异性电荷相吸引”。当银在其材料的表面释放出大量正电荷后，漂浮在空气中带有负电荷的细菌或其他有机生物，就会被吸附到其表面。正负电荷发生反应后，就抑制了细菌的呼吸，同时使细菌的细胞壁和细胞膜彻底变形破裂，失去繁殖和生存能力，发生“溶解死亡”。；83 另外，重金属本身具有超强的降解功能，当细菌被吸附在银表面时，银离子的超强降解功能就会破坏细菌胞内的酶系统，影响细菌正常的新陈代谢，从而使细菌死亡。一般的抗生素平
43、均只能对6种病菌起到作用，但银能消灭650种病菌。84无菌操作技术是细胞培养的基本技术，包无菌操作技术是细胞培养的基本技术，包括括实验器具和材料的准备、培养室和超净实验器具和材料的准备、培养室和超净工作台的消毒、洗手和着装、无菌培养等工作台的消毒、洗手和着装、无菌培养等操作操作等。特别是操作过程中技术运用要规等。特别是操作过程中技术运用要规范，无菌概念和无菌操作必须贯穿整个培范，无菌概念和无菌操作必须贯穿整个培养过程的始终。养过程的始终。3.3 3.3 细胞培养的基本方法细胞培养的基本方法853.3.1 3.3.1 无菌操作技术无菌操作技术细胞在体外培养中最易被微生物感染。因此，防止细胞在体外
44、培养中最易被微生物感染。因此，防止污染是决定细胞培养成败的关键。无菌概念和无菌污染是决定细胞培养成败的关键。无菌概念和无菌操作必须贯穿整个培养过程的始终。操作必须贯穿整个培养过程的始终。861 实验器具和材料的准备实验器具和材料的准备根据实验要求，将所需的实验器具和材料准根据实验要求，将所需的实验器具和材料准备好，以合适的方法进行消毒和灭菌。备好，以合适的方法进行消毒和灭菌。87无菌培养室每天都要用新洁而灭拖洗地面一次，紫无菌培养室每天都要用新洁而灭拖洗地面一次，紫外线照射消毒外线照射消毒30-50分钟，超净工作台面每次实验分钟，超净工作台面每次实验前要用前要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒酒
45、精擦洗，然后紫外线消毒30分钟。一分钟。一些操作用具要经过些操作用具要经过75%酒精擦洗后可置于台内同时酒精擦洗后可置于台内同时进行紫外线照射消毒，但是台面上的用品不要放置进行紫外线照射消毒，但是台面上的用品不要放置过多或重叠放置，以免降低消毒效果。且勿使培养过多或重叠放置，以免降低消毒效果。且勿使培养细胞和培养液受到紫外线的照射。细胞和培养液受到紫外线的照射。2 培养室和超净台的消毒培养室和超净台的消毒883 洗手和着装洗手和着装进行操作前要更换消毒的无菌服、帽子和口进行操作前要更换消毒的无菌服、帽子和口罩，以罩，以75%酒精消毒手和前臂。实验过程中酒精消毒手和前臂。实验过程中手触及可能污染
46、的物品和出入培养室都要重手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。平时仅做观察时可着经紫新用消毒液洗手。平时仅做观察时可着经紫外线照射外线照射30分钟后的一般工作服。分钟后的一般工作服。89 培养操作基本要领和要求培养操作基本要领和要求 无菌操作无菌操作 成功或失败的首要条件成功或失败的首要条件 培养前准备培养前准备 操作卡片操作卡片 用品置于场地，然后消毒用品置于场地，然后消毒 操作野消毒操作野消毒 洗手和着装洗手和着装 火焰消毒火焰消毒904 无菌培养操作无菌培养操作培养操作培养操作 动作准确敏捷动作准确敏捷 不用手触及已消毒物品不用手触及已消毒物品 操作面布局合理操作面布局合
47、理 操作保持一定顺序操作保持一定顺序 培养用瓶和吸管的放置培养用瓶和吸管的放置 防止各种用液的交叉污染防止各种用液的交叉污染 不向操作者讲话或咳嗽不向操作者讲话或咳嗽918092939397943.4.1 3.4.1 相差显微镜观察相差显微镜观察培养细胞在生活状态下接近透明，结构之间的反培养细胞在生活状态下接近透明，结构之间的反差很小，因此必须借助于能够增强结构之间反差差很小，因此必须借助于能够增强结构之间反差的相差显微镜才能更好地观测活细胞的生长状况。的相差显微镜才能更好地观测活细胞的生长状况。3.4 3.4 培养细胞的观察培养细胞的观察9596(1)(1)相差显微镜的工作原理相差显微镜的工
48、作原理相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折射率由差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射率小的物体中前进的距离较短，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微镜可使用肉眼不能分辨的相位查变为可分辨的振幅差（即敏感差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。97(2)相差显微镜镜的装置（1）环状光阑（2）相板（3）中心望远镜983.4.2 培养细胞的观察(1)细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。99(3)细胞分裂指数(4)细胞贴壁率(5)细胞周期(6)MTT比色法测定细胞活力
49、(2)细胞生长曲线1003.3 细胞培养中常用的染色方法细胞培养中常用的染色方法3.3.1 活体染色活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的组织或细胞进行染色而（即活体染料）对活的组织或细胞进行染色而不影响细胞的生命活动的一种方法。不影响细胞的生命活动的一种方法。101(1)(1)活体染料的类别活体染料的类别分为碱性活体染料和酸性活体染料两大类。分为碱性活体染料和酸性活体染料两大类。(2)(2)活体染色方法活体染色方法 台酚蓝染色法和吖啶橙荧光染色法台酚蓝染色法和吖啶橙荧光染色法1023.3.2 染料排除检测法 死细胞的细胞膜
50、通透性改变，染料进入不能排出。活细胞能够排出进入细胞内的染料。1.台酚蓝排除检测法2.溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法1033.4 细胞培养的污染和检测细胞培养的污染和检测3.4.1污染途径污染途径空气空气器材器材操作操作血清血清组织样本组织样本1043.4.2 污染对培养的影响及检测污染对培养的影响及检测 污染对细胞的影响污染对细胞的影响 1、细菌污染、细菌污染 培养液浑浊培养液浑浊 镜下可见菌体镜下可见菌体2、真菌污染、真菌污染 大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面 镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错105 3、支原体污
