1、第十一章第十一章甾体激素类药物的分析甾体激素类药物的分析基本结构：环戊烷骈多氢菲基本结构：环戊烷骈多氢菲C20C21ABCD12345678910111213141516171819l环上双键的表示方法：环上双键的表示方法：l 用用“”表示表示,双键的位置写在双键的位置写在 的右的右上角。上角。双键位置双键位置454 14251,4 565105 5(10)l环上取代基构型表示方法：环上取代基构型表示方法：构型：构型：l与母核连接的取代基与母核连接的取代基,指向环平面的前指向环平面的前面时面时,为为 构型构型.用实线表示用实线表示“”“”构型：构型：l与母核连接的取代基与母核连接的取代基,指向
2、环平面的背指向环平面的背面时面时,为为 构型构型.用虚线表示用虚线表示“”按药理作用分类：按药理作用分类：甾体激素甾体激素肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素性激素性激素雄性激素及蛋雄性激素及蛋白同化激素白同化激素孕激素孕激素雌激素雌激素OHOOHOCH2OHHHH肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素氢化可的松氢化可的松OHOOHOHFHOCH3OHCH3醋酸地塞米松醋酸地塞米松1.均有均有21个碳原子个碳原子2.A环环4-3-酮基酮基,UV、与羰基试剂反应、与羰基试剂反应3.C17位上有位上有a-醇酮基醇酮基,具还原性具还原性一、结构与性质一、结构与性质雄性激素及蛋白同化激素雄性激素及蛋白同化激素睾酮睾酮O
3、OHHHHO苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙1.雄性激素母核有雄性激素母核有19个碳原子个碳原子,蛋白同化激素蛋白同化激素 C10位上一般无角甲基位上一般无角甲基,母核有母核有18个碳原子个碳原子2.A环环4-3-酮基酮基3.C17位上有位上有-羟基羟基,或由它们形成的酯或由它们形成的酯OOHOOHMeMethyltestosterone甲基睾酮HHH1717位加甲基作用更强位加甲基作用更强OOHHHHOCH3丙酸睾酮丙酸睾酮酯化吸收减慢，作用时间长。酯化吸收减慢，作用时间长。雄性激素及蛋白同化激素雄性激素及蛋白同化激素主要活性基团主要活性基团性性 质质4 3 酮酮UV、与羰基、与羰基试剂反应试剂反应 C
4、17 羟基羟基可成酯可成酯COHHHCH3O孕激素孕激素黄体酮黄体酮1.母核有母核有21个碳原子个碳原子2.A环环4-3-酮基酮基3.C17位上有甲酮基位上有甲酮基OOOHHHO醋酸甲地孕酮醋酸甲地孕酮孕激素孕激素主要活性基团主要活性基团性性 质质4 3 酮酮UV、与羰基试、与羰基试剂反应剂反应C17 甲酮基甲酮基与亚硝基铁氰与亚硝基铁氰化钠反应化钠反应雌性激素雌性激素炔雌醇炔雌醇1.母核有母核有18个碳原子个碳原子,C10无角甲基无角甲基2.A环为苯环环为苯环,C3位上有酚羟基位上有酚羟基3.C17位上有位上有-羟基羟基O HHO1718OHHOCCH雌二醇雌二醇雌激素雌激素主要活性基团主要
5、活性基团性性 质质A环为环为3OH 苯环苯环UV、与重氮苯、与重氮苯磺酸盐反应磺酸盐反应C17 乙炔基乙炔基与与AgNO3反应反应C17 羟基羟基可成酯可成酯l小结小结甾体激素甾体激素碳原子碳原子数数A环环17位取代基位取代基肾上腺皮质肾上腺皮质激素激素21 4-3-酮酮-醇酮基醇酮基雄性激素雄性激素19 4-3-酮酮-OH-CH3孕激素孕激素21 4-3-酮酮甲酮基甲酮基雌激素雌激素18苯环C3-酚OH-OH-CCH二、鉴别试验二、鉴别试验（一）与强酸的呈色反应（一）与强酸的呈色反应甾体激素甾体激素类药物类药物呈色呈色H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl 与硫酸呈色操作简便，依与硫酸呈
6、色操作简便，依颜色与荧光可区别，反应灵敏，颜色与荧光可区别，反应灵敏，为各国药典所用。为各国药典所用。如中国药典：氢化可的松，如中国药典：氢化可的松，取本品取本品2 mg2 mg，加硫酸，加硫酸2 ml2 ml溶解，溶解，放置放置5 5分钟，显棕黄至红，并显分钟，显棕黄至红，并显绿色荧光，将此溶液倾入绿色荧光，将此溶液倾入10ml10ml水中，即变黄色至红色，同时水中，即变黄色至红色，同时有少量絮状沉淀生成。有少量絮状沉淀生成。与硫酸显色反应与硫酸显色反应 显显 色色 荧光荧光 加水稀释加水稀释炔雌醇炔雌醇 橙红橙红 黄绿黄绿 絮状絮状玫红玫红醋酸可的松醋酸可的松 黄或微黄或微 无无 褪色并澄
7、褪色并澄 带橙色带橙色 清清(二二)官能团的反应官能团的反应1 C17 醇酮基醇酮基还原性还原性A.呈色反应呈色反应肾上腺皮质肾上腺皮质激素药物激素药物呈色呈色四氮唑盐四氮唑盐OHOH例如例如:中国药典中醋酸泼尼松中国药典中醋酸泼尼松的鉴别方法：本品的鉴别方法：本品1 mg1 mg，加，加乙醇乙醇2ml2ml溶解，溶解，10%10%氢氧化氢氧化钠试液钠试液2 2滴。氯化三苯四氮唑滴。氯化三苯四氮唑试液试液1ml1ml，显红色。，显红色。肾上肾上腺皮腺皮质激质激素药素药物物Cu2O橙红色橙红色碱性碱性酒石酸铜酒石酸铜B.B.沉淀反应沉淀反应Ag黑色黑色氨制硝酸银氨制硝酸银多伦试剂多伦试剂斐林试剂
8、斐林试剂甾酮类激甾酮类激素药物素药物呈色呈色羰基试剂羰基试剂2.C3酮基和酮基和C20酮基酮基常用的羰基试剂：常用的羰基试剂：2,4-2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼OOHNCONHNH2HClCONHNOHN异烟腙（黄色）异烟腙（黄色）睾酮睾酮OCCH3O2NCONHNH2HCl黄体酮黄体酮CONHNCCH3NHNOCNN异烟双腙（黄色）异烟双腙（黄色）具有甲酮基具有甲酮基或活泼亚甲或活泼亚甲基的甾体激基的甾体激素类药物素类药物呈色呈色亚硝基铁氰化纳亚硝基铁氰化纳间二硝基酚间二硝基酚芳香醛芳香醛3.甲酮基甲酮基黄体酮黄体酮蓝紫色蓝紫色亚硝基铁氰化纳亚硝基铁氰化
9、纳其他甾体其他甾体淡橙色淡橙色不显色不显色亚硝基铁氰化纳亚硝基铁氰化纳亚硝基铁氰化钠是亚硝基铁氰化钠是黄体酮专属而灵敏的反应黄体酮专属而灵敏的反应COCH3O黄体酮黄体酮 NOCNFe OHH2O2+-4Fe5CNNOCHCOO有机氟有机氟F有机破坏有机破坏有机氯有机氯Cl4.有机卤素有机卤素茜素氟蓝茜素氟蓝 硝酸亚铈硝酸亚铈硝酸硝酸硝酸银硝酸银AgCl 蓝紫色蓝紫色 OOOHOHCH2NCH2COOHCH2COOH茜素氟蓝茜素氟蓝OOOHOCH2NCH2COOCeCH2COOFOHF-Ce铈铈药典规定地噻米松磷酸钠用氧瓶药典规定地噻米松磷酸钠用氧瓶燃烧法处理，使有机结合的氟转燃烧法处理，使有
10、机结合的氟转变成无机的氟离子，在变成无机的氟离子，在 pH4.3 pH4.3条条件下与茜素氟蓝试液和硝酸亚铈件下与茜素氟蓝试液和硝酸亚铈试液反应生成蓝紫色的水溶性配试液反应生成蓝紫色的水溶性配位化合物。位化合物。脂肪链上的氯可水解脱落脂肪链上的氯可水解脱落中国药典中氯倍他索的鉴别方法：中国药典中氯倍他索的鉴别方法：取本品少许，加乙醇取本品少许，加乙醇1 ml,1 ml,混合，混合，加热，加硝酸加热，加硝酸2 ml2 ml，摇匀，加硝，摇匀，加硝酸银数滴，即显白色沉淀。酸银数滴，即显白色沉淀。氯在母核上（丙酸倍氯米松）氯在母核上（丙酸倍氯米松）不易脱落，要用氧瓶燃烧法处理，不易脱落，要用氧瓶燃烧
11、法处理，再按氯化物的鉴别试验进行鉴别。再按氯化物的鉴别试验进行鉴别。雌激素雌激素类药物类药物红色偶红色偶 氮染料氮染料重氮苯磺酸重氮苯磺酸5.酚羟基酚羟基含炔基的含炔基的甾体激素甾体激素白色白色的银盐的银盐沉淀沉淀硝酸银硝酸银6.炔基的沉淀反应炔基的沉淀反应RCCHAgNO3RCCAg炔雌醇炔雌醇OHCCHHOOHCCAgHO白白3AgNO盐盐酸酸氨氨基基脲脲苯苯丙丙酸酸诺诺龙龙约180.pm缩氨基脲衍生物缩氨基脲衍生物(三三)制备衍生物测定制备衍生物测定m.p.m.p.1.缩氨基脲的生成缩氨基脲的生成2.2.酯的水解酯的水解丙酸睾酮丙酸睾酮醇制的氢氧化钾醇制的氢氧化钾游离睾酮游离睾酮熔点为熔
12、点为1501563.肟的生成肟的生成羰基与羟胺生成肟，测熔点羰基与羟胺生成肟，测熔点如炔诺孕酮与盐酸羟胺醋酸钠反应如炔诺孕酮与盐酸羟胺醋酸钠反应生成炔诺孕酮肟，生成物的熔点为生成炔诺孕酮肟，生成物的熔点为：195酚羟基与苯甲酰氯生成酯，测熔点酚羟基与苯甲酰氯生成酯，测熔点例如：炔雌醇与苯甲酰氯反应，生成物苯甲酸酯的熔点为：201 不少药物是不少药物是C C1717或或C C2121上羟上羟基的酯类。药物中酯结构的鉴基的酯类。药物中酯结构的鉴别，一般先行水解，产生相应别，一般先行水解，产生相应的羧酸，再根据羧酸的性质来的羧酸，再根据羧酸的性质来鉴别。鉴别。（四）水解产物的反应（四）水解产物的反应
13、 KOHOCOCHR醇制醇制 OCOCHCHCH SOHOHHC 戊戊酸酸戊戊酸酸雌雌二二醇醇醇醇制制NaOH H己己酸酸己己酸酸羟羟孕孕酮酮醇醇制制 OH H-3-酮酮 约约240nm苯环苯环 约约280nmOCCC CCCCCC （五）（五）UV法法规定最大吸收波长规定最大吸收波长最大吸收波长处的吸收度最大吸收波长处的吸收度某两个吸收波长处吸收度的比值某两个吸收波长处吸收度的比值CH 33003000cm-1HC 30002700cm-1OC 19001650cm-1CC 16501450cm-11000650cm-1CH （六）（六）IR法法37503300cm-1OH（七）（七）TLC
14、法法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别 方法：对照品法方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的要求供试品溶液所显主斑点的颜颜色和位置色和位置与对照品溶液的主斑点相同。与对照品溶液的主斑点相同。（八）（八）HPLC法法 主要用于甾体激素类药物制剂主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸氟轻松软膏）的鉴别（如：醋酸氟轻松软膏）方法：对照品法方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的谱图中，供试品峰的tR与对照品峰与对照品峰的的tR一致。一致。三、三、特殊杂质检查特殊杂质检查（一）其他甾体（一）其他甾体1.定义定义 与标示
15、药物结构不同的甾体与标示药物结构不同的甾体化合物都称为化合物都称为“其他甾体其他甾体”2.来源来源 原料、中间体、异构体、降解产物原料、中间体、异构体、降解产物3.特点特点 （1）可能存在多个甾体杂质）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似）结构类似4.方法（具有一定分离能力）方法（具有一定分离能力）TLC法（高低浓度对比法）法（高低浓度对比法）判定方法：判定方法：v 规定杂质斑点数目规定杂质斑点数目v 规定杂质斑点颜色规定杂质斑点颜色 取本品加氯仿取本品加氯仿-甲醇（甲醇（9 ：1）制）制成成3.0mg/ml的溶液的溶液作为作为供试液供试液，精密，精密量取适量，加氯仿量取适量，加氯仿-甲醇（甲
16、醇（9 ：1）稀）稀释成释成0.06mg/ml的溶液作为的溶液作为对照液对照液；照薄层色谱法，各取照薄层色谱法，各取5l，分别点于，分别点于同一硅胶同一硅胶G板上，以氯仿板上，以氯仿-甲醇（甲醇（97 :3）为展开剂，展开后晾干，在）为展开剂，展开后晾干，在105干燥干燥10分钟，放冷，分钟，放冷，喷以碱性四氮唑喷以碱性四氮唑盐试盐试%.%限量限量液，立即检视，供试品溶液如显杂液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于质斑点，不得多于2个，其颜色与对个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。照液的主斑点比较，不得更深。12（2）HPLC法（主成分自身对照法）法（主成分自身对照法）判定方法：
17、判定方法：v 规定杂质峰数目规定杂质峰数目v 规定杂质峰面积规定杂质峰面积 取本品适量，精密称定，以甲醇为取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成每溶剂，配制成每1ml1ml含含1mg1mg的溶液（的溶液（1 1）与）与每每1ml1ml含含0.02mg0.02mg的溶液（的溶液（2 2），用含量测），用含量测定项下的方法和溶液，取定项下的方法和溶液，取5l5l注入液相注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1 1）和溶液（和溶液（2 2）各）各10l10l，进样。记录至主，进样。记录至主
18、成分峰保留时间的成分峰保留时间的1.51.5倍。倍。溶液（溶液（1 1）显）显示的杂质峰数不得超过示的杂质峰数不得超过1 1个，其面积不得个，其面积不得大于溶液（大于溶液（2 2）主峰面积的）主峰面积的3/43/4。供试溶液：溶液（供试溶液：溶液（1 1）1mg/ml1mg/ml对照溶液：溶液（对照溶液：溶液（2 2）0.02mg/ml0.02mg/ml(二二)硒硒来源来源 合成中用二氧化硒合成中用二氧化硒(SeO(SeO2 2)脱氢脱氢nmA 环环己己烷烷苯苯并并苯苯硒硒二二唑唑二二氨氨基基萘萘 ,Se,.pH SeSe盐酸羟胺盐酸羟胺氧瓶燃烧氧瓶燃烧原理原理剧毒剧毒（三）有机溶剂残留量的检
19、查（三）有机溶剂残留量的检查甲醇甲醇 第二类溶剂第二类溶剂 0.3%GC法法丙酮丙酮 第三类溶剂第三类溶剂 0.5%0.5%地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠 检查检查 甲醇和丙酮甲醇和丙酮内标法内标法（四）游离磷酸盐（四）游离磷酸盐地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠氢化可的松磷酸钠氢化可的松磷酸钠倍他米松磷酸钠倍他米松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠对照品法对照品法地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠 精密称取本品精密称取本品20mg，置，置25ml量瓶量瓶中，加水中，加水15ml溶解，精密加溶解，精密加钼酸铵硫钼酸铵硫酸试液酸试液2.5ml与与1-氨基氨基-2-萘酚萘酚-4-磺酸磺酸溶溶液液1ml，加水
20、至刻度，摇匀，在，加水至刻度，摇匀，在20放放置置3050分钟，照分光光度法，在分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液处测定吸收度，与对照液4.0ml同法同法处理的吸收度比较，不得更大。处理的吸收度比较，不得更大。POKHPOH%.供试品中游离磷酸盐按磷酸计算的限量：供试品中游离磷酸盐按磷酸计算的限量：l根据甾体激素药物的官能团和整根据甾体激素药物的官能团和整个分子的特征，可以采用比色法、个分子的特征，可以采用比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法和液相色谱法测定其含量色谱法和液相色谱法测定其含量甾体激素类药物常含有结构相似甾体激素类药物常含有结
21、构相似的其他甾体杂质，对利用结构特的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰征设计的比色法有干扰（一）（一）HPLCHPLC法法 USPUSP、BPBP、JPJP均采用均采用 RP RPHPLCHPLC（大多内标法）（大多内标法）特点特点 ：用样量少，灵敏度高，分：用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快。离效果好，测定速度快。二二 UV UV法法-3-3-酮酮 240nm 240nm（）（）肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素孕激素 苯环苯环 280nm 280nm（）（）雌激素雌激素三三 比色法比色法 （一）异烟肼比色法（一）异烟肼比色法1
22、 1 原理原理 ：C C3 3酮基及某些其他位置酮基及某些其他位置上的酮基能在酸性条件下与羰基试上的酮基能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合，形成黄色的异烟棕，剂异烟肼缩合，形成黄色的异烟棕，在一定波长处具有最大吸收在一定波长处具有最大吸收HClHCl（缩合）（缩合）C3酮基酮基异烟肼异烟肼异烟棕（黄色）异烟棕（黄色）CONHNOHN异烟腙（黄色）异烟腙（黄色）2.方法方法 对照品法对照品法 异异烟烟肼肼挥挥去去乙乙醇醇对对照照液液供供试试液液A CHCl暗暗45 醋酸地塞米松软膏醋酸地塞米松软膏 含量测定含量测定对照液：精密称取醋酸地塞米松对照品对照液：精密称取醋酸地塞米松对照品25mg25m
23、g，置，置100ml100ml量瓶中，加量瓶中，加无水乙醇无水乙醇适适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取取5ml5ml，用，用无水乙醇无水乙醇稀释至稀释至50ml50ml，摇匀。，摇匀。供试液：精密称取本品适量（约相当于供试液：精密称取本品适量（约相当于醋酸地塞米松醋酸地塞米松2.5mg2.5mg），置烧杯中，加），置烧杯中，加无无水乙醇水乙醇约约25ml25ml，置水浴中加热，搅拌，使，置水浴中加热，搅拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷却，醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置滤过，滤液置100ml100ml量瓶中，同法提取三次，量瓶中，同法提取
24、三次，滤液并入量瓶中，用滤液并入量瓶中，用无水乙醇无水乙醇稀释至刻度，摇稀释至刻度，摇匀，即得。匀，即得。测定法：测定法：精密量取上述溶液各精密量取上述溶液各10ml10ml，分别，分别置具置具塞试管塞试管中，置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿中，置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿10ml10ml，振摇，使残渣溶解，各精密加，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%0.1%异烟异烟肼甲醇溶液肼甲醇溶液（取异烟肼（取异烟肼0.5g0.5g，加盐酸，加盐酸0.63ml0.63ml，加甲醇使溶解成加甲醇使溶解成500ml500ml）10ml10ml，摇匀，置，摇匀，置5555暗处保温暗处保温4545分钟，取出，放
25、冷，用氯仿稀释至分钟，取出，放冷，用氯仿稀释至25ml25ml。摇匀，在。摇匀，在415nm415nm的波长处分别测定吸收的波长处分别测定吸收度，计算即得。度，计算即得。3.3.讨论讨论（1 1）溶剂的选择）溶剂的选择异烟肼盐酸盐异烟肼盐酸盐甲醇、乙醇甲醇、乙醇无水甲醇无水甲醇无水乙醇无水乙醇酸、异烟肼的量酸、异烟肼的量(2)(2)盐酸盐酸:异烟肼异烟肼=2:1 A=2:1 A最大最大盐酸的浓度为盐酸的浓度为0.0074mol/L0.0074mol/L异烟肼的浓度为异烟肼的浓度为0.003650.00365mol/L也可以使用也可以使用0.00370.0037mol/L的硫酸的硫酸若使用醋酸，
26、则将其浓度增大，若使用醋酸，则将其浓度增大，约为约为4.44.4mol/L样品样品:异烟肼异烟肼=1:8 =1:8 （3 3）水分、）水分、温度温度、O O2 2与光线与光线的影响的影响含水量含水量腙水解腙水解A%A%温度升高，反应速度加快温度升高，反应速度加快 不挥发溶剂、不吸收水分时不挥发溶剂、不吸收水分时 O O2 2与光线对反应无影响与光线对反应无影响（4 4）关于反应的专属性）关于反应的专属性反应速度反应速度C C3 3=O=O C C1717=O=O、C C2020=O=O C C1111=O=O 不反应不反应对对C C3 3酮基最敏感。酮基最敏感。有有色色甲甲瓒瓒四四氮氮唑唑盐盐
27、醇醇酮酮基基 COH-还原还原1 1 原理原理 肾上腺皮质激素类药物肾上腺皮质激素类药物C C17 17-醇酮基，具强还原性，醇酮基，具强还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐还在强碱性溶液中能将四氮唑盐还原成有色的甲原成有色的甲瓒。生成的颜色随瓒。生成的颜色随所用的试剂和条件的不同而不同所用的试剂和条件的不同而不同（二）四氮唑比色法（二）四氮唑比色法 2.2.四氮唑盐的种类四氮唑盐的种类氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑（TTCTTC）也称红四氮唑）也称红四氮唑蓝四氮唑（蓝四氮唑（BTBT）CNNNN+Cl-e2 CNNNNH红四氮唑红四氮唑三苯甲瓒三苯甲瓒深红深红nmmax490480 Cl-+CN
28、NNNOCH3+-ClCNNNNOCH3蓝四氮唑蓝四氮唑（BTBT）OHe4 HCNNNNOCH3HCNNNNOCH3双甲瓒（暗蓝）双甲瓒（暗蓝）nmmax525 供试液：供试液：精密称取本品精密称取本品4g4g（约相当于醋（约相当于醋酸泼尼松龙酸泼尼松龙20mg20mg），置烧杯中，加无水），置烧杯中，加无水乙醇约乙醇约30ml30ml，置水浴上加热，充分搅拌，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置滤过，滤液置100ml100ml量瓶中，同法提取量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀三次，滤液并入量瓶中，加无水
29、乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。释至刻度，摇匀，即得。醋酸泼尼松龙软膏含量测定醋酸泼尼松龙软膏含量测定对照液：对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg20mg，置，置100ml100ml量瓶中，加无水乙醇振摇量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。3.3.方法方法 对照品法对照品法测定法：测定法：精密量取上述溶液各精密量取上述溶液各1ml1ml，分，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇醇9ml9ml与氯化三苯四氮唑试液与氯化三苯四氮唑试液2ml2ml，摇匀，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基
30、铵试液再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml1ml，摇匀，在摇匀，在2525暗处放置暗处放置40405050分钟，照分钟，照分光光度法，在分光光度法，在485nm485nm的波长处分别测的波长处分别测定吸收度，计算，即得。定吸收度，计算，即得。操作应避光。操作应避光。4.4.讨论讨论（1 1）基团对反应速度的影响基团对反应速度的影响a.Ca.C1111=O=O C C1111OHOH如：可的松如：可的松 氢化可的松氢化可的松b.Cb.C2121OHOH C C2121-酯酯C.C.简单酯简单酯 复杂酯复杂酯如：醋酸酯如：醋酸酯 琥珀酸酯琥珀酸酯越复杂空间位阻越大越复杂空间位阻越大d.C16有取代基
31、，使反应抑制，有取代基，使反应抑制，需加入冰醋酸，才可以进行测定需加入冰醋酸，才可以进行测定（2 2）溶剂、水分的影响溶剂、水分的影响含水量含水量5%5%含水含水10%10%A10%A10%含水含水30%30%几无反应几无反应无醛无水乙醇无醛无水乙醇醛醛 A A 无水乙醇无水乙醇（具有还原性）（具有还原性）（3 3）碱的种类及加入顺序）碱的种类及加入顺序反应应在强碱性（反应应在强碱性（pH13.75pH13.75）条件下进行条件下进行以氢氧化四甲基铵的效果最佳以氢氧化四甲基铵的效果最佳碱碱试试液液四四氮氮唑唑盐盐皮皮质质激激素素溶溶液液加入顺序：加入顺序：醇酮基不稳定，碱化分解醇酮基不稳定，碱
32、化分解lRT RT 无色无色 空白值低空白值低 质量好坏影响不大质量好坏影响不大lBT BT 淡黄色淡黄色 空白值高空白值高 质量好坏影响较大质量好坏影响较大l要求：要求：a.BTa.BT的乙醇溶液极淡黄色，与乙醇比较的乙醇溶液极淡黄色，与乙醇比较l A=0.03 A=0.030.06l b.用标准氢化可的松校正摩尔吸光系数用标准氢化可的松校正摩尔吸光系数为：为：22000l c.临用新配临用新配（5 5）O O2 2与光线的影响与光线的影响反应过程反应过程反应产物反应产物怕光怕光 避光、暗处、快速避光、暗处、快速O O2 2影响影响颜色强颜色强度和稳度和稳定性定性隔绝空气、隔绝空气、快速充快
33、速充N N2 2（6 6）温度与时间温度与时间tt甲瓒分解甲瓒分解%ChP 25 4045BP 30 1hmax=465max=5151.1.原理原理 雌激素与硫酸乙醇反应呈色雌激素与硫酸乙醇反应呈色（三）（三）KoberKober反应比色法反应比色法桃桃红红黄黄色色雌雌激激素素乙乙醇醇 OHSOHl双变色，测定结果重现性不好双变色，测定结果重现性不好l杂质干扰（赋型剂、稳定剂有干扰）杂质干扰（赋型剂、稳定剂有干扰）lA A环是芳环，在环是芳环，在C C2 2或或C C3 3有含氧取代有含氧取代lD D环的环的C C1717有含氧取代（有含氧取代（OH,-C=OOH,-C=O）lC C1313
34、必须有角甲基必须有角甲基l用该法测定雌激素类药物制剂的用该法测定雌激素类药物制剂的含量时比色测定前采用分离提取含量时比色测定前采用分离提取l严格控制反应条件严格控制反应条件l消除背景干扰消除背景干扰l铁酚试剂替代硫酸乙醇铁酚试剂替代硫酸乙醇lFe Fe 3+3+的作用：的作用：l促进黄色的呈色速度和强度促进黄色的呈色速度和强度l促进黄色变成红色促进黄色变成红色l加强红色的稳定性加强红色的稳定性l苯酚的作用：苯酚的作用：l消除反应过程中产生的荧光消除反应过程中产生的荧光l加速红色的生成加速红色的生成参参 考考 习习 题题甾体激素类药物的结构中能和甾体激素类药物的结构中能和 四氮唑盐发生显色反应的
35、基团四氮唑盐发生显色反应的基团 A.A.酚羟基酚羟基 B.B.活泼次甲基活泼次甲基 C.C.甲酮基甲酮基 D.C D.C17 17-醇酮基醇酮基 E.E.酮基酮基 用异烟肼比色法测定甾体激素药用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是物含量时，其溶液的环境是 A A强酸性强酸性 B B中性中性 C C强碱性强碱性 D D弱碱性弱碱性 E E以上都不对以上都不对 可用于氢化可的松鉴别的试剂有可用于氢化可的松鉴别的试剂有 A A氨制硝酸银氨制硝酸银 B B异烟肼异烟肼 C C红四氮唑红四氮唑 D D硫酸硫酸 E E重氮苯磺酸重氮苯磺酸可用于甾体激体类药物的测定方法有可用于甾体激体类药物的
36、测定方法有 A A高效液相色谱法高效液相色谱法 B B四氮唑盐法四氮唑盐法 C C紫外分光光度法紫外分光光度法 D D异烟肼比色法异烟肼比色法 E EKoberKober反应比色法反应比色法 能与亚硝基铁氰化钠反应生成兰能与亚硝基铁氰化钠反应生成兰紫色的药物是紫色的药物是 A雌二醇雌二醇 B黄体酮黄体酮 C醋酸可的松醋酸可的松 D苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙 E以上都不对以上都不对各国药典对甾体激素类药物常用各国药典对甾体激素类药物常用HPLCHPLC或或GCGC法法测定其含量，主要原因是测定其含量，主要原因是A.A.它们没有特征紫外吸收，不能用它们没有特征紫外吸收，不能用 紫外分光光度法紫外分光光度
37、法 B.B.不能用滴定分析法进行测定不能用滴定分析法进行测定 C.C.由于由于“其它甾体其它甾体”的存在，色谱法的存在，色谱法 可消除它们的干扰可消除它们的干扰 D.D.色谱法比较简单，精密度好色谱法比较简单，精密度好 E.E.色谱法准确度优于滴定分析法色谱法准确度优于滴定分析法异烟肼比色法测定甾体激素类药物时，药物的呈色基团是 A.酮基 B.酚羟基 C.活泼次甲基 D.炔基 E.甾体母核四氮唑比色法可用于下列哪个四氮唑比色法可用于下列哪个药物的含量测定药物的含量测定 A.A.可的松可的松 B.B.睾丸素睾丸素 C.C.雌二醇雌二醇 D.D.炔雌醇炔雌醇 E.E.黄体酮黄体酮可适用的药物：可适
38、用的药物：A.可的松可的松 B.雌二醇雌二醇 C.两者均可两者均可 D.两者均不可两者均不可亚硝酸钠滴定法亚硝酸钠滴定法高效液相色谱法高效液相色谱法能与羰基试剂缩合能与羰基试剂缩合可用铁酚试剂比色法测定可用铁酚试剂比色法测定可用四氮唑比色法测定可用四氮唑比色法测定DCABAKober反应是 A.雌性激素与硫酸乙醇共热呈色 B.皮质激素与硫酸一乙醇共热呈色 C.雌性激素与硫酸乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后加热颜色改变 D.维生素A与无水三氯化锑的无醇氯 仿溶液呈色 E.异丙嗪于酸性条件下与钯离子呈色黄体酮在酸性溶液中可与下列哪些试剂反应呈色 A.2,4-二硝基苯肼 B.三氯化铁 C.硫酸苯肼 D.异烟肼 E.四氮唑盐Kober反应适用于哪一药物的含量测定 A.黄体酮 B.雌二醇 C.甲基睾丸素 D.甲基炔诺酮 E.氢化可的松用四氮唑比色法测定皮质激素类药物，是利用C17 醇酮基的何种性质 A氧化性 B还原性 C可加成性 D酸性 E碱性 可与重氮苯磺酸作用生成红色偶氮染料的甾体激素类药物是 A.醋酸可的松 B.睾酮 C.黄体酮 D.雌二醇 E.炔诺酮
