1、白血病分子生物学分型白血病分子生物学分型上海血液学研究所朱勇梅白血病分子生物学白血病分子生物学白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子检测白血病的分子检测白血病分子检测的临床应用白血病分子检测的临床应用白血病的分子机制白血病的分子机制基因基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所所必需的全部核酸序列。必需的全部核酸序列。癌基因癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。癌基因活化的方式：癌基因活化的方式：点突变点突变 染色体重排染色体重排
2、基因扩增基因扩增抑癌基因抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。制细胞的恶变。白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子机制增殖增殖过度过度分化分化阻断阻断凋亡凋亡受抑受抑“二次打击二次打击”学说学说D.Gary Gilliland Best Practice&Research Clinical Haematology.2003;16:409-417白血病的分子检测白血病的分子检测Southern blotNorthern blo
3、tWestern blotFISHPCR测序测序芯片芯片白血病的分子检测白血病的分子检测PCR反应原理反应原理N=N0 x (1+E)n N：扩增子数量扩增子数量N0：起始模板数量起始模板数量E：扩增效率扩增效率n：循环数循环数白血病的分子检测白血病的分子检测PCR理论方程理论方程白血病的分子检测白血病的分子检测PCR方法优点方法优点 快速快速 灵敏灵敏 特异特异PCR方法缺点方法缺点 假阳性假阳性 假阴性假阴性白血病的分子检测白血病的分子检测PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（的范围内（22kbkb），），如如T-ALL中中SIL-TAL1。RT
4、-PCR：可用于染色体可用于染色体断裂点跨越很大的断裂点跨越很大的区域的融合基因。区域的融合基因。巢式巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。增加扩增效率。RQ-PCR：可定量扩增产物。可定量扩增产物。多重多重PCR：同管扩增多个目的片段。同管扩增多个目的片段。白血病的分子检测白血病的分子检测定量定量PCRRQ-PCR（Real-time Quantitative PCR）荧光标记扩增产物荧光标记扩增产物 荧光标记荧光标记引物引物 特异性荧光标记特异性荧光标记探针探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合荧光
5、染料直接结合扩增产物扩增产物 SYBR Green I与与DNA双链结合双链结合 动态监测荧光信号变化动态监测荧光信号变化TaqMan探针法探针法特异性高特异性高多重基因定量多重基因定量成本较高成本较高SYBR Green I 法法成本低成本低最适合初步筛查最适合初步筛查熔解曲线功能熔解曲线功能无法多重检测无法多重检测无模板特异性无模板特异性灵敏度低灵敏度低白血病的分子检测白血病的分子检测定量定量PCR白血病的分子检测白血病的分子检测定量定量PCRCT值：荧光信号有统计学意义显著增长值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数（穿过阈值线）时的循环次数CT值与起始模板量成反比值与
6、起始模板量成反比白血病的分子检测白血病的分子检测定量定量PCRRQ-PCR的检测系统：的检测系统：该系统内置了该系统内置了96孔孔PCR仪，且在每个反应孔上仪，且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧反应管中的荧光强度。平均每光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实秒就检测一次，以达到实时检测的目的。时检测的目的。系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到并最终得到CT值。值。该系统可以根据标准品的该系统可以根据标准品
7、的CT值和拷贝数自动绘值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。贝数。白血病的分子检测白血病的分子检测定量定量PCRRQ-PCR方法优点：方法优点：灵敏而特异灵敏而特异 起点定量起点定量 闭管化学（污染的风险低）闭管化学（污染的风险低）没有没有PCR后处理（无需走胶，拍照等）后处理（无需走胶，拍照等）高度自动化高度自动化 定性：单数据点测定定性：单数据点测定 定量：多数据点测定定量：多数据点测定 能做基因分型及能做基因分型及SNP鉴定鉴定RQ-PCR的操作流程的操作流程从细胞或组织中抽提从细胞或组织中抽提DNA或或RNA用用PCR或或
8、RT-PCR扩增特异片段扩增特异片段 将将PCR产物克隆到合适的载体上产物克隆到合适的载体上纯化，定量和系列稀释质粒纯化，定量和系列稀释质粒DNA或或RNA 体外转录成体外转录成RNA片段（仅用于片段（仅用于RNA样品）样品）构建标准曲线（构建标准曲线（CT lgcopy）样品的定量检测样品的定量检测校正样品基因拷贝数校正样品基因拷贝数白血病分子检测的临床应用白血病分子检测的临床应用白血病的分子生物学检查对白血病诊断分白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：型及预后判断有以下几方面意义：补充补充MIC检查的不足检查的不足 发现新的亚型发现新的亚型 监测白血病的微小残留
9、病灶（监测白血病的微小残留病灶（MRD）为研究白血病的发病机制打下基础为研究白血病的发病机制打下基础 PCR方法检测方法检测MRD常用的分子标志常用的分子标志 AML1-ETOt(8;21)(q22;q22)68%原发性原发性AML，在在M2中的阳性率为中的阳性率为2040%，在，在M2b中阳性率为中阳性率为90%少见于少见于M4和和M1，极少见于极少见于MDS和骨髓增生综和骨髓增生综合症合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感粒细胞，且对化疗反应较
10、敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他较其他AML亚型（亚型（M3除外）好除外）好 AML1-阴性阴性 ETO+AML1-ETO对初发患者进行对初发患者进行t(8;21)和和AML1-ETO融融合基因的检测对其预后判断及治疗方案合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者定性结果不能用于评价患者MRD情况情况 RQ-PCR能实时反映体内能实时反映体内AML1-ETO水水平。连续定量平。连续定量AML1-ETO
11、转录本水平可转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发疗干预以防血液学复发 PML-RARt(15;17)(q22;q21)98%M3患者患者继继t(15;17)之后，又先后发现之后，又先后发现4种种M3特异的累及特异的累及RAR的变异性染色体易位：的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及以及dup(17)(q21.3;q23)，分别产生分别产生PLZF-RAR，NPM-RAR，NuMA-RAR和和STAT5b-RAR融融合基因合基因临床上，具有临床
12、上，具有PLZF-RAR或或STAT5b-RAR融融合基因患者对合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解治疗可获完全缓解 PML-RARAPL累及的累及的RAR基因及其伙伴基因结构示意图基因及其伙伴基因结构示意图 PML-RAR由于由于PML基因断裂点基因断裂点不同产生不同产生3种不同的种不同的PML-RAR异构体异构体 约约55%的的M3患者为患者为L型，型，40%为为S型，型，5%为为V型，且每位患者只表达一种型，且每位患者只表达一种PML-RAR融合蛋白融合蛋白形态学上形态学上S型白血病细胞常为低分化的并型白血病
13、细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V型型APL患者的白血病细胞体外对患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度低的敏感度低 L+阴性阴性 S+PML-RARRT-PCR检测检测PML-RAR是敏感且特异的是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后诊断方法，还能用于治疗后MRD监监测。测。PML-RAR阳性提示的分子复发常阳性提示的分子复发常早于临床复发早于临床复发3-63-6个月，为临床采取进一个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障步治疗措施提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白
14、血病细胞负荷，缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在在MRD监测中比监测中比RT-PCR具有更高价值具有更高价值 PML-RAR0.010.1110100100010000051015202530Follow-up(months)DoseN0.010.11101001000100000510152025Follow-up(months)DoseNABCBF-MYH11inv(16)(p13;q22)及及t(16;16)(p13;q22)主要见于主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞不伴异常嗜酸细胞M4，少见于少见于M2CBF-MYH11融合蛋白通过干扰核心结融合蛋白通过干扰核心结合因子（合因
15、子（core binding factor,CBFcore binding factor,CBF）的的转录激活作用而致病转录激活作用而致病 具有具有CBF-MYH11的患者对化疗敏感，的患者对化疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义预后较好，故提高检测率尤具临床意义 CBF-MYH11CBF-MYH11具有多种变异型，其中最具有多种变异型，其中最常见的为常见的为A型，占型，占80%RT-PCR检测检测CBF-MYH11进行进行MRD监监测显示，大部分患者在完全缓解时测显示，大部分患者在完全缓解时PCR转阴，但仍有小部分长期存活者转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍仍为阳性为阳性最新研究采用
16、最新研究采用RQ-PCR检测检测CBF-MYH11转录本水平来评价转录本水平来评价M4Eo患者患者MRD情况，预示复发情况，预示复发 DEK-CANt(6;9)(p23;q34)主要见于主要见于M2或或M4，也见于，也见于M1，MDS-RAEB伴伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较的患者年龄一般较轻，且预后较差差此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案调整治疗方案 BCR-ABL（p190）t(9;22)(q34;q11)1530%成人成人ALL及及35%儿童儿童ALL 9号染色体的断裂点与号染色体的断裂点与CML相同，但相同，但22
17、号染色号染色体断裂点具有异质性体断裂点具有异质性 此融合蛋白此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比刺激细胞增殖的能力比p210要要强。在转基因试验中观察到强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点具有起病早、发展快和恶性程度高的特点BCR-ABL+ALL患者预后差，患者预后差，5年存活率年存活率20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗 BCR-ABL（p190）对于自体或异体移植对于自体或异体移植ALL患者，移植前患者，移植前后后BCR-ABL的有无以及的有无以及BCR-ABL的转录的转录本类型与预后
18、有关本类型与预后有关 e1a2+阴性阴性E2A-PBX1t(1;19)(q23;p13)56%儿童儿童ALL和和3%成人成人ALL 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无病生存期（病生存期（DFS）仅仅6个月，个月，3年年DFS为为20%，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后核型和核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要疗方案的选择至关重要E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究
19、证实的预后价值需更多的临床研究证实 TEL-AML1t(12;21)(p13;q22)25%儿童儿童ALL，是儿童是儿童ALL中最常见的分子异中最常见的分子异常常 目前为止尚未在目前为止尚未在T-ALL，AML或或NHL中发现中发现t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（白血病患者中频率很低（2%）此类患者发病年龄小（此类患者发病年龄小（2岁岁10岁），岁），WBC计计数低（数低（50 000/L），），免疫表型为前免疫表型为前B-ALL此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好后好 TEL-
20、AML1由于由于12p和和21q末端在常规显带中很相似，末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%，需应用需应用FISH或或RT-PCR方法提高检测阳方法提高检测阳性率性率TEL基因重排是独立预后因素，基因重排是独立预后因素，RT-PCR检测检测TEL-AML1融合基因能将低危险度融合基因能将低危险度与高危险度的与高危险度的ALL患者区分开来。因此患者区分开来。因此早期检测早期检测TEL-AML1融合基因对临床预融合基因对临床预后，确定合适的治疗方案都有重要意义后，确定合适的治疗方案都有重要意义 MLL相关融合基因相关融合基因 累及累及MLL
21、基因的分子异常见于基因的分子异常见于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受见于治疗相关白血病，尤接受topoisomerase II抑制剂治疗的患者抑制剂治疗的患者 MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同基因涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：病表型相关。最常见的有：t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因融合基因 ALL t(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因融合基因 AML t(
22、11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因融合基因 AML及及ALLMLL相关融合基因相关融合基因至今，至今，MLL相关融合蛋白的致病性还不相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能具有双重作用：清楚，推测其可能具有双重作用：融合蛋白可能获得新的功能，促使融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化细胞转化 MLL发生断裂后，缺失锌指结构域发生断裂后，缺失锌指结构域的的MLL不能与不能与DNA结合，失去其转录活结合，失去其转录活化功能，使受化功能，使受MLL调节的靶基因（调节的靶基因（HOX基因）表达异常，也影响造血细胞的发基因）表达异常，也影响造血细胞的发育育 MLL-AF4t(4;11)
23、(q21;q23)t(4;11)的发生率在不同年龄段是不同的，在婴的发生率在不同年龄段是不同的，在婴儿儿ALL中最多见，为中最多见，为5070%，而在儿童和成，而在儿童和成人中较低，分别为人中较低，分别为2%和和36%此类患者发病年龄低（通常此类患者发病年龄低（通常 90%CML患者患者BCR-ABL融合蛋白（融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激的酪氨酸蛋白激酶活性较正常酶活性较正常ABL高，可能是高，可能是BCR对对ABL激酶激酶活性调节区的作用所致活性调节区的作用所致由于由于5%CML患者为隐匿性患者为隐匿性Ph染色体，因此染色体，因此无无Ph染色体染色体CML患者还需使用更灵敏的分子患者还
24、需使用更灵敏的分子检测手段如检测手段如FISH或或RT-PCR检测检测BCR-ABL融融合基因合基因RT-PCR还能区分还能区分e1-a2和和b2-a2/b3-a2二种二种BCR-ABL转录本，从而区分转录本，从而区分ALL患者与患者与CML急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案同的治疗方案 b3a2+b2a2+阴性阴性BCR-ABL（p210）巢式巢式RT-PCR检测检测BCR-ABL融合基因用融合基因用于于CML移植患者移植后移植患者移植后MRD监测。可在监测。可在患者血液学复发前的患者血液学复发前的624个月骨髓检测个月骨髓检测就呈阳
25、性。就呈阳性。RQ-PCR更能动态观察患者治疗（格列更能动态观察患者治疗（格列卫，骨髓移植等）后卫，骨髓移植等）后BCR-ABL转录本水转录本水平变化情况，反映疗效。平变化情况，反映疗效。FIP1L1-PDGFRdel(4)(q12;q12)见于见于HES和和CEL，中位发生频率，中位发生频率23%(0-56%)由于断裂点不同以及由于断裂点不同以及FIP1L1多种选择性剪切形多种选择性剪切形式，产生了不同的融合蛋白，但研究发现所有式，产生了不同的融合蛋白，但研究发现所有的病例必有一种融合蛋白维持读码框架，并保的病例必有一种融合蛋白维持读码框架，并保留留PDGFR的激酶活性区。的激酶活性区。FI
26、P1L1-PDGFR融合蛋融合蛋 白具有失调的蛋白酪氨酸白具有失调的蛋白酪氨酸 激酶活性。激酶活性。基因突变基因突变45%AML患者核型正常，预后属中等风险组，患者核型正常，预后属中等风险组，但其实这是一组异质性很高的人群，有赖于通但其实这是一组异质性很高的人群，有赖于通过基因突变检测对其分类过基因突变检测对其分类基因突变分二大类：基因突变分二大类：Class I 突变激活信号转导通路，增加造血前突变激活信号转导通路，增加造血前体细胞增殖、存活。如体细胞增殖、存活。如FLT3，RAS，JAK2 Class II 突变影响转录因子或转录共激活复突变影响转录因子或转录共激活复合物成员，从而影响细胞
27、分化。如合物成员，从而影响细胞分化。如CEBPA，MLL，NPMC-KIT基因突变基因突变C-KIT为为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和和c-KIT）成员之一成员之一C-KIT突变可见于伴突变可见于伴inv(16)的的M4以及伴以及伴t(8;21)的的M2患者患者26/54例例(48.1%)M2b患者中检测到患者中检测到C-KIT基因基因突变突变57例不伴例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未的其他类型血液肿瘤患者均未检测到检测到C-KIT基因突变基因突变以上结果提示以上结果提示C-KIT突变与突变与M2b密切相关密切相关(R=0.
28、94,P0.01)C-KIT基因突变基因突变C-KIT基因结构基因结构JMC-KIT基因突变基因突变KIT突变主要有两种。第一种位于受体胞突变主要有两种。第一种位于受体胞外部分的外部分的8号外显子；第二种位于号外显子；第二种位于17号外号外显子的显子的816编码子。编码子。外周血白细胞计数外周血白细胞计数C-KIT基因突变基因突变多因素分析显示，多因素分析显示，KIT突变提示预后不良、突变提示预后不良、生存期缩短。生存期缩短。FLT3基因突变基因突变Fms-related tyrosine kinase 3FLT3为为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，P
29、DGFR和和c-KIT）成员之一，该类受成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用挥重要调控作用综合国外各研究报道，综合国外各研究报道，FLT3-ITD和和D835突变突变在在AML中阳性率分别为中阳性率分别为24%(385/1585)和和7%(30/429)，总阳性率超过，总阳性率超过30%，使其成为，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现，许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后突变还与临床预后密切相关，尤对密切相关，尤对60岁以下的岁以下的AML患者，患者，FLT3突变患者预后较
30、差，且可独立于核型之外突变患者预后较差，且可独立于核型之外FLT3基因突变基因突变FLT3基因突变基因突变FLT3基因主要突变类型基因主要突变类型FLT3基因突变基因突变mut-FLT3信号通路信号通路FLT3基因突变基因突变外周血白细胞计数外周血白细胞计数020406080100120140160 FLT3-ITD-FLT3-ITD+APL患者初发时外周血WBC计数(x109)NPM基因突变基因突变Nucleophosmin，为核为核-浆穿梭蛋白，调控浆穿梭蛋白，调控p53-ARF通路通路见于约见于约50%核型正常的核型正常的AML患者，而在伴低患者，而在伴低危危/高危核型患者中极少见高危核
31、型患者中极少见主要见于主要见于M1，M2，M4中，以原发中，以原发AML为主，为主，而在而在MDS继发继发AML和和t-AML中少见中少见伴此突变患者伴此突变患者WBC计数高计数高NPM突变患者预后较好（突变患者预后较好（CR率高，率高，EFS/OS更更长），但长），但NPM突变同时伴突变同时伴FLT3-ITD者预后差，者预后差，NPM+/FLT3-ITD+预后与预后与NPM-/FLT3-ITD+接接近近NPM基因突变基因突变第第12号外显子的插入号外显子的插入/缺失。缺失。14种突变型，种突变型，A型最多（近型最多（近90%），其次），其次D型（近型（近10%）MLL-PTDMLL-part
32、ial tandem duplications约约90%三体三体11，近，近10%核型正常的核型正常的AML，少少部分部分t-AML发生频率与年龄有关（老年患者中频率较高）发生频率与年龄有关（老年患者中频率较高）与与FAB分类关系不大分类关系不大主要类型有主要类型有e9/e3，e10/e3，e11/e3MLL-PTD突变总是同时伴有突变总是同时伴有MLL野生型等位野生型等位基因的静默基因的静默 此类患者预后差此类患者预后差MLL-PTD可与可与FLT3-ITD共存共存MLL-PTDMLL-PTD产生原因是由于产生原因是由于Alu重复序列重复序列的错配的错配MLL-PTD可导致可导致wt-MLL
33、活性丧失，此活性丧失，此外重复的外重复的DNA结合结构域可导致高转录结合结构域可导致高转录激活能力，从而致病激活能力，从而致病MLL-PTD在正常人中也存在，但在正常人中也存在，但AML患者中患者中MLL-PTD表达水平比正常人高表达水平比正常人高4 log，患者患者MLL-PTD表达下降水平可反表达下降水平可反映其预后映其预后CEBPA基因突变基因突变CCAAT/enhancer binding protein gene，是髓系多能祖细胞向成熟中性粒细胞分化是髓系多能祖细胞向成熟中性粒细胞分化的关键基因的关键基因见于约见于约10%左右的核型正常左右的核型正常AML主要见于主要见于M2，M1突
34、变可导致突变可导致CEBPA蛋白蛋白N端截短，此截短端截短，此截短的的CEBPA蛋白可抑制野生型蛋白可抑制野生型CEBPA的的DNA结合和转录激活能力结合和转录激活能力突变患者预后较好突变患者预后较好N-RAS基因突变基因突变为为RAS基因家族成员之一，染色体定位于基因家族成员之一，染色体定位于1p32.2。具有具有GTP/GDP结合和结合和GTPase活性，活性，调控正常细胞的生长调控正常细胞的生长此基因突变存在于此基因突变存在于11-30%AML在在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，中突变率较高，而在而在t(15;17)中低中低突变热点位于突变热点位
35、于codon12,13和和61伴此突变患者外周血伴此突变患者外周血WBC计数低计数低该突变预后意义尚不明该突变预后意义尚不明WT-1基因突变基因突变Wilms tumor 1存在于约存在于约10%核型正常核型正常AML患者中患者中突变主要存在于突变主要存在于exon7和和exon9突变类型主要是移码突变，其次置换突突变类型主要是移码突变，其次置换突变变突变患者预后差突变患者预后差NOTCH1基因突变基因突变NOTCH1信号对信号对CLP(common lymphoid progenitors)向向T细胞定向以及前细胞定向以及前T细胞受体复细胞受体复合物组装是必须的合物组装是必须的35-50%T
36、-ALL患者存在此基因突变患者存在此基因突变伴伴NOTCH1基因突变的成年基因突变的成年T-ALL患者预后较患者预后较差差NOTCH1基因突变基因突变NOTCH1基因结构基因结构NOTCH1基因突变基因突变NOTCH1突变患者预后差突变患者预后差GATA2基因突变基因突变调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力CML急变患者中新发现急变患者中新发现GATA2基因突变，基因突变，而而CML慢性期、加速期，慢性期、加速期，AML（M1-M7），），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，
37、淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常对照均未发现该突变，可见以及正常对照均未发现该突变，可见GATA2基因突变仅与基因突变仅与CML急变相关，是急变相关，是CML疾病进疾病进展过程中的获得性突变。总发生率为展过程中的获得性突变。总发生率为12.5%（5/40），且均造成，且均造成CML急粒单变急粒单变GATA2基因基因突变与突变与CML患者疾病进展和预后患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明的关系有待进一步阐明JAK2基因突变基因突变Janus kinase 2此基因突变主要见于此基因突变主要见于MPD和和MDS，另可存在另可存在于部分于部分AML尤尤M2骨髓增殖性疾病中，骨髓增殖性疾病中，JAK2V
38、617F突变在突变在PV中中发生率约发生率约95%，在，在IMF中发生率约中发生率约58%，在，在ET中的发生率约中的发生率约50%。突变主要为突变主要为V617F突变去除了突变去除了JAK2 JH2负性调控，导致该基因负性调控，导致该基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优势的持续活化，赋予细胞增殖存活优势JAK2可成为靶向治疗的靶点可成为靶向治疗的靶点t(1;19)(q23;p13)；BCR-ABL融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激酶活性较正常ABL高，可能是BCR对ABL激酶活性调节区的作用所致SNP的检测质谱检测技术由于5%CML患者为隐匿性Ph染色体，因此无Ph染色体CML患者还需使用更灵
39、敏的分子检测手段如FISH或RT-PCR检测BCR-ABL融合基因t(9;11)(p22;q23)；可在较高分辨率的基础上检测等位基因信息和拷贝数异常。补充MIC检查的不足见于约10%左右的核型正常AML主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞M4，少见于M2A T T C C G G A T A C T A C Tt(12;21)(p13;q22)；MLL-PTD可导致wt-MLL活性丧失，此外重复的DNA结合结构域可导致高转录激活能力，从而致病通过肿瘤组织中的信号值与正常组织之间的信号值之比得出受检等位基因在全基因组中的拷贝数变化。累及MLL基因的分子异常见于5.5%（5/40），且均造成
40、CML急粒单变变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)GATA2基因突变与CML患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明在核型正常的青年AML中，MN1基因的表达异常与高复发率和较短的生存期相关。IKZF1基因基因位于位于7号染色体号染色体,转录产物为转录产物为ikaros C端端2个锌指结构介导个锌指结构介导ikaros家族蛋白的二聚化，家族蛋白的二聚化，N端锌端锌指结构介导指结构介导ikaros和和DNA的结合。的结合。Ikaros对正常造血时淋系的分化起关键作用。对正常造血时淋系的分化起关键作用。由于由于IKZF1基因转录后的选择性剪接导致不同基因转录后的选择性剪接导致不同isoform的形成。目
41、前主要有的形成。目前主要有13种已经命名的种已经命名的isoform。IK1，IK2，IK3为长片段的野生型为长片段的野生型isoform，在正常骨在正常骨髓髓,胸腺及胎肝的造血细胞中表达。短片段无胸腺及胎肝的造血细胞中表达。短片段无DNA结合结合功能的功能的isoform对野生型对野生型isoform 有显性负的抑制作用，有显性负的抑制作用，转入无转入无DNA结合功能的结合功能的Ikaros isoform的小鼠可发生白的小鼠可发生白血病。血病。diagramIKZF1基因基因IKZF1基因基因在淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病急变的白血病在淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病急变的白血病细胞中
42、检出无细胞中检出无DNA结合功能的短片段结合功能的短片段isoformIkaros isoform在各类白血病患者及正常人中的表达频在各类白血病患者及正常人中的表达频率率HOX11基因异常表达基因异常表达 t(10;14)(q24;q11)，t(7;10)(q34;q24)7%的的T-ALL 易位使易位使HOX11基因受控于基因受控于TCR和和TCR基因调控序列，导致其异常基因调控序列，导致其异常表达表达另有部分另有部分HOX11高表达患者核型正常高表达患者核型正常伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，预后也较其他预后也较其他T-ALL患者要好，完全缓患者要好
43、，完全缓解率为解率为100%，平均无病生存期为，平均无病生存期为46个月，个月，3年无病生存率为年无病生存率为75%HOX11L2基因异常表达基因异常表达t(5;14)(q35;q32)20%的儿童的儿童T-ALL 易位使易位使HOX11L2基因处于基因处于CTIP2调控元件的控调控元件的控制下，而制下，而CTIP2基因在基因在T淋巴细胞分化时高度淋巴细胞分化时高度表达表达在随访患者中检测到高水平在随访患者中检测到高水平HOX11L2说明白血说明白血病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患者者HOX11L2表达水平迅速降低，并维持在一个表达水平迅速降低，
44、并维持在一个低水平。可见低水平。可见HOX11L2的表达水平可作为的表达水平可作为MRD检测的标志检测的标志 WT-1基因高表达基因高表达Wilms tumor 1在正常人中低表达在正常人中低表达是无特异分子异常的急性白血病患者理是无特异分子异常的急性白血病患者理想的想的MRD检测指标检测指标伴此基因高表达者预后差，且表达程度伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关与预后相关基因表达异常基因表达异常 BAALC基因基因最初表达于神经外胚层衍生组织和最初表达于神经外胚层衍生组织和造血祖细胞中，成熟血细胞中不表达。在保留造血祖细胞中，成熟血细胞中不表达。在保留野生型野生型FLT3等位基因（包括
45、等位基因（包括FLT3-ITD杂合突杂合突变）的患者中，外周血细胞异常高表达变）的患者中，外周血细胞异常高表达BAALC提示预后不良、生存期缩短。提示预后不良、生存期缩短。ERG基因基因属于属于ETS转录因子家族成员，参与调转录因子家族成员，参与调节细胞增殖、分化和凋亡。在核型正常的青年节细胞增殖、分化和凋亡。在核型正常的青年AML中，外周血中，外周血ERG基因异常高表达提示预基因异常高表达提示预后不良。而且，在伴后不良。而且，在伴NPM+/FLT3-ITD-突变突变的患者中，的患者中，ERG基因异常高表达可以逆转其良基因异常高表达可以逆转其良好预后，导致无病生存期缩短。好预后，导致无病生存期
46、缩短。基因表达异常基因表达异常 MN1基因基因克隆于伴平衡易位克隆于伴平衡易位t(12;22)(p13;q11-12)的的AML，与与ETV6基因形成基因形成融合基因。在核型正常的青年融合基因。在核型正常的青年AML中，中，MN1基因的表达异常与高复发率和较短基因的表达异常与高复发率和较短的生存期相关。的生存期相关。EVI1基因基因异常高表达在核型中危异常的异常高表达在核型中危异常的AML中提示预后较差，但需同时排查中提示预后较差，但需同时排查NPM1、FLT3、CEBPA等基因突变的影等基因突变的影响。响。SNP(Single Nucleotide Polymorphism)SNP定义定义
47、DNA序列的某个位点上存在的单个碱基序列的某个位点上存在的单个碱基变化变化(替代、插入或缺失替代、插入或缺失)，在人群中发生，在人群中发生频率超过频率超过1%SNPSNP的数量和分布的数量和分布人类基因组计划人类基因组计划所有的所有的SNPSNP与基因有关的与基因有关的SNPSNP与疾病有关的与疾病有关的SNPSNP致病性致病性SNPSNPSNPrSNPrSNP：位于调控区的多态，有可能改变转录因：位于调控区的多态，有可能改变转录因子的结合位点，因而影响基因的表达量子的结合位点，因而影响基因的表达量cSNPcSNP：在基因的编码区，如引起蛋白质重要部：在基因的编码区，如引起蛋白质重要部位氨基酸
48、的变化，会导致蛋白功能及活性改变位氨基酸的变化，会导致蛋白功能及活性改变iSNPiSNP：位于内含子，如果靠近编码区，有可能：位于内含子，如果靠近编码区，有可能会影响会影响mRNAmRNA的剪接。这种情况并不多见的剪接。这种情况并不多见其他其他SNPSNP：分布在基因组其它部位的：分布在基因组其它部位的SNPSNP。虽然。虽然可能与基因功能改变不直接相关，但可以作为可能与基因功能改变不直接相关，但可以作为标记，用于疾病基因的寻找，群体遗传学的研标记，用于疾病基因的寻找，群体遗传学的研究等究等SNP的检测的检测对未知多态的检测对未知多态的检测直接测序直接测序变性梯度凝胶电泳分析变性梯度凝胶电泳分
49、析(DGGE)(DGGE)变性高效液相色谱分析变性高效液相色谱分析(DHPLC)(DHPLC)在人群中筛查已知多态在人群中筛查已知多态 大规模大规模SNPSNP分型方法如分型方法如荧光定量、焦磷酸测序、荧光定量、焦磷酸测序、质谱检测、荧光磁珠等质谱检测、荧光磁珠等SNP的检测的检测直接测序直接测序CTCCSNP的检测的检测直接测序直接测序AACAGT/-AACAGT/-SNP的检测的检测质谱检测技术质谱检测技术基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser matrix-assisted laser desorption/ion
50、ization time-of-flight desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFmass spectrometry,MALDI-TOF）原理：在激光飞行时间质谱仪中，样品被基质原理：在激光飞行时间质谱仪中，样品被基质吸附后形成晶体，在激光激发下变成亚稳态的吸附后形成晶体，在激光激发下变成亚稳态的离子，在强电场作用下在真空管中飞行达检测离子，在强电场作用下在真空管中飞行达检测器。离子质量越小，带的负电荷越多，会越快器。离子质量越小，带的负电荷越多，会越快到达检测器，据此可准确区分出分子量相差很到达检测器
