1、2022-10-111课题名称：课题名称：系统性免疫与粘膜免疫对小鼠系统性免疫与粘膜免疫对小鼠IgAIgA肾病模型的效果比较肾病模型的效果比较 课题立项号：课题立项号：20132013 197197 课题类别：医药卫生课题类别：医药卫生课题承担单位：芜湖市第一人民医院检验科课题承担单位：芜湖市第一人民医院检验科课题负责人：崔课题负责人：崔 凡凡2022-10-112一、课题立项背景：一、课题立项背景：IgA肾病肾病(IgA nephropathy，IgAN)是一组以是一组以IgA或或IgA为主的免疫复合物在肾为主的免疫复合物在肾小球系膜区沉积为主要特征、病因不明的小球系膜区沉积为主要特征、病因
2、不明的免疫免疫复合物肾小球肾炎，是世界范围内最复合物肾小球肾炎，是世界范围内最常见的原发性肾小球常见的原发性肾小球疾病疾病。IgA肾病典型的病理表现为：肾小球系膜细胞的增生、细胞基质增多以及新月体肾病典型的病理表现为：肾小球系膜细胞的增生、细胞基质增多以及新月体的形成，特征性免疫病理表现为大量免疫复合物（主要由的形成，特征性免疫病理表现为大量免疫复合物（主要由IgA、IgG类型抗体和补体类型抗体和补体C3组成）在系膜区的沉积。组成）在系膜区的沉积。一、课题立项背景：一、课题立项背景：目前目前IgA肾病模型小鼠的造模方法多是通过尾静脉注射免疫的方法。由于通过肾病模型小鼠的造模方法多是通过尾静脉注
3、射免疫的方法。由于通过静脉给药途径激活的事系统免疫系统（静脉给药途径激活的事系统免疫系统（systemic immune-system），因此产生的），因此产生的主要是主要是IgG类型抗体。粘膜免疫系统类型抗体。粘膜免疫系统(mucosal immune-system)主要分布于呼吸主要分布于呼吸道与消化道的淋巴结，通过口饲的方法免疫可以有效激活道与消化道的淋巴结，通过口饲的方法免疫可以有效激活IgA类型抗体的产生。但类型抗体的产生。但是由于胃肠屏障的存在，对抗原蛋白具有一定的降解和破坏作用。因此在相同抗原是由于胃肠屏障的存在，对抗原蛋白具有一定的降解和破坏作用。因此在相同抗原剂量下对比两种免
4、疫途径对剂量下对比两种免疫途径对IgA肾病模型造模效果的影响具有重要的意义。肾病模型造模效果的影响具有重要的意义。2022-10-1132022-10-114一、课题立项背景：一、课题立项背景：金黄色葡萄球菌表面蛋（金黄色葡萄球菌表面蛋（Staphylococcus aureus surface protein,SASP）属于病原菌外膜蛋白，研究证实）属于病原菌外膜蛋白，研究证实SASP可以导致可以导致IgA肾病的发生。肾病的发生。因此利用因此利用GFP-SASP重组蛋白做为免疫抗原，重组蛋白做为免疫抗原，通过不同的免疫途径（尾静脉注射与皮下），通过不同的免疫途径（尾静脉注射与皮下），分别刺激
5、小鼠系统性免疫系统和粘膜性免疫分别刺激小鼠系统性免疫系统和粘膜性免疫系统，并对比系统，并对比IgA水平的高低及抗体特异性水水平的高低及抗体特异性水平。从而提供更加接近与人类平。从而提供更加接近与人类IgA肾病的动物肾病的动物模型制备方法。模型制备方法。2022-10-115二、课题研究目标：二、课题研究目标：1 1、科学研究目标：、科学研究目标：IgAIgA肾病主要由于肾病主要由于IgA1IgA1型免疫球蛋白糖基化异常并沉积于肾小球系膜区从而导致型免疫球蛋白糖基化异常并沉积于肾小球系膜区从而导致肾脏炎性疾病的发生。由于肾脏炎性疾病的发生。由于IgA1IgA1型免疫球蛋白仅表达于灵长类动物，从伦
6、理学角度考型免疫球蛋白仅表达于灵长类动物，从伦理学角度考虑急需建立一套有效的动物虑急需建立一套有效的动物IgAIgA肾病研究提供研究模型。肾病研究提供研究模型。因此我们拟建立因此我们拟建立IgAIgA肾病小鼠模型，对比两种不同的免疫方法对小鼠免疫系统的肾病小鼠模型，对比两种不同的免疫方法对小鼠免疫系统的激活效果，以及抗原蛋白在肾小球系膜区的沉积量。为小鼠激活效果，以及抗原蛋白在肾小球系膜区的沉积量。为小鼠 IgA IgA 肾病的造模提供优化肾病的造模提供优化方案，为评估小鼠方案，为评估小鼠IgAIgA肾病模型是否可以稳定再现肾病模型是否可以稳定再现IgAIgA肾病的临床特征，从而为肾病的临床特
7、征，从而为IgAIgA肾病肾病的治疗和研究提供模型工具。的治疗和研究提供模型工具。2 2、人才培养目标：、人才培养目标：我们计划通过本研究项目的研究培养科室人员良好的我们计划通过本研究项目的研究培养科室人员良好的 科研学术素养，提高学科队科研学术素养，提高学科队伍科研逻辑思维能力，创新能力，使科室工作人员在做好本职工作的基础上跟上学科伍科研逻辑思维能力，创新能力，使科室工作人员在做好本职工作的基础上跟上学科发展的前沿。发展的前沿。2022-10-116三、课题研究内容三、课题研究内容1、以、以GFP-SASP重组蛋白为抗原，通过两重组蛋白为抗原，通过两种不同免疫途径（系统免疫途径、粘膜免种不同
8、免疫途径（系统免疫途径、粘膜免疫途径）进行小鼠造模，研究疫途径）进行小鼠造模，研究GFP-SASP在小鼠血清及肾小球系膜区的沉积分布。在小鼠血清及肾小球系膜区的沉积分布。2、研究小鼠血清、研究小鼠血清GFP-SASP特异性特异性IgA及及IgG抗体水平，并对比两种免疫方所产生抗体水平，并对比两种免疫方所产生的抗体滴度水平差异。的抗体滴度水平差异。2022-10-117三、课题研究内容三、课题研究内容3、研究实验小鼠肾小球的病理改变，分析肾小球系膜区结构变化及系膜细胞、研究实验小鼠肾小球的病理改变，分析肾小球系膜区结构变化及系膜细胞的增生程度，及肾脏切片的免疫复合物沉积分布情况。的增生程度，及肾
9、脏切片的免疫复合物沉积分布情况。4、研究实验小鼠肾功能的改变，观察小鼠发生血尿及蛋白尿的情况，以评估、研究实验小鼠肾功能的改变，观察小鼠发生血尿及蛋白尿的情况，以评估肾脏功能的改变。肾脏功能的改变。2022-10-118四、课题创新点四、课题创新点 金黄色葡萄球菌外膜蛋白抗原是金黄色葡萄球菌外膜蛋白抗原是IgA肾病造模的理想抗原，本项目通过肾病造模的理想抗原，本项目通过重组金黄色葡萄球菌外膜抗原的靶抗重组金黄色葡萄球菌外膜抗原的靶抗原（原（35KDa肽）与绿色荧光蛋白肽）与绿色荧光蛋白（GFP），获得具有荧光活性的），获得具有荧光活性的GFP-P35KDa重组蛋白。该重组蛋白具有灵重组蛋白。该
10、重组蛋白具有灵敏度高，检测方便等特点，从而为敏度高，检测方便等特点，从而为IgA肾病模型的鉴定提供有效的检测工具。肾病模型的鉴定提供有效的检测工具。2022-10-119五、课题研究方法五、课题研究方法1、实验动物分组：、实验动物分组：C57BL/6 C57BL/6 清洁级雌性小鼠，清洁级雌性小鼠，6-86-8周龄，饲养于无菌代谢笼。分组：系统免疫组、周龄，饲养于无菌代谢笼。分组：系统免疫组、粘膜免疫组、和空白对照组；每组分别饲养粘膜免疫组、和空白对照组；每组分别饲养1212只小鼠。只小鼠。五、课题研究方法五、课题研究方法2、抗原制备及免疫、抗原制备及免疫：2.1 将将GFP-SASP重组蛋白
11、用重组蛋白用PBS溶液配制成溶液配制成2mg/ml的抗原悬液共的抗原悬液共100ml备用。备用。2.2 系统免疫组小鼠给予每周系统免疫组小鼠给予每周1次尾静脉注射次尾静脉注射GFP-SASP抗原悬液，每次抗原悬液，每次250l，共共7周。粘膜免疫组小鼠给予每周周。粘膜免疫组小鼠给予每周1次皮下注射次皮下注射GFP-SASP抗原悬液，每次抗原悬液，每次 250l，共，共7周。空白对照组正常饲养处理，不给予抗原免疫。周。空白对照组正常饲养处理，不给予抗原免疫。2022-10-1111五、课题研究方法五、课题研究方法3、小鼠尿液样本采集：、小鼠尿液样本采集：各组小鼠行免疫刺激前分别收集尿液标本，各组
12、小鼠行免疫刺激前分别收集尿液标本，并在每次免疫刺激后并在每次免疫刺激后24小时内收集尿液标本小时内收集尿液标本1次，每组小鼠共计收集尿液标本次，每组小鼠共计收集尿液标本8次。检测并次。检测并记录尿标本中蛋白含量水平及血红素水平。记录尿标本中蛋白含量水平及血红素水平。4、小鼠血清的采集及病理标本制作：、小鼠血清的采集及病理标本制作：在第在第7周免疫加强后的第周免疫加强后的第24小时，摘眼取血小时，摘眼取血法收集小鼠血液，离心取血清后冻存备用。取法收集小鼠血液，离心取血清后冻存备用。取血后处死小鼠，取回结肠粘膜，并保留小鼠肾血后处死小鼠，取回结肠粘膜，并保留小鼠肾脏已备后续制作病理标本。脏已备后续
13、制作病理标本。2022-10-1112五、课题研究方法五、课题研究方法5、血清抗体水平检测：、血清抗体水平检测：5.1 ELISA法检测各组小鼠血清总法检测各组小鼠血清总IgG及总及总IgA水平。水平。5.2 ELISA法检测各组小鼠血清抗法检测各组小鼠血清抗GFP-SASP特异性特异性IgG及及IgA水平。对比分析各组小鼠血清抗体水平的水平。对比分析各组小鼠血清抗体水平的差异。差异。6、病理标本、病理标本6.1 回结肠粘膜：荧光显微镜观察系统免疫组及粘膜回结肠粘膜：荧光显微镜观察系统免疫组及粘膜免疫组回结肠粘膜的荧光强度，并对比各组小鼠荧免疫组回结肠粘膜的荧光强度，并对比各组小鼠荧光强度的差
14、异，以此判断不同免疫方法所造成的靶光强度的差异，以此判断不同免疫方法所造成的靶器官对器官对GFP-SASP抗原的摄入情况。抗原的摄入情况。ELISA法检测各法检测各组小鼠回结肠粘膜免疫复合物的沉积分布情况。组小鼠回结肠粘膜免疫复合物的沉积分布情况。2022-10-1113五、课题研究方法五、课题研究方法6.2 肾脏标本：对肾脏标本行常规病理切片，电子显微镜观察各组小鼠肾小球系膜肾脏标本：对肾脏标本行常规病理切片，电子显微镜观察各组小鼠肾小球系膜细胞的增生程度以及肾小球系膜区的结构变化。细胞的增生程度以及肾小球系膜区的结构变化。ELISA法检测各组小鼠肾小球系膜法检测各组小鼠肾小球系膜区免疫复合
15、物的沉积分布情况。区免疫复合物的沉积分布情况。7、通过对比各组小鼠的血清抗体水平、血尿蛋白尿水平及胃肠粘膜和肾脏的抗原、通过对比各组小鼠的血清抗体水平、血尿蛋白尿水平及胃肠粘膜和肾脏的抗原沉积及免疫复合物沉积水平，综合评判系统免疫法和粘膜免疫法对沉积及免疫复合物沉积水平，综合评判系统免疫法和粘膜免疫法对IgA肾病小鼠造肾病小鼠造模的影响，并总结出最优的造模方法。模的影响，并总结出最优的造模方法。2022-10-1114六、研究实施步骤六、研究实施步骤（一）课题研究启动阶段（一）课题研究启动阶段1 1、准备实验材料、对抗原蛋白进行免疫前优化处理，摸索最佳免疫条件。、准备实验材料、对抗原蛋白进行免
16、疫前优化处理，摸索最佳免疫条件。2 2、血清学分析小鼠特异性抗体的基础水平。、血清学分析小鼠特异性抗体的基础水平。3 3、调整一院检验科生物实验室环境、预备工作。、调整一院检验科生物实验室环境、预备工作。4 4、协调独立实验室荧光标记制片工作。、协调独立实验室荧光标记制片工作。（二）探索研究阶段（二）探索研究阶段1 1、荧光显微镜观察模型小鼠肾脏病理切片、荧光显微镜观察模型小鼠肾脏病理切片IgAIgA、IgGIgG等指标的荧光特征，通等指标的荧光特征，通 过过HEHE染色观察模型小鼠肾脏病理变化。染色观察模型小鼠肾脏病理变化。2 2、分析两种不同免疫途径动物模型血清学变化差异。、分析两种不同免
17、疫途径动物模型血清学变化差异。3 3、研究分析模型小鼠尿液指标的变化。、研究分析模型小鼠尿液指标的变化。2022-10-1116六、研究实施步骤六、研究实施步骤（三）整理、总结阶段（三）整理、总结阶段1 1、完善后续实验并进一步优化实验条件。、完善后续实验并进一步优化实验条件。2 2、总结、撰写并发表论文，完成预期目标。、总结、撰写并发表论文，完成预期目标。2022-10-1117七、研究成果七、研究成果（一）（一）SASP-GFPSASP-GFP重组蛋白的表达、纯化。重组蛋白的表达、纯化。如上图所示，凝胶法显示如上图所示，凝胶法显示70KD位置条带即为重组蛋白。位置条带即为重组蛋白。2022
18、-10-1118七、研究成果七、研究成果（一）（一）SASP-GFPSASP-GFP重组蛋白的表达、纯化。重组蛋白的表达、纯化。如上图所示，如上图所示，Western Blot验证验证70KD条带即为重组蛋白条带即为重组蛋白（荧光标记抗体为抗（荧光标记抗体为抗SASP多克隆抗体）。多克隆抗体）。2022-10-1119七、研究成果七、研究成果（二）尿蛋白检测（二）尿蛋白检测平均值平均值SDSDT-testT-test皮下注射皮下注射GFPGFP1705.7595371705.759537120.0781848120.0781848controlcontrolSA0587-GFPSA0587-G
19、FP2143.0128342143.012834244.3957664244.39576640.0685488440.068548844尾静脉注射尾静脉注射GFPGFP1689.9032091689.90320983.8779895383.87798953controlcontrolSA0587-GFPSA0587-GFP1920.4221031920.422103216.0138305216.01383050.2612725590.2612725592022-10-1120七、研究成果七、研究成果（二）尿蛋白检测（二）尿蛋白检测 如上图所示，金黄色葡萄球菌表面蛋白如上图所示，金黄色葡萄球菌表
20、面蛋白-GFP融合蛋白经皮下注射及尾融合蛋白经皮下注射及尾静脉注射途径给药。数据结果示实验组小鼠尿蛋白水平明显高于对照组；皮静脉注射途径给药。数据结果示实验组小鼠尿蛋白水平明显高于对照组；皮下注射组小鼠与尾静脉注射组小鼠尿蛋白水平没有明显差异。下注射组小鼠与尾静脉注射组小鼠尿蛋白水平没有明显差异。2022-10-1121七、研究成果七、研究成果（三）模型小鼠肾脏切片及（三）模型小鼠肾脏切片及HE染色：染色：A图所示，实验组小鼠肾脏切片可见明显充血改变。图所示，实验组小鼠肾脏切片可见明显充血改变。B图示肾小球囊区炎性细胞浸润。图示肾小球囊区炎性细胞浸润。2022-10-1122七、研究成果七、研
21、究成果（四）模型小鼠肾脏切片荧光染色（四）模型小鼠肾脏切片荧光染色-共聚焦显微镜显影共聚焦显微镜显影如左图所示：如左图所示：A为为IgG荧光阳性显色为红色荧光阳性显色为红色B为为IgA阳性显色为绿色阳性显色为绿色C为为DCPI显示细胞核为蓝色显示细胞核为蓝色D为为A、B、C合成图片黄色区域为合成图片黄色区域为IgG-IgA复合物阳性复合物阳性2022-10-1123八、研究结论八、研究结论 通过系统免疫组小鼠与粘膜免疫组小鼠的试验结果比较发现，各组均见不同通过系统免疫组小鼠与粘膜免疫组小鼠的试验结果比较发现，各组均见不同程度的炎症、蛋白管型及肾小管上皮水肿等病变，各组小鼠的血清抗体水平、血程度
22、的炎症、蛋白管型及肾小管上皮水肿等病变，各组小鼠的血清抗体水平、血尿蛋白尿水平及胃肠粘膜和肾脏的抗原沉积及免疫复合物沉积水平较对照组有显尿蛋白尿水平及胃肠粘膜和肾脏的抗原沉积及免疫复合物沉积水平较对照组有显著性差异，另外金黄色葡萄球菌表面蛋白著性差异，另外金黄色葡萄球菌表面蛋白-GFP-GFP融合蛋白可以诱发小鼠发生融合蛋白可以诱发小鼠发生IgAIgA肾肾病，通过皮下注射和尾静脉免疫两种方法均可以导致小鼠蛋白尿的产生，小鼠肾病，通过皮下注射和尾静脉免疫两种方法均可以导致小鼠蛋白尿的产生，小鼠肾脏脏HEHE染色表现典型的充血及炎症浸润性病理变化，利用共聚焦显微镜也观察到了染色表现典型的充血及炎症
23、浸润性病理变化，利用共聚焦显微镜也观察到了在肾小球系膜区在肾小球系膜区IgG-IgAIgG-IgA共沉淀的免疫病理变化。因此，以金黄色葡萄球菌表面共沉淀的免疫病理变化。因此，以金黄色葡萄球菌表面蛋白蛋白-GFP-GFP融合蛋白为抗原免疫小鼠可以得到稳定的融合蛋白为抗原免疫小鼠可以得到稳定的IgAIgA肾病模型。肾病模型。2022-10-1124九、任务书指标完成情况九、任务书指标完成情况 本研究按照任务合同书计划，基本完成所拟定的各项研究目标。得本研究按照任务合同书计划，基本完成所拟定的各项研究目标。得出的结果为：通过比较系统免疫组小鼠与粘膜免疫组小鼠的试验结果发现，出的结果为：通过比较系统免
24、疫组小鼠与粘膜免疫组小鼠的试验结果发现，皮下注射和尾静脉免疫两种方法均可以导致小鼠肾脏发生皮下注射和尾静脉免疫两种方法均可以导致小鼠肾脏发生IgAIgA肾病的典型病肾病的典型病变，同时也验证金黄色葡萄球菌表面蛋白变，同时也验证金黄色葡萄球菌表面蛋白-GFP-GFP融合蛋白可以用作抗原免疫融合蛋白可以用作抗原免疫Balb/cBalb/c小鼠，使小鼠产生小鼠，使小鼠产生IgAIgA肾病模型。与国内外研究结论基本一致。肾病模型。与国内外研究结论基本一致。2022-10-11252022-10-1126十、项目取得的成效十、项目取得的成效 通过对本课题项目的深入研究，提高了本学科专业技术人员的科学素养
25、，也通过对本课题项目的深入研究，提高了本学科专业技术人员的科学素养，也使研究人员对使研究人员对IgA肾病的发病机制有了更加全面的认识。从而可以站在更高的角度肾病的发病机制有了更加全面的认识。从而可以站在更高的角度来思考学科的发展方向，激励了团队人员的创新意识以及继续学习的兴趣，从而来思考学科的发展方向，激励了团队人员的创新意识以及继续学习的兴趣，从而提升了本学科的学科建设水平。提升了本学科的学科建设水平。2022-10-1127十一、项目应用发展的设想十一、项目应用发展的设想 通过本实验的研究，我们初步探索了通过本实验的研究，我们初步探索了通过比较系统免疫组小鼠与粘膜免通过比较系统免疫组小鼠与
26、粘膜免疫组小鼠的试验结果发现，皮下注射和尾静脉免疫两种方法均可以导致小鼠肾疫组小鼠的试验结果发现，皮下注射和尾静脉免疫两种方法均可以导致小鼠肾脏发生脏发生IgAIgA肾病的典型病变，同时也验证金黄色葡萄球菌表面蛋白肾病的典型病变，同时也验证金黄色葡萄球菌表面蛋白-GFP-GFP融合蛋融合蛋白可以用作抗原免疫白可以用作抗原免疫Balb/cBalb/c小鼠，使小鼠产生小鼠，使小鼠产生IgAIgA肾病模型。肾病模型。由于该融合蛋白由于该融合蛋白造模效果稳定，因此我们设想可以将此方法建立的模型用于临床相关的进一步造模效果稳定，因此我们设想可以将此方法建立的模型用于临床相关的进一步基础性研究。基础性研究。2022-10-1128
