1、第一节 第二节第三节第四节返回首页第十章 白细胞检验的基本方法第一节 第二节第三节第四节返回首页第一节 白细胞功能检验一、墨汁吞噬试验 二、白细胞吞噬功能试验 三、血清溶菌酶活性试验 四、硝基四氮唑蓝还原试验 五、白细胞趋化性试验 六、吞噬细胞吞噬功能试验第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页 一、墨汁吞噬试验 【原理】血液中中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用。在一定量的肝素抗凝血中，加人一定量的墨汁，经37温育4小时，涂片染色镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数。【参考值】成熟中性粒细胞吞噬率7415，吞噬指数 12660；成熟单核细胞吞噬率9515，吞噬指
2、数313 86。下一页第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页第一节 【临床评价】粒细胞的吞噬功能仅限于成熟阶段，单核细胞幼稚型和成熟型都具有吞噬能力。急性单核细胞白血病M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。急性粒细胞白血病（M2）、急性淋巴细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病的原始及幼稚细胞多无吞噬能力，吞噬试验为阴性。急性粒-单核细胞白血病呈阳性反应，对鉴别有一定价值。慢性粒细胞白血病的成熟中性粒细胞吞噬能力明显减低。上一页下一页第一节 第二节第三节第四节返回首页M5骨髓象的墨汁吞噬试验返回第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页二、白细胞吞噬功能试验 【原理】分离白细胞悬液，将待测的吞噬细
3、胞与某种可被吞噬而又易于查见计数的颗粒物质如葡萄球菌混合，温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，可在镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况，根据吞噬率和吞噬指数即可反映吞噬细胞的吞噬功能。下一页第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【参考值】1.吞噬率（）=吞噬细菌的细胞数200个（中性粒细胞）X 100；正常人为 62 8114 2.吞噬指数 200各中性粒细胞吞噬细胞总数200个（中性粒细胞）；正常人为1.060.05上一页下一页第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】吞噬细胞分大吞噬细胞和吞噬细胞两大类。前者包括组织中的巨噬细胞和血循环中的大单核细胞，后者主要是中性粒细胞。
4、本试验可了解中性粒细胞的吞噬功能。如吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强，常见于细菌性感染。对疑有中性粒细胞吞噬功能低下者，有帮助确诊的价值。上一页第一节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页三、血清溶菌酶活性试验 【原理】溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌的细胞壁乙酰氨基多糖成分，使细胞失去细胞壁而破裂。以对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性。【参考值】血清（515）mgL 尿（02）mgL（比浊法）下一页第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】l.血清溶菌酶含量增高 可见于部分急性髓细胞白血病。急性单核细胞白血病 急
5、性粒-单核细胞白血病 急性粒细胞白血病 2血清溶菌酶含量减低 急性淋巴细胞白血病多数减低，少数正常。慢性粒细胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急变时下降。上一页第一节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页四、硝基四氮唑蓝还原试验 【原理】硝基四氮唑蓝（NBT）是一种染料，其水溶性呈淡黄色。当被吞入或掺入中性白细胞后，有产生过氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中间代谢产物葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代谢中NADPH氧化脱下的氢，而被还原成非水溶性的蓝黑色甲颗粒，呈点状或片状沉着在胞浆内有酶活性的部位，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比。【参考值】正常成人的阳性细胞数在10以下。若有 10以上中性粒细胞
6、能还原NBT，即为NBT还原试验阳性；低于10则为阴性。下一页第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】1.用于中性粒细胞吞噬杀菌功能异常的过筛鉴别和辅助诊断儿童慢性肉芽肿，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，髓过氧化物酶缺乏症和 Job综合征，NBT还原试验阳性。上一页第一节 2.用于细菌感染的鉴别 3.器官移植后发热的鉴别 4.无丙种球蛋白血症、镰状细胞病、恶性营养不良等NBT还原阳性细胞比例可降低。5新生儿、小儿成骨不全症、心肌梗死急性期、淋巴肉瘤、NBT还原阳性细胞比例可增高。返回第一节 第二节第三节第四节返回首页五、白细胞趋化性试验 【原理】在微孔滤膜的一侧放入粒细胞，另一侧放
7、入趋化因子（细菌毒素、补体 C3a、淋巴因子等），检测离体粒细胞潜过滤膜到达趋化因子这一侧定向移动的能力。【参考值】趋化指数 3.03.5下一页第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页当被吞入或掺入中性白细胞后，有产生过氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中间代谢产物葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代谢中NADPH氧化脱下的氢，而被还原成非水溶性的蓝黑色甲颗粒，呈点状或片状沉着在胞浆内有酶活性的部位，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比。急单呈强阳性反应，胞质为均匀一致的弥散样淡红色或深红色，无点状颗粒。l.【临床评价】【参考值】粒细胞上升值一般低于（1.【临床意义】白细胞减少者，注射肾上腺素后，如外周
8、血白细胞能较注射前增加 1倍以上或粒细胞上升值超过（1.【参考值】【参考值】正常人骨髓细胞的活性为dGTP掺入l108个细胞的量为（00.【结果】趋化指数 3.当被吞入或掺入中性白细胞后，有产生过氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中间代谢产物葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代谢中NADPH氧化脱下的氢，而被还原成非水溶性的蓝黑色甲颗粒，呈点状或片状沉着在胞浆内有酶活性的部位，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比。【临床评价】趋化性是粒细胞到达炎症局部所必需的。本试验是观察粒细胞向感染灶运动能力的一项重要检测方法。趋化功能异常可见于Wiskot-Aldrich综合征、幼年型牙周炎、糖尿病、烧伤、新生儿、
9、慢性皮肤粘膜白色念珠菌病、高IgE综合征、先天性鱼鳞病、膜糖蛋白（相对分子质量 11000）缺陷症、肌动蛋白功能不全症、Chediak-Hisashi综合征。上一页第一节下一页第一节 第二节第三节第四节返回首页Chediak-Hisashi综合征返回第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页六、吞噬细胞吞噬功能试验 【原理】活体巨噬细胞、单核细胞在体内外均有吞噬细菌、异物的功能，在体外将细胞与异体细胞或细菌混合孵育后，染色观测其吞噬异体细胞或细菌的数量，可了解其吞噬功能。利用中药斑螫在人的前臂皮肤上发疱，造成非感染性炎症，诱使单核细胞游出血管大量聚集于疱液内，抽取疱液则成为天然提纯的吞噬细胞悬液
10、。以鸡红细胞为靶细胞，在体外370C条件下观察吞噬细胞对鸡红细胞的吞噬消化活性，取试管内的细胞进行涂片染色和镜检并计算吞噬百分率和吞噬指数。下一页第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【参考值】吞噬百分率（62.771.38）吞噬指数1.0580.049 【临床评价】l.吞噬细胞吞噬功能低下主要见于各种恶性肿瘤，吞噬率常低于45，手术切除好转后可以上升，故可作为肿瘤病人化疗、放疗、免疫治疗疗效的参考指标。2.一些免疫功能低下的病人，吞噬率降低，可作为预测感染发生的概率。并观测疗效、判断预后的指标。上一页返回第一节第一节 第二节第三节第四节返回首页第二节 白细胞代谢及其产物检验一、末端脱氧核
11、苷酰转移酶检测 （一）酶标免疫细胞化学显示法 （二）同位素检测法 二、N-碱性磷酸酶检测 三、酸性-醋酸酯酶检测第二节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）是一种DNA聚合酶，它不需要模板的指导，就可以催化细胞的脱氧核苷酸，使其转移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3-OH端，合成单链DNA。兔抗牛TdT抗体能和人细胞的TdT产生交叉反应，可采用免疫荧光技术或酶标免疫细胞化学技术，用辣根过氧化物酶-抗酶复合物在细胞涂片上定位，显示细胞内的TdT。【结果】阳性反应为棕黄色颗粒，定位在细胞核上。TdT为早期 T淋巴细胞的标志，在正常情况下不成熟的胸腺淋巴细胞出现阳性反应
12、，正常人外周血细胞中极少或无活性。下一页第二节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】95以上急性淋巴细胞白血病和大约30慢性粒细胞白血病急淋变患者外用血细胞有明显的TdT活力，病情缓解后阳性率逐渐减弱。在急性淋巴细胞白血病中，由于细胞表面标志不同,TdT活性也有变化，T-ALL，早B前体-ALL细胞的阳性率很高，B-ALL细胞阴性。当外周血中此酶活性升高，就预示着血细胞的恶性变。因此TdT的测定对急性白血病的鉴别和治疗都有一定意义。返回上一页第二节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】以3H或14C标记的脱氧核苷三磷酸等的dXTP为基质，用低聚脱氧核苷（dA）等人工同聚物作为引
13、物，由于酶反应与引物重合，使基质不溶于三氯醋酸，可用玻璃纤维盘将其吸附，从未被放射性核素标记的反应基质中分离出反应的生成物，计测放射活性。除去不加引物所测定的内源性反应所引起的活性之后，可测算酶的活性。【参考值】正常人骨髓细胞的活性为dGTP掺入l108个细胞的量为（00.09）mmolL。下一页第二节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】1急性淋巴细胞白血病（B-ALL除外）可检出较高的TdT活性，慢性粒细胞性白血病急性变时，约有13的病例在原始细胞中能检出高活性的TdT。2恶性淋巴瘤中，原始淋巴细胞性淋巴瘤的淋巴结细胞中能检出高的TdT活性。3此酶检查在研究造血细胞的分化与白血病
14、的关系、白血病细胞的起源、白血病的治疗药物选择上都有较重要的价值。上一页第二节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】用P-硝基酚磷酸盐作为细胞碱性磷酸酶总活性检测的基质，在反应中生成P-硝基酚，测量400nm时的吸光密度，借以检测出细胞A-Pase的总活性。此外，可通过CASP作为基质来测定N-碱性磷酸酶的活性。通过酶反应，生成半胱胺，这是用二硝基苯置换5-硫-硝基酚酸；检测412nm的吸光密度，借以检测N-APase的总活性。在基质液中加人用N-丁醇：水（1：3）的混合液提取粗酶液，室温下放置60分钟，记录酶反应，求出酶反应的速度。一般情况下，N-APase的P-NPP与CASP的
15、水解速度之比（VP-NPPVCASP）在1.12.0的范围内，平均为 18。因此，N-APase的活性可用 VP-NPP-1.8VCASP求出，再从VP-NPP计算 N-APase的百分率。下一页第二节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【参考值】正常人的粒细胞、淋巴细胞中不能检出N-APase的活性。【临床评价】在AML及CML慢性期、CML急性变的原粒细胞中，均不能检出N-APase。但在ALL和CML急淋变时，原始淋巴细胞能检出N-APase，且不仅在非T-ALL、非B-ALL的幼稚细胞，就是在T-ALL及具有B细胞标记物的原始细胞中亦可检出。因此，认为此酶是从未成熟的白血病性原始淋巴细
16、胞向T细胞、B细胞分化过程中，未成熟的淋巴系统的细胞标志酶。此外，在鼻咽癌、喉癌等被认为是病毒感染的肿瘤细胞中，以及与EB病毒有关的传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤等，均可检出此酶。上一页第二节下一页第一节 第二节第三节第四节返回首页T细胞白血病的血象返回第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原 理】血 细 胞 中 的 酸 性 -醋 酸 酯 酶（ANAE），在弱酸性（pH5.8）条件下能将基质液中的-醋酸萘酯水解，产生-萘酚。产生的-萘酯酚再与六偶氮副品红偶联形成不溶性暗红色偶氮副品红萘酚沉淀，定位于胞质内酶活性处，呈现单一的或散在的红色点块状或颗粒状。上一页下一页第二节第一节 第二
17、节第三节第四节返回首页 【结果】酸性-醋酸酯酶（ANAE）主要分布在T细胞和单核细胞内；粒细胞、B细胞、红系细胞、巨核细胞和血小板中含量较少。T细胞为ANAE阳性细胞，胞质内有大小不等、数量不一的紫红色颗粒或斑块；B细胞为ANAE阴性细胞，胞质呈黄绿色，胞质内无红色斑块；单核细胞为ANAE阳性，其胞质内有细小红褐色颗粒斑块。上一页下一页第二节第一节 第二节第三节第四节返回首页酸性磷酸酶染色上一页下一页第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】l.有助于区分T细胞和B细胞ANAE染色在T细胞胞质中呈现点状颗粒或大块局限阳性反应中细胞大多数为阴性反应，偶见稀疏弥散细小颗粒。2.鉴别急性白血病
18、类型 急性T细胞白血病细胞为点状或块状阳性，局限分布；急性粒细胞白血病细胞ANAE染色大部分呈阴性或弱阳性反应，颗粒增多的早幼粒白血病细胞阳性反应较强，为弥散性分布；急单呈强阳性反应，胞质为均匀一致的弥散样淡红色或深红色，无点状颗粒。上一页第二节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页7）x 107kg用流式细胞仪对白血病化疗后监测药效是目前较为灵敏的方法，对比化疗后的细胞内DNA含量表化，可迅速得出是否敏感的结论，从而指导临床对初治或复发白血病病人选用和及时更换化疗方案。当外周血中此酶活性升高，就预示着血细胞的恶性变。【参考值】粒细胞上升值一般低于（1.以鼠抗羊IgG作阴性对照，标本中有明显荧
19、光现象就证明有相应的抗原存在，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。95以上急性淋巴细胞白血病和大约30慢性粒细胞白血病急淋变患者外用血细胞有明显的TdT活力，病情缓解后阳性率逐渐减弱。当被吞入或掺入中性白细胞后，有产生过氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中间代谢产物葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代谢中NADPH氧化脱下的氢，而被还原成非水溶性的蓝黑色甲颗粒，呈点状或片状沉着在胞浆内有酶活性的部位，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比。细胞抗原成分与特异性抗体称第1抗体结合后，与已标记上生物素的第2抗体起反应，再与ABC结合。经过一段时间再次采血。2.微量残留白血病诊断二、白细胞吞噬功能试验为荧光较弱但清
20、楚可见；此外，可通过CASP作为基质来测定N-碱性磷酸酶的活性。急性单核细胞白血病M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。5新生儿、小儿成骨不全症、心肌梗死急性期、淋巴肉瘤、NBT还原阳性细胞比例可增高。【参考值】急性粒-单核细胞白血病呈阳性反应，对鉴别有一定价值。第三节 白细胞动力学检验一、氚标记脱氧胸苷测定 二、泼尼松刺激试验 三、肾上腺素激发试验 四、二异丙酯氟磷酸盐标记测定 五、流式细胞仪检测DNA合成及含量 六、粒细胞抗体检测第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 （一）荧光免疫法检测 【原理】受检血清中的抗体和粒细胞结合后，加标记荧光物质的羊抗人 IgG血清，可使粒细胞膜显示荧光
21、，然后在荧光显微镜下观察阳性比率和荧光强度。【结果】阳性反应表示受检血清中存在粒细胞抗体。【临床评价】本法敏感性较好，特异性强，临床上常作为确诊免疫性粒细胞减少症的方法。下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 （二）化学发光法检测 【原理】用化学发光技术测定单个核细胞与抗体被覆的粒细胞相互作用产生的代谢反应，间接测定抗粒细胞抗体。【结果】用发光仪测定增强的化学发光反应，用发光指数表示结果。【临床评价】本法比间接荧光免疫法更灵敏，可用于确诊免疫性粒细胞减少症。上一页下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 （三）流式细胞技术检测 【原理】采用正常人“O”型抗凝血分离出单核细胞和粒细
22、胞，经1多聚甲醛固定，二者再等量混合制成细胞悬液，加受检血清孵育，再加结合异硫氰酸荧光素（FITC）和抗人F（ab）2IgG，采用流式细胞分析仪进行分析来检测同种反应性粒细胞抗体。【结果】荧光强度与粒细胞抗体量呈线性关系，根据荧光强度的大小即可得出粒细胞抗体的量。【临床评价】本法不但可对粒细胞抗体作半定量测定，还可以对抗体类型进行分析，以确定是否存在免疫复合物。上一页返回第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】分离的粒细胞并在培养过程中加入 PHA或特异性抗原刺激后，进人有丝分裂期，此时加入3H-TdR，可被细胞摄入参与DNA合成，其掺入量与DNA合成的量以及增殖细胞数成正比，用液体
23、闪烁计数器测定3H-TdR的掺入量，即可判定粒细胞的增殖水平。【参考值】SI2下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】在正常情况下，体内粒细胞在增殖池（骨髓）、循环池（血液）及边缘池（组织）之间处于平衡状态，末梢血中成熟粒细胞数为（2.55.5）109L。在罹患血液等病理情况下，这种平衡状态受到不同程度的破坏，即可能出现异常。研究白血病细胞动力学时给急性白血病患者连续静脉输人3H-TdR，810天后观察到仍有810的白血病细胞未被标记，这一小部分白血病细胞增殖相当缓慢。说明白血病细胞是一群非同步化增殖的细胞。上一页第三节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】正常时
24、骨髓中粒细胞储备量大于外周血中的1015倍，泼尼松具有刺激骨髓中性粒细胞由储备池向外周血释放的功能。如果受检者骨髓的粒细胞储备池正常，服用泼尼松后经过一定时间储备池大量释放至血流而使外周血中性粒细胞的绝对值明显增高。反之，则无此作用或作用不明显。可间接测定骨髓粒细胞池粒细胞的储备功能。【参考值】服药后中性粒细胞最高绝对值20109L（服药后5小时为中性粒细胞上升到高峰的时间）下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】泼尼松试验可反应骨髓中性粒细胞储备池的容量。中性粒细胞减少患者，如服用泼尼松后外周血中性粒细胞最高绝对值20109L，表明患者中性粒细胞的储备池正常，粒细胞减少可
25、能是由于骨髓释放障碍或其他因素所致。这对于某些骨髓受损引起粒细胞减少的轻微病例有一定参考及诊断价值。反之，则反映储备不足。上一页第三节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】白细胞（主要是指中性粒细胞）进入血流后，约半数进入循环池，半数粘附于血管壁成为边缘池的组成成分。此部分白细胞在外周血白细胞计数中不能得到反映。注射肾上腺素后血管收缩，粘附于血管壁上的白细胞脱落，从边缘池进入循环池，致外用血白细胞数增高，其作用持续时间为2030分钟。分别在注射前和注射后20分钟取血，计数中性粒细胞数。下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【参考值】粒细胞上升值一般低于（1.52）109L
26、【临床意义】白细胞减少者，注射肾上腺素后，如外周血白细胞能较注射前增加 1倍以上或粒细胞上升值超过（1.52）109L，表示患者白细胞在血管壁粘附增多，提示病人粒细胞分布异常，即边缘池粒细胞增多，如无牌大，可考虑为“假性”粒细胞减少。如果增高低于上述值，则应进行其他检查，进一步确定白细胞减少的病因。上一页第三节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】二异丙酯氟磷酸盐标记（DF32P）是利用含有放射性磷的二异丙酯氟磷酸作为胆碱酯酶的抑制剂，与细胞上的胆碱酯酶结合，即使细胞崩解，也不再与其他细胞相结合。故对测定血液循环中细胞池的大小（pool size）以及滞留的时间均非常方便。用于粒细胞
27、动力学研究时，一旦采血制成离体标记物后，即作静脉注射。经过一段时间再次采血。分离粒细胞，通过追踪观察其放射活性的变化，可测知外周血中有关粒细胞地的参数。下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页【参考值】l.粒细胞总数的测定 标记粒细胞半衰期间（T1/2）：410小时；血中滞留时间：1014小时。全血粒细胞池（TBGP）：（3570）x 107/kg 循环粒细胞池（CGP）：（2030）xl07kg 边缘粒细胞地（MGP）：（l540）x 107/kg 粒细胞周转率（GTR）：（60160）x107（kgd）上一页下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 2单核细胞总数的测定 标记单
28、核细胞半衰期：4.510.0小时 全血单核细胞池（TBMP）：（3912.7）x 107kg 循环单核细胞池（CMP）：（l027）x 107kg 边缘单核细胞池（MMp）：（2411.7）107k。单核细胞周转率（MTR）：（72336）x 107kg 【临床评价】在慢性白血病、真性红细胞增多症和骨髓纤维化时，TBGP及 GTR显著增加。粒细胞半寿期明显延长。急性粒细胞白血病时有轻微的延长，而再生障碍性贫血时各指数测定值均偏低。上一页第三节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页 流式细胞仪（FCM）是对单细胞快速定量分析和分选的新技术。当被测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样
29、品管中，在气体压力推动下，流经100m的孔道时，细胞排成单列，逐个匀速通过激光束，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。荧光被转化为电子信息，在多道脉冲高度分析仪的荧光屏上，以一维组方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示，计算机快速而准确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 （一）DNA合成的检测 【原理】与氚-胸腺嘧啶标记法的原理一样，用5-溴 脱氧尿嘧啶掺入 S期细胞的 DNA，然后用抗 5-BrdU抗原的特异性抗体，通过免疫荧光技术，用 FCM准确测定DNA合成速率。【结果】快速提供有关
30、细胞周期各时相分布的动态参数，间接了解DNA的合成情况。【临床评价】可直接用于白血病病人体内细胞增殖的动态研究，据此按化疗药物对细胞动力学的干扰理论设计最佳治疗方案，静止期肿瘤细胞对化疗不敏感而增殖期（SG2M）敏感，可将GO期细胞分化诱导进人 SG2M期，再予以细胞杀伤药物，以达到最佳杀伤瘤细胞的效果。上一页下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 （二）DNA含量的检测 【原理】碘化丙啶（ProPidiumiodide，PI）荧光染料可嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中与之结合。用PI染DNA后能在指定波长的光波激发下产生红色荧光，利用FCM可将细胞按不同的荧光强度即DNA含量分类并
31、绘出DNA直方图。细胞在增殖周期的不同阶段，其DNA含量是不同，从DNA直方图中可以得出细胞周期不同阶段的细胞百分数。上一页下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【结果】l.细胞DNA含量 V1细胞中 DNA含量多少用 DNA指数（DI）来表示。根据DI值来判断细胞DNA倍体的方法是：以正常同源组织细胞作为样品2CDNA含量细胞的内参标准。DNA倍体的判断标准为DI0.12CV。二倍体：DI1.0 2CV（直方图上仅1个G0G1峰）。非整倍体（aneuplid，AN）：DI值0.91，1.10。DNA指数（DI）计算公式:上一页下一页样品G0G1期DNA量平均数标准二倍体DNA量平均
32、数第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 2.细胞周期各时相细胞比率包括：G0G1期、5期和G2M期，计算各时相细胞的百分比。其中 S期细胞百分比也叫 SPF（S-Phase raction）。细胞增殖指数（proliferous index，PI）（）上一页下一页SPF（%）S（G0G1SG2M）x100（SG2M）（G0G1SG2M）x 100第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】1.DNA非整倍体细胞是肿瘤的特异性标志，从FCM的DNA图形分析，可得知血细胞和骨髓细胞DNA的相对含量，从而了解白血病细胞的信体水平及增殖活动。2.以纵坐标表示细胞数，横坐标表示DNA相对含
33、量，可绘出DNA不同含量血细胞分布曲线，得到G期、S期和G2M期细胞的百分比，尤其对白血病病人血细胞动力学的了解更为重要。急性白血病患者在来经治疗时其骨髓细胞（大多数为白血病细胞）S（S期细胞DNA的百分含量）明显低于正常骨髓。上一页下一页第三节第一节 第二节第三节第四节返回首页 3.用流式细胞仪对白血病化疗后监测药效是目前较为灵敏的方法，对比化疗后的细胞内DNA含量表化，可迅速得出是否敏感的结论，从而指导临床对初治或复发白血病病人选用和及时更换化疗方案。4.白血病病人外周血白血病细胞多处于 G0或 G1期。S期细胞百分率（S）高者对常用周期特异性药物较为敏感，患者的完全缓解率高，但容易复发。
34、S低者对化疗不敏感，但一旦缓解，不易复发。根据增殖期细胞对周期特异药物比静止期细胞为敏感，应用G-CSF来复苏G0期白血病细胞，有利于提高化疗效果。上一页第三节返回第一节 第二节第三节第四节返回首页第四节 白细胞免疫标记检测一、荧光显微镜计数检测 二、流式细胞仪计数检测 三、碱性磷酸酶-抗碱性磷 酸酶桥联酶标法检测 四、生物素-亲合素酶标法检测第四节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】将抗体标记上荧光素制成的荧光抗体，在一定条件下与细胞表面的分化抗原簇相互作用，洗去游离的荧光抗体后，结合于细胞表面的荧光素在一定波长激发光照射下，发出一定波长的荧光，借此用荧光显微镜就可检测到与荧光抗体特
35、异结合的表面标志。以鼠抗羊IgG作阴性对照，标本中有明显荧光现象就证明有相应的抗原存在，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。根据标记物和反应程序的不同分为：直接荧光法，间接荧光法和双标记法，下一页第四节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【结果】观察标本的特异性荧光强度一般用号表示，表示无荧光；为极弱的可疑荧光；为荧光较弱但清楚可见；2为荧光明亮；34为荧光闪亮。计算公式：阳性细胞率=荧光阳性细胞/荧光阳性细胞荧光阴性细胞x 100 【临床评价】见生物素-亲合素酶标法。上一页返回第四节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】流式细胞仪可看作荧光显微镜的延伸，是将标本细胞用荧光标记制备成悬液，使
36、荧光标记的细胞一个个地通过仪器的毛细管，分别辨认细胞形态大小和荧光特征，称为荧光活化细胞分选法。流式细胞仪与荧光显微镜相比，其优势是短期可分析数万个细胞，还可用计算机记录处理，快速地对各个细胞进行多参数定量分析。多色荧光分析还可识别一个细胞上同时存在的数种荧光的颜色。【结果】流式细胞术的数据显示以直方图形式表示。【临床评价】见生物素-亲合素酶标法。返回第四节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联法，是用碱性磷酸酶作为标记物标记已知抗体或抗抗体，进行抗体抗原反应。先用鼠单抗制备一种碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶单克隆抗体复合物，然后按照细胞抗原成分与第1抗体（鼠抗人单
37、抗）、第2抗体（兔抗鼠抗体）、APAAP复合物依次结合后，通过碱性磷酸酶水解外来底物显色，达到抗原定位。下一页第四节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【结果】高倍镜下计数200个有核细胞，其中细胞膜上或细胞浆内有红色标记物着染的细胞为阳性，无红色标记为阴性细胞，计算出各片阳性细胞百分率，该百分率即分别代表各单抗所针对抗原的阳性百分率。阳性细胞20为阳性结果。【临床评价】见生物素-亲和素酶标法。上一页返回第四节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【原理】生物素-亲合素酶标（ABC）法是依据亲合素和生物素二者间有很强的亲和力，生物素可以和抗体相结合，且结合后仍保持与亲合素连接的强大能力。辣根过氧化物酶标记在亲合素与生物素复合物上形成亲合素-生物素过氧化物酶复合物即ABC。细胞抗原成分与特异性抗体称第1抗体结合后，与已标记上生物素的第2抗体起反应，再与ABC结合。ABC 上辣根过氧化物酶作用于显色剂，使其产生有色沉淀，指示抗原存在部位。【结果】同APAAP法。下一页第四节第一节 第二节第三节第四节返回首页 【临床评价】l.对造血干、祖细胞的研究或CD34造血干细胞（HSC）祖细胞（HPC）分析与鉴定 2.T细胞亚群检测 3.急性白血病分型诊断 4.恶性淋巴瘤分类与诊断中的应用 5.微量残留白血病诊断 6.在血小板研究中的应用 7.骨髓移植及免疫重建的鉴定 上一页返回第四节
