1、-1-内内 容容为何要检测为何要检测EGFR突变突变EGFR突变突变类型及意义类型及意义标本因素对突变检测的影响标本因素对突变检测的影响突变检测突变检测流程与流程与方法概述方法概述ARMS试剂盒检测试剂盒检测EGFR突变突变非肿瘤组织标本检测非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展突变进展-2-具有具有EGFR基因敏感突变者基因敏感突变者TKI疗效显著疗效显著Author#screenedEGFR m+AgentRRTTPInoue19916吉非替尼75%9.7 mosPaz-Ares21047127厄罗替尼82%13.3 mosOkamato311832吉非替尼75%NDSutani410038吉
2、非替尼78%9.4 mosMorikawa512346吉非替尼62%9.7 mosSequist69831吉非替尼55%11.4 mosMok7437261吉非替尼71%9.6 mosMaemondo8228吉非替尼74%10.8 mosMitsudomi9172吉非替尼62%9.2 mos1JCO 2006;2-5ASCO 2006;6ASCO 20077Mok TS et al,NEJM 2009;8Maemondo M et al.NEJM 20109Mitsudomi T et al.Lancet Oncology 201070.4%EGFREGFR基因突变检测在临床应用的意义基因突变
3、检测在临床应用的意义(1/2)(1/2)-3-为何要检测为何要检测EGFREGFR突变突变 (2/2)(2/2)IPASS:根据突变状态的疗效分析根据突变状态的疗效分析04812162024Time from randomisation(months)0.00.20.40.60.81.0Probabilityof PFSGefitinib EGFR M+(n=132)Gefitinib EGFR M-(n=91)Carboplatin/paclitaxel EGFR M+(n=129)Carboplatin/paclitaxel EGFR M-(n=85)Gefitinib EGFR M+(n
4、=132)Gefitinib EGFR M-(n=91)Carboplatin/paclitaxel EGFR M+(n=129)Carboplatin/paclitaxel EGFR M-(n=85)-4-EGFREGFR基因突变检测概念基因突变检测概念EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是：EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。EGFR检测检测物质部位方法基因突变DNA细胞核测序法、ARMS法等拷贝数DNA细胞核荧光原位杂交法（FISH）蛋白表达蛋白质细胞膜免疫组化法（IHC）RNA表达RNA细胞核RT-PCRX-
5、5-Nature Review 2007,7:169NSCLCNSCLC中中EGFREGFR酪氨酸激酶区突变酪氨酸激酶区突变种类种类-6-EGFREGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性突变类型与吉非替尼治疗敏感性组别组别突变类型突变类型所占比例所占比例对吉非替尼敏感性对吉非替尼敏感性1Exon 19 deletions;L858R90%敏感2T790M/deletions;T790M/L858R;G719X;L861Q;S768I7%敏感，数据有限3T790M alone;Exon 20 insertions;other mutations3%不敏感Mok et al.,2008Kim et a
6、l.,2008Hirsch et al.,2006AZ In-House Data-Unpublished-7-标本采集及病理评估DNA 抽提及质控检测报告EGFR突变检测ARMS测序法其它方法EGFR 突变检测流程突变检测流程-8-EGFREGFR突变检测中的相关角色突变检测中的相关角色患者患者临床医生临床医生胸外科医师胸外科医师内镜医师内镜医师收集肺癌组织标本收集肺癌组织标本病理科医生病理科医生准备样本准备样本实验操作及结果分析实验操作及结果分析实验室人员实验室人员报告结果给临床医生报告结果给临床医生-肿瘤科医生肿瘤科医生-放疗科医生放疗科医生-呼吸科医生呼吸科医生-9-标本因素标本因素对
7、对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-肿瘤组织特点肿瘤组织特点-遗传异质性遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求对检测方法敏感度有较高要求正常细胞混杂正常细胞混杂-10-用于用于EGFR突变检测的标本突变检测的标本 肿瘤组织肿瘤组织目前最可靠的标本；目前最可靠的标本；其它样本：外周血（血浆、血清）细胞学（胸水、痰液细胞学）支气管刮取物 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用-11-标本因素标本因素对对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-组织标本种类组织标本种类-对检测方法有对检测方法有相应相应要求要求，组织标本及，组织标本及DNADNA质控尤其重要质控尤其重要 冰冻新鲜组织冰冻
8、新鲜组织 固定包埋组织固定包埋组织-外科手术标本完整，量多广泛-小活检标本完整，量少受限-外科手术标本片段化，量多受限-小活检标本片段化，量少极度受限DNA质与量质与量适用方法适用方法-12-肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞H&E 染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数：-手术标本，5 m X4-小活检标本，5 m X8 组织标本来源组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检 标本处理及贮存标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或-80CFFPE-13-DNA
9、提取及质控提取及质控推荐用推荐用QIAGENQIAGEN或类同试剂盒提取或类同试剂盒提取DNADNA紫外分光光度计：适合新鲜组织紫外分光光度计：适合新鲜组织DNADNA质控质控测定总量（OD260）及DNA纯度（OD260/280）qPCRqPCR：FFPEFFPE来源来源DNADNA的最可靠质控方法的最可靠质控方法检测可扩增的DNA片断评估是否存在PCR抑制剂PCR 产物长度可扩增DNADNA 10倍稀释后倍稀释后-14-ME-PCR/SequencingO=Transfer product/add reagent/open tubePCR:Real-timeDetectionPCRClea
10、n-upSequencing RxnCapillary SequencingPCRPCRClean-upSequencing RxnCapillarySequencing PCRHetero-duplexCapillaryElectro-phoresisARMS&PNA-LNA clampPCR/SequencingNested PCR/SequencingPCR/HRMA/dHPLC PCR/RFLPPCRRFLPElectro-phoresisSizing PCRPCRClean-upSequencing RxnCapillarySequencing RFLPOOOOOOOOOOOOTaq
11、Man Clean-upOClean-upOClean-upOOOOPCRSURVEYORcleavagedHPLCSizing OConfirmation by sequencing PCR/SURVEYORPCRClean-upPyro-sequencing RxnPyro SequencingOO123456Steps7突变检测的各种方法：流程与敏感度突变检测的各种方法：流程与敏感度Confirmation by sequencing OConfirmation by sequencing OOO1%10%3-10%10%3-12%2030%2030%1%PCR:Real-timeDet
12、ection10%-15-直接测序法直接测序法流程及数据分析流程及数据分析PCR*纯化纯化测序反应测序反应测序仪毛细管电泳测序仪毛细管电泳纯化纯化数据分析数据分析EGFR deletionEGFR L858R电泳质控电泳质控组织标本组织标本DNA*PCR是关键：是关键：-特异性-产物长度-必要时巢式-建议通用测序引物-16-ARMS法基本原理法基本原理等位基因特异性等位基因特异性PCR+荧光探针荧光探针=ARMS方法方法A 突变突变DNA模板模板突变正向引物突变正向引物延伸延伸 反向引物反向引物G 野生野生DNA模板模板突变正向引物突变正向引物 无延伸无延伸 反向引物反向引物产生荧光信号产生荧
13、光信号-17-DNAARMS反应反应实时定量实时定量 PCRARMS法法操作流程及数据解读操作流程及数据解读数据分析数据分析内参信号内参信号(HEX)突变突变信号信号:+-内参内参信号信号:+标本 1（突变阳性突变阳性）标本 2（突变阴性）突变信号突变信号(FAM)组织标本组织标本内参信号内参信号(HEX)-18-DxS ARMS 与与 ADx ARMSDxS ARMSADx ARMS生产厂商生产厂商Qiagen中国厦门艾德公司引物与探针设计引物与探针设计蝎形引物与探针双环引物与探针特异引物双扩增检测突变种类检测突变种类29种29种突变突变判读判读FAM信号,Ct值值FAM信号,Ct值值DNA用量用量20ng/Rxn70%1130-70%40FFPE组织-手术标本小活检标本选择合适的方法-ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展是目前较敏感快速方法，且容易开展-测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及做好组织标本及DNA质控是关键非肿瘤组织标本的有效利用-在无肿瘤组织情况下，外周血cfDNA、胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测EGFR突变，但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索-必须选择足够敏感的方法-31-谢 谢！
