1、 流式细胞仪流式细胞仪 分析技术及应用分析技术及应用 FCMFCM是以流式细胞仪为检测手段的一项是以流式细胞仪为检测手段的一项能能快速、精确快速、精确的对单个细胞理化特性进的对单个细胞理化特性进行行多参数定量分析和分选多参数定量分析和分选的新技术的新技术。什么是流式细胞术什么是流式细胞术(FCM)(FCM)？单细胞的流动的单细胞的流动的 活细胞的活细胞的 定量的定量的 多参数的多参数的 高统计学精度的高统计学精度的 分选细胞分选细胞第一节第一节 流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪的分析及分选原理第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析第三节第三节 流式细胞仪分析的技术要求流式细胞仪分析
2、的技术要求第四节第四节 流式细胞术在免疫学检查中应用流式细胞术在免疫学检查中应用 一一 工作原理：工作原理：FCMFCM是一种在计算机技术支持下的高度是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。第一节第一节 流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪的分析及分选原理 1 1、液流系统、液流系统 样品流和鞘流样品流和鞘流 2 2、光学系统、光学系统 激光、透镜组、激光、透镜组、光电倍增管等。光电倍增管等。3 3、数据处理系统数据处理系统(一）一）基本组成构基本组成构Injector TipSheath fluid样品流和鞘流样品流和鞘流1 1、
3、液流系统、液流系统PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow cell 激光、透镜组、光电倍增等。激光、透镜组、光电倍增等。2 2、光学系统、光学系统 （二）（二）基本工作原理基本工作原理单细胞流：流动室单细胞流：流动室单细胞照明：激光单细胞照明：激光488 nm laser488 nm laser单细胞检测：信号处理单细胞检测：信号处理（一）前向散射光（一）前向散射光(foword scatter)(foword scatter)：FSCFSC 信号的强弱与细胞的大小相关信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（二）侧向
4、散射光（side scatter)side scatter)：SSCSSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关二二 散射光的测定散射光的测定FALS SensorLaserForward Angle Light Scatter细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.90 Degree Light ScatterFALS Sensor90LS SensorLaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.前向散色光前向散色光FSCFSC侧向散色光侧向散色光SSCSSC 利用前向角和利用前向角和测向角
5、散射光可测向角散射光可以把外周血白细以把外周血白细胞分成三群，淋胞分成三群，淋巴细胞、单核巴细胞、单核细胞和粒细胞。细胞和粒细胞。散射光的测定散射光的测定 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量（一）光信号测量 线性放大器线性放大器 对数放大器对数放大器三三 荧光测量荧光测量600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser LinesExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm（二）荧光补偿（二）荧光补偿 利用电子
6、技术或计算机软件等方法将串入相邻利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿荧光补偿”（一）分选的基本原理（一）分选的基本原理488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector四四 细胞分选原理细胞分选原理阳性选择阳性选择MACS-Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离磁珠分离阴性选择阴性选择1 1、分选速度：几千个细胞分选速
7、度：几千个细胞/秒秒2 2、分选纯度分选纯度:99.5%:99.5%左右左右3 3、分选收获率分选收获率:90-95%:90-95%4 4、分选得率、分选得率（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求 分选纯度分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比所占的百分比。分选收获率分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。细胞样品中该亚群细胞数的百分比。第二节第二节 数据的显示和分析数据的显示和分析 一、参数一、参数前向散射光前向散射光FS:FS:反映颗粒的大小反映颗粒的大小侧向散射光侧向散射光SS:SS
8、:细胞内部结构复杂程度细胞内部结构复杂程度荧光荧光FL:FL:细胞被染上荧光部分数量的多少细胞被染上荧光部分数量的多少二二、数据的显示方式数据的显示方式（一）（一）单参数直方图单参数直方图（二）（二）双参数显示双参数显示（三）（三）三参数显示三参数显示 以分布直方图以分布直方图(distribution histogram)(distribution histogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数纵轴一般是细胞数或细胞
9、出现的频数。(一一)单参数直方图的显示单参数直方图的显示Single-Parameter Histogram DisplaysX轴表示绿荧光信号轴表示绿荧光信号(CD3)强弱强弱,Y轴则反应细胞的数量轴则反应细胞的数量.(二二)双参数数据的显示双参数数据的显示Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双双参数数据显示最常用的是二维的散点
10、图参数数据显示最常用的是二维的散点图(Dot(Dot Plot)Plot)。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。纵轴代表第二个测量参数。纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数参数,在图中每一个点代表一个细胞在图中每一个点代表一个细胞1 1、点图、点图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。同，不同的等高线上细胞数不同。2、二维等高图、二维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测
11、量参数数,Z,Z轴为细胞数。轴为细胞数。3、假三维等高图、假三维等高图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。非细胞数。(三三)三参数直方图三参数直方图 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。技术，来分析参数之间的相互关系。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析1、RegionRegion设置设置2、设置设置Gate 样品制备：单细胞悬液样品制备：单细胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置阴性对照的设置:检测标本的重
12、复性检测标本的重复性 质量控制质量控制第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 细胞碎片细胞碎片 细胞团块细胞团块 离心漂洗离心漂洗 固定剂固定剂一一、免疫检测样品制备、免疫检测样品制备 淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll,40kdFicoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为（比重为1.01771.01770.0010.001的分层液的分层液).).（一）外周血淋巴细胞样品的制备（一）外周血淋巴细胞样品的制备 利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血利用红细胞裂解液去除
13、红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。成单细胞悬液。（二（二)培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 机械法：机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理法：酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：化学试剂处理法：E
14、DTA、EGTA等。等。表面活性剂处理法：表面活性剂处理法：Triton-100、皂素等。、皂素等。(三三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。的干扰。酶学法、化学法酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。但会造成所测化学成份的不良
15、影响。FCMFCM所测细胞所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。染色处理不受影响。防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2 2、乙醇与甲醇保存法：、乙醇与甲醇保存法：70%70%冷乙醇、冷乙醇、75%75%的甲醇。的甲醇。3 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有
16、生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。细胞表面荧光染色分析不受影响。(四）单细胞悬液的保存四）单细胞悬液的保存 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm)发射波长（发射波长（nm)颜色颜色FITC 488 525 深蓝色PE(RDI)488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色FITC 488 525 深蓝色P
17、E(RDI)488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。染料产生的荧光信号。LaserCY5PECY5CY5488nm能量传递染料：能量传递染料：荧光染料与细胞成分的结合方式：荧光染料
18、与细胞成分的结合方式：结构亲和方式结构亲和方式 嵌入结合方式嵌入结合方式 共价结合方式共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式荧光抗体特异性结合方式1、直接免疫荧光染色、直接免疫荧光染色2、间接免疫荧光染色、间接免疫荧光染色（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记3、双或多参数荧光抗体的组合标记、双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE 488 525、575 绿色、橙色绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色绿色 568 615 红色红色FITC+PeCy5 488 525、675 绿色、绿色、红色红色FITC+ECD 488 525、625 绿色、橙红色绿色、橙红色F+P+PeCy5
19、 488 525、575、675 绿、橙、绿、橙、红色红色F+ECD+PeCy5 488 525、575、675 绿、绿、橙红色、红色橙红色、红色F+P+APC 488 525、575 绿色、橙色绿色、橙色 633 670 红色红色荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm)发射波长（发射波长（nm)颜色颜色 FITCFITC的激发的激发波长处于自发波长处于自发荧光的光谱区荧光的光谱区内，因此内，因此FITCFITC荧光易受自发荧光易受自发荧光的干扰。荧光的干扰。(三三)细胞的自发荧光细胞的自发荧光（一）单细胞悬液制备的质量控制（一）单细胞悬液制备的质量控制（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制
20、（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响、固定剂对荧光染色的影响（三）仪器操作技术的质量控制（三）仪器操作技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制 1 1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为同型对照（阴性对照）同型对照（阴性对照）2 2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程
21、都会直接影洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。（四）免疫检测的质量控制（四）免疫检测的质量控制一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 淋巴细胞是机体免疫系淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群，统中的一群重要细胞群，是参与免疫调节和执行细是参与免疫调节和执行细胞免疫功能的免疫活性细胞免疫功能的免疫活性细胞，胞，T细胞、细胞、B细胞和细胞和NK细胞，各自发挥不同的作细胞，各自发挥不同的作用。用。第四节第
22、四节 流式细胞在免疫学检查中的应用流式细胞在免疫学检查中的应用三色标记三色标记 淋巴细胞淋巴细胞T、B、NK1、Th 细胞：细胞：CD3+CD4+CD8-T细胞，能辅助细胞，能辅助B细胞分化成熟生细胞分化成熟生成抗体产生细胞成抗体产生细胞（桨细胞），参（桨细胞），参与促进细胞介导与促进细胞介导的免疫应答。的免疫应答。（一）淋巴细胞及其亚群分析（一）淋巴细胞及其亚群分析2 2、TcTc细胞：细胞：CD3+CD4-CD8+T细胞，细胞，能特异性直接杀伤能特异性直接杀伤靶细胞，所有表达靶细胞，所有表达MHC I类分子的靶类分子的靶细胞。抗肿瘤免疫，细胞。抗肿瘤免疫，抗病毒感染，移植抗病毒感染，移植排
23、斥反应和自身免排斥反应和自身免疫疾病中均起了重疫疾病中均起了重要作用。要作用。B B细胞约为细胞约为5%-10%5%-10%，标志，标志为为BCRBCR，膜表面免疫球蛋白，膜表面免疫球蛋白（SmlgSmlg）。表达）。表达CD19CD19、CD20CD20、CD21CD21、CD22CD22分子。分子。B B细胞也是免疫系统重要细胞也是免疫系统重要的免疫细胞，主要功能是的免疫细胞，主要功能是介导体液免疫。抗原递呈介导体液免疫。抗原递呈细胞，能摄取、加工和递细胞，能摄取、加工和递呈抗，同时还能分泌细胞呈抗，同时还能分泌细胞因子调节免疫应答。因子调节免疫应答。(二）二）B B淋巴细胞及其亚群淋巴细
24、胞及其亚群 自然杀伤细胞（自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK Natural killer cell,NK 细胞）细胞）为一为一组大颗粒的淋巴细胞，组大颗粒的淋巴细胞，5%-10%5%-10%左右，标志左右，标志CD16CD16、CD56CD56、CD2CD2、CD11a/CD18CD11a/CD18。用三色荧光标记将。用三色荧光标记将CD3CD3-CD16CD16+CD56CD56+淋巴淋巴细胞定为细胞定为NKNK细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用。抗病毒感染中均起重要作用。（三）（三）NKNK细胞
25、分析细胞分析 （一）细胞介导细胞毒性试验（一）细胞介导细胞毒性试验（二）细胞内细胞因子测定（二）细胞内细胞因子测定 小分子可溶性蛋白质小分子可溶性蛋白质 T细胞和巨噬细胞细胞和巨噬细胞 参与细胞免疫、体液免疫、炎症反应、造血调控、参与细胞免疫、体液免疫、炎症反应、造血调控、细胞增殖和分化、损伤修复重要生理和病理过程。细胞增殖和分化、损伤修复重要生理和病理过程。二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析流式细胞细胞因子分析图流式细胞细胞因子分析图流式细胞细胞因子分析图流式细胞细胞因子分析图三、淋巴造血系统分化抗原三、淋巴造血系统分化抗原 及白血病免疫分型及白血病免疫分型 用多参数用多参数 FCMF
26、CM测定白血病免疫表型可以把病人测定白血病免疫表型可以把病人血液中幼稚的白血病细胞和正常的白细胞区分开。血液中幼稚的白血病细胞和正常的白细胞区分开。根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原，将根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原，将白血病细胞分为白血病细胞分为B B细胞系细胞系(CD19,CD20),T(CD19,CD20),T细胞系细胞系(CD7,CD3)(CD7,CD3)，髓细胞系，髓细胞系(CD13,CD33)(CD13,CD33)以及红细胞系以及红细胞系(glycophorin A)(glycophorin A)和巨噬细胞系和巨噬细胞系(CD61)(CD61)。幼稚白血病细幼稚白血病细
27、胞的表型分析胞的表型分析 在肿瘤病人使用化疗药物中，会产生药物的在肿瘤病人使用化疗药物中，会产生药物的耐受。当检测患者外周的淋巴细胞表达耐受。当检测患者外周的淋巴细胞表达MDR阳阳性细胞时，说明患者对化疗药物开始出现耐药性。性细胞时，说明患者对化疗药物开始出现耐药性。提示临床医生应更改治疗方案。提示临床医生应更改治疗方案。四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析 艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒（是由人类免疫缺陷病毒（HIV)感染人体后产生的感染人体后产生的Th细胞受损而导致全身免疫功能下降。细胞受损而导致全身免疫功能下降。五、在五、在AIDS病检测中的分析病检测中的分析 强直性脊柱炎强直性脊柱炎 HLA-B27/HLA-B7双标记双标记 FCM检测：病人检测：病人58%-97%正常人仅正常人仅2%-7%六、自身免疫性疾病相关六、自身免疫性疾病相关HLA HLA 抗原分析抗原分析
