1、第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导优选第九单元免疫增殖病的免疫优选第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导学检验实验指导v 当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变等免疫球蛋白病时，一般先以血清蛋白区浆细胞恶变等免疫球蛋白病时，一般先以血清蛋白区带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作为初筛实验。为初筛实验。v 如果发现有异常球蛋白区带，继而进行免疫固定电泳、如果发现有异常球蛋白区带，继而进行免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析和免疫免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步
2、定量分析和免疫球蛋白分类鉴定。球蛋白分类鉴定。实验一实验一血清免疫固定电泳实验血清免疫固定电泳实验实验目的实验目的v 本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习v 通过实习，熟悉血清免疫固定电泳的实验过程及通过实习，熟悉血清免疫固定电泳的实验过程及注意事项；掌握血清免疫固定电泳检测注意事项；掌握血清免疫固定电泳检测M蛋白的蛋白的基本原理与临床意义。基本原理与临床意义。实验原理实验原理v 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂和各型和各型Ig及其轻链抗血清加于凝胶表面的各自泳道上，经及其轻链抗血清
3、加于凝胶表面的各自泳道上，经孵育让固定剂和抗血清在各自泳道对应的凝胶内渗透并扩孵育让固定剂和抗血清在各自泳道对应的凝胶内渗透并扩散，若有对应抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合散，若有对应抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋物并沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋白质，仅保留贮存在凝胶内的抗原抗体复合物。经染色后白质，仅保留贮存在凝胶内的抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色染色液着色。根据电泳移动距离分离出单克隆组分。液着色。根据电泳移动距离分
4、离出单克隆组分。试剂与器材试剂与器材v Acide Violet染色液：用染色液：用1L 10%冰醋酸溶解冰醋酸溶解Acide Violet。v 脱色液：用脱色液：用1L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Citric Acid Destain。v 清洗液清洗液：8L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。v 电泳仪：电泳仪：spife 3000全自动电泳仪。全自动电泳仪。Spife 3000全自动电泳仪全自动电泳仪操作步骤操作步骤v样本处理：样本处理：用生理盐水将血清标本适当稀释后备用，其中同一份血清用生理盐水将血清标本适当稀释后备用，其中同一份血清第一泳道样本稀释第一泳道样本稀释3倍
5、，第二至第六泳道样本稀释倍，第二至第六泳道样本稀释5倍。倍。v区带电泳区带电泳 上样上样 胶片准备胶片准备 电泳电泳v沉淀反应沉淀反应 加抗血清加抗血清洗涤、烘干洗涤、烘干着着 色色 结果分析结果分析 v 对染色烘干后的胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白对染色烘干后的胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道，观察第二至第六泳道有无对应的特异性单分子量参考道，观察第二至第六泳道有无对应的特异性单克隆免疫球蛋白条带。如图克隆免疫球蛋白条带。如图12-1所示所示,其中其中sp泳道为血清泳道为血清蛋白参考道，由下至上分别为白蛋白、蛋白参考道，由下至上分别为白蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球蛋球蛋
6、白、白、球蛋白、球蛋白、球蛋白。第球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分别为泳道分别为IgG、IgA、IgM、抗血清泳道。抗血清泳道。注意事项注意事项v 标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。v 总免疫球蛋白的水平总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平白水平5g/L稀释剂量减半（除了稀释剂量减半（除了ELP泳道）。泳道）。v 某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰冻后，某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）
7、冷藏或冰冻后，可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下，加点样问题。在这样情况下，加25l液化剂于液化剂于75l血清中，混血清中，混匀匀15s。然后按规定程序继续进行。然后按规定程序继续进行。v 某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加25l还原剂（还原剂（1-巯基乙醇）于巯基乙醇）于75l血清混匀并令其反应血清混匀并令其反应至少至少15min（至多（至多3h)后按规定程序继续进
8、行。后按规定程序继续进行。v 在电泳之前，凝胶与电泳槽的贴合面充满电泳介质，在电泳之前，凝胶与电泳槽的贴合面充满电泳介质，并确保两者之间无气泡。并确保两者之间无气泡。本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。温州医学院 陶志华掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清IgG测定方法学的性能。本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。观察结果有无明显的数据差异
9、，若有明显差异时，应判断是否为离群点。若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若b在0.参考选用检测系统中血清IgG的检测范围选择低浓度标本和高浓度标本03范围内，a较大，试着舍去某组数据，另作回归统计。脱色液：用1L蒸馏水溶解Citric Acid Destain。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道，观察第二至第六泳道有无对应的特异性单克隆免疫球蛋白条带。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。
10、此范围如果超出了分析测量范围，可将标本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最后结果乘以稀释倍数。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。按实验要求，每个样品做6次重复测定，得6个实测值，它们和预期值形成6对数据。实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验v 在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。气泡。v 染色之前的胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤，以出染色之前的胶片一定
11、要置于洗涤液中充分洗涤，以出去游离的血清和抗血清成分，降低染色后凝胶的背景去游离的血清和抗血清成分，降低染色后凝胶的背景色。色。临床应用临床应用v 本法可对各类本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床及其轻链进行分型，最常用于临床常规常规M蛋白的分型与鉴定。通常用于单克隆蛋白的分型与鉴定。通常用于单克隆Ig增殖增殖病，单克隆病，单克隆Ig病，本周蛋白和游离轻链病、多组份病，本周蛋白和游离轻链病、多组份单克隆单克隆Ig病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多克隆克隆Ig病的诊断和鉴别诊断。病的诊断和鉴别诊断。v 免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作免
12、疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。周期短（仅需数小时）、结果易于分析。思考题思考题v 结合实验室的免疫固定电泳分析系统，简述血结合实验室的免疫固定电泳分析系统，简述血清免疫固定电泳的影响因素及其克服清免疫固定电泳的影响因素及其克服的方法。的方法。温州医学院温州医学院 陶志华陶志华实验二实验二 血清血清IgG定量检测的可定量检测的可报告范围评价实验报告范围评价实验 v 可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。v 分析测
13、量范围指对没有进行任何预处理（稀释，浓缩等）分析测量范围指对没有进行任何预处理（稀释，浓缩等）的标本，分析方法能够直接测定出的待测物范围，也就的标本，分析方法能够直接测定出的待测物范围，也就是系统最终的输出值（活性或浓度）与被分析物的活性是系统最终的输出值（活性或浓度）与被分析物的活性或浓度成线性比例的范围，它反映整个系统的输出特性。或浓度成线性比例的范围，它反映整个系统的输出特性。概述概述v 临床可报告范围临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。此范围如果超出了分析测量范围，可将标本通浓度范围。此范围如果超出了分析测量范围，可将标本通过稀
14、释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最后结果乘以稀释倍数。最后结果乘以稀释倍数。实验目的实验目的v 掌握血清掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清法学，了解血清IgG测定方法学的性能。测定方法学的性能。实验原理实验原理v 由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学检测项目应使用多点由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学检测项目应使用多点定标绘制标准曲线，在绘制的标准曲线上查阅结果。由于定标绘制标准曲线，在绘制的标准曲线上查阅结果。由于计算机技术的发展，仪器可对反应响应呈不同表现的结果计算机
15、技术的发展，仪器可对反应响应呈不同表现的结果做适当的处理，直接以最终计量单位方式报告检验结果，做适当的处理，直接以最终计量单位方式报告检验结果，在此情况下，评价患者结果可报告范围时，可不必再去评在此情况下，评价患者结果可报告范围时，可不必再去评价响应结果的真实曲线状态，只要将样品作不同程度的稀价响应结果的真实曲线状态，只要将样品作不同程度的稀释或配制后，将预期值和实际检测值作比较，绘制在坐标释或配制后，将预期值和实际检测值作比较，绘制在坐标纸上应呈一条通过原点、斜率为纸上应呈一条通过原点、斜率为1的直线。直线所达的限的直线。直线所达的限值即为该方法的患者结果可报告范围。值即为该方法的患者结果可
16、报告范围。试剂与器材试剂与器材v 选用与检测仪器相配套的试剂、校准品及其他选用与检测仪器相配套的试剂、校准品及其他辅助试剂辅助试剂v 参考选用检测系统中血清参考选用检测系统中血清IgG的检测范围选择的检测范围选择低浓度标本和高浓度标本低浓度标本和高浓度标本操作步骤操作步骤v 按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。处于良好状态。v 实验标本的配制，将血清实验标本的配制，将血清IgG的高（的高（H）和低（）和低（L）样品）样品按：按：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H关系各关系各自配制混合，形成系列
17、评价的实验样品。并计算各样品的自配制混合，形成系列评价的实验样品。并计算各样品的预期值。预期值。v 将系列评价的实验样品上机检测，每标本重复检测将系列评价的实验样品上机检测，每标本重复检测24次，次，结果记录于下表。结果记录于下表。v 依照稀释关系，计算各实验样品的预期值。按实验要求，依照稀释关系，计算各实验样品的预期值。按实验要求，每个样品做每个样品做6次重复测定，得次重复测定，得6个实测值，它们和预期值形个实测值，它们和预期值形成成6对数据。对数据。结果分析结果分析v 观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群点。是否为离
18、群点。v 在坐标纸上，以在坐标纸上，以X表示各样品的预期值，以表示各样品的预期值，以Y表示各样品的表示各样品的实测值，将实验结果点在图上。实测值，将实验结果点在图上。v 若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，用直线回归对若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若，若b在在0.971.03范围内，范围内，a接近于接近于0，则可直接判断测定方法可报告范，则可直接判断测定方法可报告范围在实验已涉及浓度。围在实验已涉及浓度。v 若若b不在不在0.971.03范围内，范围内，a较大，试着舍去某组数据，另较大，试着舍去某组数据
19、，另作回归统计。若缩小分析范围后，回归式有明显改善，若作回归统计。若缩小分析范围后，回归式有明显改善，若b接近于接近于1，a趋于趋于0。此时，缩小的分析范围可作为真实的可。此时，缩小的分析范围可作为真实的可报告范围。报告范围。注意事项注意事项v 进行可报告范围实验评价的样品必须与真实标本尽可能进行可报告范围实验评价的样品必须与真实标本尽可能相似，也要与真实标本具有相同的基质状态。相似，也要与真实标本具有相同的基质状态。v 评价样品要评价样品要5个或以上系列浓度的实验样品，浓度范围个或以上系列浓度的实验样品，浓度范围遍及整个预期可报告范围。最高浓度的样品应达到可报遍及整个预期可报告范围。最高浓度
20、的样品应达到可报告范围的上限。告范围的上限。v 若收不到低值样品，可收集高值样品，经系列不同程度若收不到低值样品，可收集高值样品，经系列不同程度稀释，形成系列评价样品。稀释，形成系列评价样品。v 一天内做完本实验，一般每个实验样品做一天内做完本实验，一般每个实验样品做24次重复测次重复测定。综合所有结果作统计学处理。定。综合所有结果作统计学处理。实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清IgG测定方法学的性能。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。标本需取新鲜血清进行
21、分析，为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若b在0.进行可报告范围实验评价的样品必须与真实标本尽可能相似，也要与真实标本具有相同的基质状态。临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。临床可报告范围的评价要对分析标本进行最大稀释度的评价实验，以此作为临床可报告范围的上限；免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结
22、果易于分析。若收不到低值样品，可收集高值样品，经系列不同程度稀释，形成系列评价样品。免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。Acide Violet染色液：用1L 10%冰醋酸溶解Acide本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群点。临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。在这样情况下可加25l还原剂（1-巯基乙醇）于75l血清混匀并令其反应至少15min（至多3h)后按规定程序继续
23、进行。本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学检测项目应使用多点定标绘制标准曲线，在绘制的标准曲线上查阅结果。参考选用检测系统中血清IgG的检测范围选择低浓度标本和高浓度标本上样免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。对染色烘干后的胶片进行判读。清洗液：8L蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。优选第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导按标本操作规程
24、做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。通常用于单克隆Ig增殖病，单克隆Ig病，本周蛋白和游离轻链病、多组份单克隆Ig病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多克隆Ig病的诊断和鉴别诊断。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群点。可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清IgG测定方法学的性能。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加
25、倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。应仔细阅读试剂说明书，某些检测项目不适宜用稀释方法获取系列浓度的临床新鲜血清标本，可采用商品质控物、校准品等。v 应仔细阅读试剂说明书，某些检测项目不适宜用稀释方法应仔细阅读试剂说明书，某些检测项目不适宜用稀释方法获取系列浓度的临床新鲜血清标本，可采用商品质控物、获取系列浓度的临床新鲜血清标本，可采用商品质控物、校准品等。校准品等。v 临床可报告范围的评价要对分析标本进行最大稀释度的临床可报告范围的评价要对分析标本进行最大稀释度的评价实验，以此作为临床可报告范围的上限；如果低限有评价实验，以此作为临床可报告范围的上限；如果低限有临床意义时，可增加分析标本反应量来进行检测下限评价临床意义时，可增加分析标本反应量来进行检测下限评价实验，并以此作为临床可报告范围下限。实验，并以此作为临床可报告范围下限。
