1、乙肝病毒耐药性进展一一.主要主要HBV耐药突变耐药突变【一】拉米夫定耐药突变拉米夫定耐药突变：【A】1.常见有4种方式（其他有rtM204s.rtv207 I/M）1.1 rtM204v (逆转录酶功能区蛋氨酸204缬氨酸,即HBV逆转录酶功能区204位置上的蛋氨酸被缬氨酸所取代)1.2 rtM204 I（HBV逆转录酶功能区204位置上的蛋氨酸被异亮氨酸所取代)【一】拉米夫定耐药突变：【A】1.3 rtv173L （HBV逆转录酶功能区173位置上的 缬氨酸被亮氨酸所取代)1.4 rtL180M（HBV基因rt区180位置上亮氨酸被所蛋氨酸取代)2.四种突变还可以四种不同组合方四种突变还可以
2、四种不同组合方 出现出现 2.1 rtL180M+rtM204v (rt亮氨酸180蛋氨酸+rt蛋氨酸204缬氨酸)2.2 rtL180M+rtM204I (rt亮氨酸180蛋氨酸+rt蛋氨酸204异亮氨酸)2.3 rtv173L+rtL180M+rtM204v（rt缬氨酸173亮氨酸+rt亮氨酸180蛋氨酸+rt蛋氨酸204缬氨酸）2.四种突变还可以四种不同组合方式四种突变还可以四种不同组合方式 出现出现 2.4 rtM204 I（rt蛋氨酸204异亮氨酸)rtM204v或或rtM204 I变异可直接导致对拉米变异可直接导致对拉米夫定的强耐药性。夫定的强耐药性。rtv173L和和rtL180
3、M则为两个辅助变异。则为两个辅助变异。由于YMDD（络氨酸、蛋氨酸、天门冬氨络氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、天门冬氨酸酸、天门冬氨酸）直接参与HBV聚合酶的催化反应，rtM204v及rtM204I突变不仅造成对拉米夫定耐药，同时也会降低HBV聚合酶活性，因此rtM204v及rtM204I变异病毒复制能力较差，而在rtM204v及rtM204I变异基础上，增加rtv173L和rtL180M变异可以提高rtM204v及rtM204I变异病毒株的复制能力，从而形成更强的生存优势。因此，rtv173L和rtL180M变异经常与YMDD变异同时发生在拉米夫定耐药病毒株上。恩曲他滨和替比夫定的分子结构与拉米夫
4、定十分相似。恩曲他滨和替比夫定引起的耐药突变与拉米夫定耐药引起的突变基本相同。【二二】阿德福韦耐药突变阿德福韦耐药突变【A】1.常见有两个主要耐药（一个次要）（其他：常见有两个主要耐药（一个次要）（其他：rtQ215s）1.1 rtA181v（逆转录酶功能区丙氨酸181缬氨酸）1.2 rtN236T（rt天冬酰胺236苏氨酸）1.3 rtA181T（rt丙氨酸181苏氨酸）（次要还有争论）2.常见有四种组合方式常见有四种组合方式 2.1 rtA181V（rt丙氨酸181缬氨酸）2.2 rtN236T（rt天冬酰胺236苏氨酸）2.3 rtA181V+rtN236T（rt丙氨酸181缬氨酸+rt
5、天冬酰胺236苏氨酸）2.4 rtA181T+rtN236T（rt丙氨酸181苏氨酸+rt天冬酰胺236苏氨酸）【三三】恩替卡韦耐药突变恩替卡韦耐药突变【A】要在有YMDD变异存在先决条件，在YMDD变异株上。1.1 rtI169T（rt异亮氨酸169苏氨酸）1.2 rtT184 A/G/I/S （rt苏氨酸184丙氨酸/甘氨酸/异亮氨酸/丝氨酸）1.3 rtS202G/I （rt丝氨酸202甘氨酸/异亮氨酸）1.4 rtM250V （rt蛋氨酸250缬氨酸）*（还有rtM204I/V/S）附附 常见氨基酸的分类【B】（-OH羟基、-NH2氨基、-COOH羧基）一一.脂肪族氨基酸（脂肪族氨基酸
6、（1）名称单字母 符号全名结构式甘氨酸Gglycine CH2-COOH|NH3丙氨酸 Aalanine CH3-CH-COOH|NH2缬氨酸 VValine CH3-CH-CH-COOH|CH3 NH2 一.脂肪族氨基酸（2)名称单字母符号全名结构式亮氨酸LLeucine CH3-CH-CH2-CH-COOH|CH3 NH2异亮氨酸IIsoleuci-ne CH3-CH2-CH-CH-COOH|CH3 NH2天冬氨酸D Aspartic-acidHOOC-CH2-CH-COOH|NH2一.脂肪族氨基酸(3)名称单字母符号全名结构式谷氨酸EGlutamic-acidHOOC-CH2-CH2-C
7、H(NH2)-COOH 精氨酸RarginineNH2-CH2？(NH)-NH-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH赖氨酸KlysineNH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH 一.脂肪族氨基酸(4)名称单字母符号全名结构式丝氨酸SSerine OH-CH2-CH(NH2)-COOH 苏氨酸TThreonine CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH 天冬酰胺NAsparagi-ne H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH 一.脂肪族氨基酸(5)名称单字母符号全名结构式谷氨酰胺QGluta-mine H2N-C(=O)-CH2-CH2-CH(
8、-NH2)-COOH半胱氨酸C（CYS）Cystei-ne SH-CH2-CH(-NH2)-COOH胱氨酸CYS-CYSCysti-ne S-CH2-CH(-NH2)-COOH|S-CH2-CH(-NH2)-COOH甲硫氨酸（蛋氨酸）MMethio-nine CH2-CH2-CH(NH2)-COOH二二.芳香族氨基酸芳香族氨基酸名称单字母符号全名结构式苯丙氨酸FPhenyl-alanine 络氨酸YTyrosine 三三.杂环氨基酸杂环氨基酸(1)名称单字母符号全名结构式组氨酸Hhistidine 色氨酸WTryptophan三三.杂环氨基酸杂环氨基酸(2)名称单字母符号全名结构式脯氨酸Ppr
9、oline 羟脯氨酸HYPHydroxypro-line HBV耐药突变的命名及其产生的耐药突变的命名及其产生的子机制子机制【A】由于HBV在体内复制的过程需要经过逆转录这一步骤，HBV复制中的天然复制错误率比其他DNA病毒要高，HBV基因在复制过程中不断产生天然变异，因而在HBV感染者体内常形成一群由基因十分相似，但不完全等同的病毒株组成的准种（quasis pecies）在未接受过核苷类药物治疗的患者中，HBV野型株占HBV准种绝大多数。耐药变异株在患者用药前可能存在，也可在用药过程中产生，患者用药后，对药物敏感的野型病毒株受到抑制。会有耐药突变的病毒株得到更多空间进行复制。当对某一药物有
10、耐药性的病毒株成为准种中的主要病毒株时，此药就失去疗效。已知核苷类药物耐药突变均发生在HBVpol上，HBV分为8个基因型（A-H）。各基因型HBVpol长短不尽相同。以A基因型HBV为参照，HBVpol总长845个氨基酸。HBVpol可分为4个功能区：终端蛋白（Terminal protein）间隔区（spacer）逆转录酶区（Reverse transcriptase）及RNA降解酶区（Rnase H)HBV耐药变异以国际通行的氨基酸单字母加变异位点来标记。例如：YMDD代表逆转录酶区的4个氨基酸（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸，其中的蛋氨酸（M）变为缬氨酸（V），或异亮氨酸（I）则会
11、引起拉米夫定耐药）。起初，HBV耐药突变的位点是从HBVpol的第一个氨基酸数起，由于HBV8个基因型的HBVpol长短不同，以不同HBV基因型为参照，YMDD所处的位点不同，同样的YMDD变异被报道成M552V、M550V、M539V等不同命名。为避免混乱，stuyvevg等提议将HBV耐药突变统一从逆转录酶功能区（各基因型均为344个氨基酸）的第一个氨基酸数起，并加前缀rt（例如YMDD变异被命名为rtM204V）.rtM204V或rtM204I突变是引起拉米夫定耐药的一个直接因素。从分子结构上讲V和I均比M多了一个甲基。而这个多出来的甲基造成拉米夫定结合位点的空间拥挤，从而使拉米夫定不能
12、有效地与HBVpol结合。因此rtM204V或rtM204I变异株的复制不再受拉米夫定影响，成为对拉米夫定具有耐药性的病毒株。抗抗HBV核苷类药物之间的交叉核苷类药物之间的交叉耐药性耐药性 由一种药物所引起的HBV耐药变异株对另一种药物敏感性降低称为交叉耐药。抗HBV核苷类药物可分为三大类 1.L-构型核苷构型核苷（包括拉米夫定、替比夫定、恩曲他滨和克拉夫定等）2.D-构型核苷构型核苷（恩替卡韦）3.无环核苷酸无环核苷酸（阿德福韦和泰诺福韦/替诺福韦）治疗拉米夫定耐药患者应避免选用L-构型核苷类药物，因为拉米夫定所引发的YMDD变异病毒株对所有L-构型核苷的敏感性均显著降低。实验显示YMDD变
13、异病毒对无环核苷酸阿德福韦及替诺福韦的敏感性与HBV野生株相比无明显变化。临床实验结果也表明阿德福韦及替诺福韦可以在患者体内有效的抑制YMDD变异病毒复制。体外实验及临床实验均显示拉米夫定与恩替卡韦有部分交叉耐药性，但由于恩替卡韦对HBV抑制能力非常高，即使在拉米夫定耐药患者的高效稍差，也还是有一定作用。阿德福韦耐药变异病毒rtN236T和rtA181V有不同的交叉耐药性。体外实验显示，rtN236T变异病毒对拉米夫定、替比夫定、恩曲他滨和恩替卡韦的敏感性没有明显变化，其对替诺福韦及克拉夫定敏感性也仅降低4-5倍。在临床上拉米夫定和泰诺福韦对rtN236T变异病毒均显示很强的抑制效果。rtA1
14、81V变异病毒对大部分抗HBV核苷类药物均呈现一定程度耐药性，在体外实验中，rtA181V对拉米夫定、恩替卡韦和恩曲他滨的敏感性降低12-15倍。当接收阿德福韦治疗患者产生rtA181V变异后，改用或加用拉米夫定能使HBVDNA降低2-3个log10拷贝数/毫升，但并不能完全抑制HBV复制。但rtA181V变异病毒对泰诺福韦敏感度变化比其他核苷类药物变化最少，但临床上抑制rtA181V病毒效果常不清楚。（因为泰诺福韦用于临床治疗HBV复制，临床使用还没在美国FDA批准，仅用在HIV病人。）恩替卡韦耐药病毒均含有YMDD变异，由于YMDD变异病毒对L-构型核苷类药物有很强的耐药性，拉米夫定、替比
15、夫定、恩曲他滨及克拉夫定不能起到抑制恩替卡韦耐药病毒作用，但恩替卡韦耐药病毒仍然对阿德福韦敏感，对恩替卡韦耐药病毒仍然可以考虑用阿德福韦。干扰素和核苷类药物不存在交叉耐药。预防乙型肝炎耐药病毒产生的基本原则【A】在于全面抑制HBV复制，病毒停止复制，耐药突变就无从产生，选用抑制能力强耐药发生率低的药物高屏障率抗病毒药并坚持每天不间断服药应可降低耐药病毒产生的机会。联合用药在延缓降低耐药性产生方面明显优于单一治疗，但严格对照资料还在观察之中。表 体外交叉耐药性实验结果1药物拉米夫定耐药株阿德福韦耐药株恩替卡韦耐药株rtN236T rtA181V拉米夫定Lamivudine 耐药有效部分耐药耐药恩
16、曲他滨Emtricitabine耐药有效部分耐药未知替比夫定Telbivudine耐药有效耐药耐药克拉夫定Clevudine耐药部分耐药耐药未知表 体外交叉耐药性实验结果2药物拉米夫定耐药株阿德福韦耐药株恩替卡韦耐药株rtN236T rtA181V恩替卡韦Entecavir部分耐药有效部分耐药耐药阿德福韦Adefovir有效耐药部分耐药有效替诺福韦Tenofovir 有效部分耐药有效/部分耐药未知抗抗HBVHBV核苷类药物化学结构分类核苷类药物化学结构分类 一.L-核苷类 拉米夫定 恩曲他滨 替比夫定 克拉夫定 LVD是2-3-双脱氧-3-硫代胞嘧啶的异构体。LdT是-L-2-脱氧胸苷 CLD
17、是2-氟-5-甲基-阿糖呋喃糖尿嘧啶核苷类似物二二.无环磷酸盐化合物类无环磷酸盐化合物类 阿德福韦 替诺福韦 ADV是单磷酸腺苷酸的类似物 TDF是一种核苷酸类似物三.环戊烷/烯类 恩替卡韦 恩替卡韦是2-脱氧鸟嘌呤核苷类似物四.三类化学结构具有不同耐药特性 1.嘧啶类化合物，主要通过rtM204V/I位点变异。2.单磷酸脱氧腺苷类化合物，分别通过rtN236T或rtN194T位点变异耐药。3.脱氧鸟苷类化合物，其脱氧核糖基被环戊衍生物置换，在拉米夫定rtM204VtrL180M位点变异基础上再选择出一个以上的恩替卡韦位点变异才会发生耐药。A肝脏2006年8月11卷第4期P273-275 B生
18、物化学HBV分子结构及复制周期【A】HBV属于嗜肝DNA病毒，其基因全长仅3.2Kb，在HBV包膜内，HBV基因以不完全双链环状DNA形式存在。HBV感染人体肝细胞后，将包膜内HBV-DNA释放入肝细胞核内并形成共价闭合环二代DNA（CCCDNA）宿主 RNA聚合酶以CCCDNA为模板转录成3.5Kb、2.4Kb、2.1Kb和0.7KbHBVmRNA，这些mRNA被用于编码合成HBcAg、HBeAg、HBV聚合酶（pol）HBsAg及HBVX蛋白。HBVpol以3.5KbmRNA（前基因组RNA；PgRNA）为模板，逆转录合成负链HBV-DNA，然后再以负链DNA为模板合成正链HBV-DNA。
19、最终形成3代HBV-DNA。HBV复制过程中，HBVpol起重要作用。治疗乙型肝炎的核苷类药物是通过与HBVpol的天然地物（dntp）竞争来达到抑制HBVpol酶的活性，从而达到抑制HBV复制的作用。AASLD2008会议精粹 1.克来夫定（CLV）48周治疗在HBV-DNA抑制和HBeAg血清转化率方面优于拉米夫定（LAM）与恩替卡韦（ETV）相似。2.回顾性研究表明，对于ETV反应不佳的HBV感染者用替诺福韦是可行的（TDF）.3.PegIFN-2对LAM耐药的HBeAg阳性韩国人疗效与被治疗患者相似。AASLD2008会议精粹 4.对LAM耐药患者使用ETV6个月是有效的，在1-2年需
20、要对ETV进行耐药监测。5.对多重耐药的乙肝肝硬化患者ETV结合TDF治疗有效且耐受性好。6.使用美罗华（利安苷抗Rituximab）与HBV激活有关。7.在肝移植后进行抗病毒治疗和HBIG使HBV复发率降低。抗HCV新药研究进展AASLD2008年会 蛋白酶抑制剂：VX-950可显著提高聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林的SVR（持续病毒学应答）和降低复发率。聚乙二醇干扰素-2a联合利巴韦林和VX-950、750mg、每日3次治疗12周后，再以聚乙二醇干扰素-2a联合利巴韦林继续治疗12周方案的SVR最高。复发率最低。抗HCV新药研究进展AASLD2008年会 基因型病毒感染者的SVR和复发率分别
21、达到69%和14%，但出现了病毒学突破的问题，变异株包括R155K、A156T、A156S、T54A/A156S、T54T/A、A156S/T、R155R/K、A156A/S/T。另一个蛋白酶抑制剂boceprevir也显示出显著提高基因型病毒感染初作慢性丙型肝炎的SVR，并且在长效干扰素，利巴韦林以及boceprevir3个药物联合治疗前，先以长效干扰素-2a联合利巴韦林治疗4周，再给与三种药联合治疗可以显著降低病毒学突破。RNA聚合酶抑制剂 此次会议有2项研究分别报道了基因型病毒和基因型型病毒在长效干扰素联合利巴韦林标准治疗基础上加用HCVRNA依赖的RNA聚合酶抑制剂T7128的抗病毒应
22、答和安全性，研究报导治疗4周显示联合用药显著提高RVR（快速应答率）丙型肝炎治疗AASLD2008年 1.持续病毒学应答（SVR）的预测 快速病毒学应答（RVR）是SVR的最好预测指标。治疗4周时出现无应答（早期无应答，治疗4周时病毒载量下降不到1个对数单位）是难以获得SVR的预测标志，对159例基因型标准治疗在出现早期无应答患者中仅有8%出现SVR，71%72周时随访无应答，另有5%出现复发。丙型肝炎治疗AASLD2008年 2.个体化治疗：将48周延至72周可提高基因型延迟应答者SVR，可使SVR提高12%，还可以降低复发率。总结：AASLD2008年会上关于丙型肝炎治疗仍以干扰素为基础治
23、疗，在此基础上要重视通过预测，个体化和联合治疗提高应答，同时抗丙型肝炎病毒的新药研发持续稳定发展。AASLD热点介绍-肝癌诊断和治疗 一.肝癌诊断 没有新的突破。我国70年代开始的B超+AFP方法仍为主要依据，其他血清标志物方面有AFP异变体r-GGT-（r-谷氨酰转肽酶同工酶）、岩藻糖苷酶（AFU）、异常凝血酶。基因芯片、蛋白质芯片、转录组学和代谢组学技术，将具有更多准确性和标异性，并能预测肝病对治疗反应、预后、转移复发倾向。二.肝癌治疗 1.首选：外科切除和肝移植。2.不能切和术后复发者，换用综合性治疗方法。.TAE（导管动脉内栓塞治疗）.TARE（放射栓塞治疗）.TACE（化学栓塞治疗）TARE与TACE有相似治疗效果，但门静脉癌栓不是禁忌症，无肿瘤细胞综合症。另外TARE后可行TACE治疗，而TACE后不能TARE。二.肝癌治疗.射频消融，微波消融，无水酒精治疗，氩氦刀冷冻局部治疗，小肝癌（3cm）与手术治疗5年生存率相似。.全身化疗效果不佳。.其他：抗血管生成，自杀基因治疗，疫苗治疗，siRNA技术。.多激酶抑制剂索拉非尼2007年11月美国FDA已批准治疗晚期肝癌，期临床表明1年生存率40%，但有副作用，但其发生率与安慰剂无明显差异。
