1、遗传病的诊断遗传病的诊断 症状和体征分析 系谱分析染色体检查 生化检测 基因诊断 方 法症状和体征分析症状和体征分析 症状和(或)体征的出现是患者就诊的主要原因，也是诊断遗传病的重要线索。表型基因疾病之间的关系不是一一对应的。症状与体征仅仅是进行遗传病诊断的线索，遗传病的确诊必须借助于其他检查手段。系谱分析（系谱分析（Pedigree AnalysisPedigree Analysis）资料必须可靠；涉及家庭成员的隐私问题，如是否是近亲婚配，同胞之间是否为同父同母等，应注意表述方式，说服被调查者积极配合；注意外显不全、延迟显性、新突变基因、动态突变、易位基因、基因组印记等问题，还要充分考虑主基
2、因和遗传背景、基因和环境综合作用等问题；应尽可能地扩大家系范围，以便更准确地判断；有些疾病（如色盲、耳聋等）可能存在“同病通婚”的情况 染色体检查染色体检查染色体检查或称核型分析是确诊染色体病的主要方法，在某些情况下，也用于对单基因病的诊断。检查指征检查指征智能发育不全、生长迟缓或伴有其它先天畸形者；夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等；家族中已发现染色体异常或先天畸形个体；多发性流产的妇女及其丈夫；原发闭经和男女不育症者；34岁以上的高龄孕妇；有两性内外生殖器畸形者。FISH结果结果 生化分析生化分析生化分析主要是对基因表达产物，如酶或其他蛋白质的结构或功能活性进行的检测。该方法特别适用
3、于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷类的遗传病的诊断。生化检查常通过对反应底物、中间产物、终产物或受体与配体的测定进行。基因诊断基因诊断 （Gene diagnosisGene diagnosis）基因诊断（Gene diagnosis）是指利用分子生物学技术，检测体内DNA或RNA在结构或表达水平上的变化，从而对疾病做出诊断的方法，通常又称为分子诊断（molecular diagnosis）。DNA水平的诊断 直接诊断：直接检出DNA分子上的致病突变，这是进行基因诊断最可靠的办法。间接诊断：连锁分析 基因产物水平的诊断 由蛋白质至DNA，由表型至基因型mRNA检测 基因诊断基因诊断 （Gene
4、 diagnosisGene diagnosis）基因诊断的技术基因诊断的技术核酸分子杂交和聚合酶链反应（PCR）是当前基因诊断技术的两大基石。核酸分子杂交核酸分子杂交DNA变性：DNA分子由双螺旋结构变为单链的现象DNA复性：变性的两条单链恢复双螺旋结构的现象,可发生在同源双链间，也可发生在非同源两条链间核酸分子杂交：应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片段，严格按照碱基互补配对原则，在一定条件下形成杂交双链分子核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交斑点杂交（点杂交）DNA印迹杂交（Southern Blotting）聚合酶链反应聚
5、合酶链反应PCR是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。步骤：模板DNA的变性；模板DNA与引物的退火(复性)；引物的延伸 特点：特异性强、灵敏度高、简便、快速、对标本的纯度要求低 聚合酶链反应聚合酶链反应荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术TaqMan荧光探针：PC
6、R扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步；实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实时荧光定量PCR中SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任
7、何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。DNADNA芯片技术芯片技术 是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。DNADNA芯片技术具有明显的优势：芯片技术具有明显的优势：基因诊断的速度显著加快；检测效率高，每次可同时检测成百上千个基因序列，使检测过程平行化。基因诊断的成本降低；芯片的自动化程度显著提高；因为是全封闭，避免了交叉污染；DNADNA芯片芯
8、片荧光原位杂交荧光原位杂交 对于染色体及亚染色体水平尺度上遗传物质的改变 利用了核酸碱基互补配对的特性荧光免疫杂交荧光免疫杂交进行荧光素标记,然后将探针与染色体或DNA纤维切片杂交，在荧光显微镜下可直接观测并进行定位和定性或相对定量分析FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。比较基因组杂交比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH）比较基因组杂交：用两种非同位素标记病人基因组DNA和正常人基因组DNA；两者适当比例混合后制备成探针，与正常人染色体分裂相进行原位抑制杂交，再
9、分别用不同物质进行检测。比较基因组杂交比较基因组杂交（CGHCGH）多重探针连接扩增多重探针连接扩增(MLPA)(MLPA)多重探针连接扩增多重探针连接扩增(MLPA)(MLPA)MLPA由探针杂交、连接及PCR扩增反应相组合而成的 MLPA反应的特异性由杂交和连接决定，灵敏性由PCR反应确定。如染色体数目异常(如13、18、21三体征等)、缺失或重复突变为主的遗传病(如SMA、DMD等)、甲基化相关的遗传病(如Prader-Willi syndrome(PWS)and Angelman syndrome(AS)，也用于肿瘤的诊断(如乳腺癌、肺癌等)。SSCP/DHPLC/HRM 三者都是基于
10、一段DNA序列的物理化学性质差异，而非序列本身来检测的，主要针对点突变、小片段的缺失、插入。三种方法都需要使用PCR技术从基因组中扩增一段较短的目的片段，即靶DNA。SSCPSSCP通常条件下，单链DNA片段会自发地形成自由能最低的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。DHPLCDNA测序测序序列测定是基因诊断的金标准，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质，是基因突变检测的最直接、最准确的方法。第一代测序技术双脱氧法测序。第二代测序又称高通量基因组测序第三代测序最大的特点是单分子实时测序。其中双脱氧法测序是目前最常用的测序方法。DNA测序测序双脱氧法
11、测序是一种基于合成的测序方法，测序反应本质是一种特殊的PCR扩增反应。其特殊之处主要体现在使用单向引物和加入ddNTP。甲基化检测甲基化检测 甲基化检测的原理是基于DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶无此改变。逆转录逆转录PCR(RT-PCR)PCR(RT-PCR)和和Northern BlottingNorthern Blotting RNA诊断分析基因的表达和功能，即检测基因能否转录、转录物（mRNA）是否正常以及转录效率的高低等。RT-PCR是将RNA的反转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式扩增（PCR）相结合分析
12、基因表达的的技术。Northern印迹杂交（Northern blot）是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。基因诊断的实例基因诊断的实例 杜氏肌营养不良（DMD）镰状细胞贫血654地中海贫血 血友病A 杜氏肌营养不良（杜氏肌营养不良（DMDDMD）X连锁隐性遗传病，948个突变中，约60%为大片段重复或缺失，其余为小片段的结构异常或点突变。常规染色体核型分析检查染色体易位或缺失。多重PCR检测是检出DMD基因结构异常的常用方法近年缺失检测中，MLPA逐渐取代了多重PCR。单碱基的取代和微小缺失或重复，可进行PCR扩增后测序检测。镰状细胞贫血镰状细胞贫血链第6位谷氨酸（密码子
13、GAG）变为缬氨酸（密码子GTG）PCR-RFLP Mst切割的序列是CCTGAGG 镰状细胞贫血镰状细胞贫血PCR-ASO进行诊断 654654地中海贫血地中海贫血 654位CT突变，产生异常剪接的mRNA，翻译提前中止，珠蛋白截短。利用RT-PCR方法进行诊断血友病血友病A A 1994年，HA F基因突变位点174种，缺失117种，插入10种。大范围的基因重排（如缺失、插入和重复）只占5%。采用PCRRFLP相结合的方法进行诊断 脆性脆性X X综合症综合症 5端非翻译区存在（CGG）n 重复序列正常人约为5-50个拷贝灰色区：为临界，50-58个拷贝前突变：59-200 拷贝，同时相邻的
14、CpG岛未被甲基化，前突变者无或只有轻微症状。全突变:CGG重复数目达到200-1000拷贝，相邻的CpG 也被甲基化。脆性脆性X X综合症综合症用双酶切（EcoRI和甲基化敏感酶EagI）后进行杂交 遗传病诊断的时机遗传病诊断的时机 症状前诊断产前诊断着床前诊断 产前诊断产前诊断遗传学检查细胞培养、染色体检查、分子诊断等；生化检查特殊蛋白质、酶、代谢底物、中间产物和终产物等；物理诊断B超、X线、胎儿镜、电子监护等。羊膜穿刺法、绒毛取样法羊膜穿刺法、绒毛取样法脐带穿刺脐带穿刺妊娠18周左右 脐带穿刺法是在B超的监视下，用细针经腹壁、子宫进入胎儿脐带，抽取一定数量的胎儿血液。胎儿镜检查胎儿镜检查妊娠18周20周 又称为羊膜腔镜或宫腔镜检查。它可以直接观察胎儿的外形，性别和发育状况，又可以抽取羊水或胎血，还可以进行宫内治疗。孕妇外周血胎儿细胞富集孕妇外周血胎儿细胞富集孕妇外周血中分离胎儿细胞进行产前诊断 非损伤性产前诊断
