1、慢性乙型肝炎诊断与治疗中的分子指标慢性乙肝分子指标课件1全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡慢性乙肝分子指标课件2慢性乙肝分子指标课件3HBsAg持续阳性6个月以上HBV-DNA高于105拷贝/毫升ALT持续升高或反复升高慢性乙肝分子指标课件4HBeAg阳性乙肝：HBsAg、HBeAg阳性；HBV-DNA高于105拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高HBeAg阴性乙肝：HBsAg、anti-HBe阳性；HBV-DNA高于104拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高慢性乙肝分子指标课件5生化指标：ALT免疫学指标：HBsAg（携带指
2、标）、HBeAg（活动指标）病毒学指标：HBV-DNAHBeAg阴性乙肝缺乏病毒活动的免疫学指标，前S1可以弥补这一缺憾，提供HBeAg阴性乙肝患者病毒活动的免疫学指标慢性乙肝分子指标课件6虽然国内HBV-DNA检测都用实时荧光PCR法，但不同厂家的产品定量标准的赋值有差异，从而导致定量结果的差异，而准确的定量结果直接影响到对病人的诊断以及治疗方案的选择HBV DNA定量试剂的溯源和标准化将是一种基本趋势慢性乙肝分子指标课件7防止发展成为肝硬化或肝细胞癌在临床上，往往以比较现实的短期目标来代替长期目标慢性乙肝分子指标课件8病毒抑制：表现为HBeAg血清转换和HBV-DNA阴转肝损伤程度降低：表
3、现为转氨酶恢复正常完全清除病毒：表现为HBsAg消失，HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到HBV-DNA从目前水平来看，不可能完全清除病毒慢性乙肝分子指标课件9免疫调节剂：干扰素、PEG干扰素、胸腺肽核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩替卡韦、泰诺福韦等慢性乙肝分子指标课件10拉米夫定治疗一年后的HBeAg阴转率和HBV-DNA阴转率：ALT浓度低于2倍正常值高限：5%ALT浓度介于2-5倍正常值高限：26%ALT浓度高于5倍正常值高限：64%慢性乙肝分子指标课件11慢性乙肝诊断治疗监测和疗效评价跟踪随访预后判断慢性乙肝分子指标课件12HBsAg阳性六个月以上ALT持续升高或反复升高
4、HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）慢性乙肝分子指标课件13ALT高于2ULN（正常值上限）HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）ATL持续正常的患者可暂不进行治疗，每隔3-6个月随访肝功能、血清病毒学标志物和进行肝细胞肝癌监测 ALT水平在1-2倍ULN之间，需根据具体情况(如肝活检结果等)，在告知患者治疗的利与弊、了解患者配合程度的前提下，决定是否实施治疗。无论治疗与否均应密切随访，为治疗提供更为科学的根据慢性乙肝分子指标课件14治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA）治疗开始后
5、前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效慢性乙肝分子指标课件15生化学应答：完全应答：2次监测ALT均复常(间隔1个月)；无应答：ALT未恢复正常。值得注意的是评价生化学应答时应排除其他药物或疾病对ALT升高或下降的影响 慢性乙肝分子指标课件16病毒学应答：完全应答按所采用的HBV DNA检测方法说明书上提供的实验敏感性和检测范围确定，临床上一般认为采用国际公认的检测方法或敏感性相当的检测方法检测HBV DNA定量105拷贝/毫升或斑点杂交法阴性为完全应答；部分应答为未
6、达完全应答标准但HBV DNA载量下降大于2个对数级；无应答为未达上述标准慢性乙肝分子指标课件17血清免疫学应答：完全应答为HBeAg/抗HBe血清转换；部分应答为HBeAg阴转但未出现抗HBe；无应答为未达上述标准。慢性乙肝分子指标课件18完全应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学所有指标均达到完全应答慢性乙肝分子指标课件19部分应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标介于完全应答和无应答之间慢性乙肝分子指标课件20无应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标均为无应答 HBeAg阴性伴HBV DNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者不进行血清免疫学应答评价，但应进行生化学和病毒
7、学指标的疗效评价慢性乙肝分子指标课件21治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到完全应答者建议至少继续用药6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察 慢性乙肝分子指标课件22治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到部分应答者建议继续用药直至达到完全应答后，再继续用药至少6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBV DNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察慢性乙肝分子指标课件23治疗前HBeAg阳性患者治疗1年时综合疗效仍无应答可停药观察，或改用其他有效的抗病毒药治疗。对于有肝脏组织学检查等其它临床指征显示
8、病情进展合并肝功能失代偿或肝硬化的病人，不宜轻易停药，并应加强对症保肝治疗慢性乙肝分子指标课件24HBeAg阴性伴HBV DNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者，综合疗效完全应答者疗程至少2年；对于完成1年治疗仍无应答者可改用或加用其他有效 治疗方案 慢性乙肝分子指标课件25无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每36个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。慢性乙肝分子指标课件26虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象使用一年、二年、三年、四年的
9、耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹慢性乙肝分子指标课件27采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案慢性乙肝分子指标课件28Primer FPrimer FPrimer FProbeProbeProbePrimer HBVPrimer YIDDPrimer YVDDHBV检测检测I突变检测突变检测V突变检测突变检
10、测慢性乙肝分子指标课件29采用选择性引物，基于TaqMan实时PCR技术，在三个平行反应中分别扩增总HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根据管间Ct值差异计算突变毒株在病毒群体中的比例慢性乙肝分子指标课件30慢性乙肝分子指标课件31慢性乙肝分子指标课件32慢性乙肝分子指标课件33慢性乙肝分子指标课件34慢性乙肝分子指标课件35Comparison of results obtained by sequencing,pyrosequencing and real-time PCRTypesSequencingpyrosequencing real-time PCRrtM20425
11、(36%)24(35%)23(33%)rtM204I26(38%)24(35%)21(30%)rtM204V18(26%)19(27%)20(29%)rtM204I+rtM204V 02(3%)5(8%)慢性乙肝分子指标课件36定性判断：Ct 3.5，此时病毒群体中突变株比例大于10%与测序法比较，15例标本结果完全符合慢性乙肝分子指标课件37慢性乙肝分子指标课件38拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况治疗时间 HBV DNA大于104copies/ml例数 YMDD变异例数*6个月61（17%）612个月2614（54%）1224个月3826（68%）2436个月3838（100%）*各组之间
12、两两比较均有显著差异（P0.05）。慢性乙肝分子指标课件39慢性乙肝分子指标课件40慢性乙肝分子指标课件41对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异）治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次拉米夫定耐药、替比夫定耐药（YIDD）恩替卡韦治疗YMDD变异患者存在耐药高风险慢性乙肝分子指标课件42乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为AH八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化不同的基因型对药物的应答也不一样：基因
13、型B比基因型C对干扰素治疗的应答率高慢性乙肝分子指标课件43l运用多重、多色实时PCR技术，分别对乙肝病毒（HBV）各种基因型序列进行分析l根据国内HBV基因型的特点，设计能检测HBV AD四种基因型特异性引物及探针l研制开发具有自主知识产权的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色实时PCR检测试剂盒 慢性乙肝分子指标课件44B管（Ct36）B管（Ct36）C管（Ct36）B型、C型HBV复合感染2C型HBVC管（Ct36）B型HBV非B非C型，或HBV（-）慢性乙肝分子指标课件45分型识别率（分型识别率（12+2212+22）/35/359797样本数百分比B型1234%C型2263%未检出1
14、3%总计35100%慢性乙肝分子指标课件46HBV B B型血清样本型血清样本灵敏度约在灵敏度约在2 210103 3IU/mlml慢性乙肝分子指标课件47HBV C C型血清样本型血清样本灵敏度约在灵敏度约在1 110103 3IU/ml/ml慢性乙肝分子指标课件48HBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才能算真正有效HBV cccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标慢性乙肝分子指标课件49运用实时PCR技术，根据乙肝病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）和双链松弛环状DNA（rcDNA）分子结构上的差异，即rcDNA负链上的缺
15、口和正链的不完整性，设计一对特异性cccDNA的引物，分别杂交于1500和2100邻近区域(以EcoR I切点为物理起始原点)，同时设计一条杂交于负链3端近缺口处检测探针，研制开发具有自主知识产权的HBV cccDNA实时PCR检测试剂盒。慢性乙肝分子指标课件50rcDNArcDNA不能被扩增不能被扩增无荧光信号无荧光信号cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增检测到荧光信号检测到荧光信号P118201590+3200（1）EcoR I P2EcoR I5+P2 3200(1)53159031820P1慢性乙肝分子指标课件51阿德福韦为阿德福韦为5-5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可单磷酸脱氧阿
16、糖腺苷类似物，可明显抑制明显抑制HBV DNAHBV DNA复制复制 HBeAg HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，阳性慢性乙型肝炎患者，1 1、2 2、3 3年时的耐年时的耐药发生率分别为药发生率分别为0%0%、1.6%1.6%、3.1%3.1%HBeAgHBeAg阴性者阴性者1 1、2 2、3 3年的耐药发生率分别为年的耐药发生率分别为0%0%、3.0%3.0%、5.9%11%5.9%11%慢性乙肝分子指标课件52 rtN236T、rtA181V/T 慢性乙肝分子指标课件53拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8至至30倍；倍；发生发生YMDD变异
17、患者治疗变异患者治疗1 年时对恩替卡韦耐药年时对恩替卡韦耐药发生率为发生率为5.8%，并出现相关的位点变异。，并出现相关的位点变异。慢性乙肝分子指标课件54如果乙肝病毒多聚酶存在如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和和/或或rt M204V/I，rtT184，rtS202和和/或或rtM250等位点变等位点变异将造成对恩替卡韦耐药异将造成对恩替卡韦耐药 慢性乙肝分子指标课件55慢性乙肝分子指标课件56Mutation位置（3130）突变型野生型lamivudinertL180M*YMDD*YIDD*YVDD*AdefovirrtA181V/T*rtN236T*EntecavirrtT184G*
18、rtM250V*TypingBC*D慢性乙肝分子指标课件57G1896A点突变，形成终止密码子点突变，形成终止密码子(TAG)，不，不表达表达HBeAg；由于由于e抗原不能合成，血清中检测不到抗原不能合成，血清中检测不到HBeAg，但乙肝病毒仍处于复制状态；但乙肝病毒仍处于复制状态；此类此类HBeAg阴性乙肝患者更容易发生严重的肝阴性乙肝患者更容易发生严重的肝脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。慢性乙肝分子指标课件58药物治疗方案的确定药物治疗方案的确定（用药：干扰素、拉米夫定、（用药：干扰素、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦）阿德福韦、恩替卡韦）药物治疗药物治疗（疗效评价）（疗效评价）前前C C区区18961896位点突变检测试剂盒位点突变检测试剂盒跟踪随访跟踪随访乙乙 肝肝 病病 毒毒 定定 量检测量检测 试试 剂剂 盒盒确确诊诊病毒学病毒学分析分析乙肝病毒分型检测试剂盒乙肝病毒分型检测试剂盒拉米夫定耐药检测试剂盒拉米夫定耐药检测试剂盒阿德福韦耐药检测试剂盒阿德福韦耐药检测试剂盒共价闭合环状共价闭合环状DNA(cccDNA)检测试剂盒检测试剂盒恩替卡韦耐药检测试剂盒恩替卡韦耐药检测试剂盒慢性乙肝分子指标课件59谢 谢慢性乙肝分子指标课件60
