1、分子生药学医学知识生药学中的一个分支学科生药学中的一个分支学科中药高产、优质、多抗性品种的培育中药高产、优质、多抗性品种的培育濒危紧缺中药资源的保护和持续利用濒危紧缺中药资源的保护和持续利用中药新的、便捷、准确的分子标识鉴定方法的研究中药新的、便捷、准确的分子标识鉴定方法的研究从基因层次从基因层次,为过去不能很好解决的问题如道地药材的研究、药材品为过去不能很好解决的问题如道地药材的研究、药材品质的定向调控等提供了新的方法和思路。质的定向调控等提供了新的方法和思路。分子生药学医学知识2分子生药学研究重点分子生药学研究重点药用植物的分子系统学研究药用植物的分子系统学研究药用植物种质资源的分子生物学
2、研究药用植物种质资源的分子生物学研究生药的分子鉴定研究生药的分子鉴定研究道地药材形成的分子机理研究道地药材形成的分子机理研究珍稀濒危中药资源的遗传多样性分析和保护策略研究珍稀濒危中药资源的遗传多样性分析和保护策略研究药用植物的抗性基因工程研究药用植物的抗性基因工程研究药用化学成分的生物转化及分子机理研究药用化学成分的生物转化及分子机理研究药用植物有效成分生物合成分子机理与调控的研究和药用植物细胞药用植物有效成分生物合成分子机理与调控的研究和药用植物细胞组织和转基因器官培养与活性成分生产等组织和转基因器官培养与活性成分生产等分子生药学医学知识3分子生药学研究策略分子生药学研究策略分子遗传标记技术
3、分子遗传标记技术通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的DNA 多态性，通过直接诊断分析多态性，通过直接诊断分析DNA 的多态性，便能避开遗传特性表的多态性，便能避开遗传特性表现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰，快现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰，快速准确地鉴定药材真伪。速准确地鉴定药材真伪。分子生药学医学知识4DNA 分子遗传标记技术已有分子遗传标记技术已有20多种，认为五
4、大类比较合适进行研究。多种，认为五大类比较合适进行研究。分子分子生药学生药学研究方法研究方法1.以以Southern 杂交为基础的杂交为基础的DNA分子标记技术分子标记技术2.以以PCR为基础的分子标记技术为基础的分子标记技术3.以重复序列为基础的分子标记技术以重复序列为基础的分子标记技术4.DNA序列分析序列分析分子生药学医学知识5DNA 分子遗传标记技术的优点分子遗传标记技术的优点1.DNA 分子标记不受发育时期和环境的影响，分子标记不受发育时期和环境的影响，DNA分子标记分子标记在基因水平进行标记，不受取材部位、时间和环境的影响，在基因水平进行标记，不受取材部位、时间和环境的影响，而形态
5、标记和生化标记都是基因表达的结果，其结果受发而形态标记和生化标记都是基因表达的结果，其结果受发育和环境的影响，测定有时会不准确；育和环境的影响，测定有时会不准确；2.DNA 分子标记通常是共显性，表现的信息量大，可精确鉴分子标记通常是共显性，表现的信息量大，可精确鉴定基因型组合；定基因型组合；3.DNA 分子标记多态性强，根据测得的大量标记位点绘制的分子标记多态性强，根据测得的大量标记位点绘制的连锁图，其多态信息量比形态标记高得多。连锁图，其多态信息量比形态标记高得多。分子生药学医学知识6利用利用DNA分子遗传标记和基因组序列分析技术，从居群、分子乃分子遗传标记和基因组序列分析技术，从居群、分
6、子乃至基因水平上，准确刻划药用动植物遗传背景差异和亲缘关系，进而至基因水平上，准确刻划药用动植物遗传背景差异和亲缘关系，进而构建基于叶绿体基因组和（或）和基因组基因序列分析的重要药用动构建基于叶绿体基因组和（或）和基因组基因序列分析的重要药用动植物系统发育树，将是分子生药学基础研究的重心。植物系统发育树，将是分子生药学基础研究的重心。目前可用于分子系统学研究的主要基因种类有：目前可用于分子系统学研究的主要基因种类有：rbcL，matK，rps4，trnT-trnF，ITS等等。以叶绿体基因组片段为主，核基因应等等。以叶绿体基因组片段为主，核基因应用较少但信息量巨大。用较少但信息量巨大。生药的分
7、子鉴定研究生药的分子鉴定研究分子生药学医学知识7高纯度的高纯度的DNA模板的制备模板的制备严格的严格的Taq DNA聚合酶浓度和来源聚合酶浓度和来源合适的镁离子浓度，太高会产生弥散背景，太低了合适的镁离子浓度，太高会产生弥散背景，太低了得到的得到的PCR产物条带淡产物条带淡分子生药学医学知识8DNA复制原理的具体应用复制原理的具体应用 PCR技术技术Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应聚合酶链反应 它是一种模拟天然它是一种模拟天然DNA复制过程，在有复制过程，在有DNA模板、模板、DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）、酶）、RNA引物和四种引物和四种dNTP的情况下，通
8、过高温变性（的情况下，通过高温变性（9095，12min）,低温低温退火（退火（2537，12min）,中温延伸（中温延伸（6075，90 sec-5min）,这样反复这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。（片段的分子生物学技术。（原理图原理图）1、PCR反应成分：反应成分：Taq DNA聚合酶聚合酶 引物浓度：一般引物浓度：一般0.1-0.5mol/L dNTP:一般为一般为50200mol/L Mg2+模板：模板：PCR对模板的要求不高，单、双链对模板的要求不高，单、双链DNA均可，但均可，但 样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、样品中不
9、能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以聚合酶抑制剂以 及能与及能与 DNA结合的蛋白质。结合的蛋白质。添加剂：添加剂：DMSO（二甲基亚枫），提高扩增效率及特异性（二甲基亚枫），提高扩增效率及特异性 分子生药学医学知识9 （1）理论上理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n-2n的指数方式递增，的指数方式递增，PCR反应反应30轮循环后，轮循环后，PCR扩增应达到扩增应达到230个拷贝，约个拷贝，约109个拷个拷贝。但由于贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反
10、应系统的条件等各种因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106107个拷贝。个拷贝。“平台效应平台效应”：PCR反应中，当引物模板与反应中，当引物模板与DNA聚合酶达到一定比值时，聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应不再增加。反应不再增加。平台效应在平台效应在PCR反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现前，反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现前，PCR产物产物的数量足以满足实验的需要。的数量足以满足实验的需要。（2）PCR反应条件的优化反应条件的优化 PCR方法操作简便，但影响因素颇多
11、，因此需要根据不同的方法操作简便，但影响因素颇多，因此需要根据不同的DNA模板，摸索模板，摸索最适条件。主要从：最适条件。主要从：反应的特异性、敏感性、忠实性、扩增效率等四个方面衡量反应的特异性、敏感性、忠实性、扩增效率等四个方面衡量PCR反应的结果。循环参数反应的结果。循环参数 变性变性 退火退火 延伸延伸 PCR反应成分反应成分分子生药学医学知识10（3）PCR反应引物的设计反应引物的设计 引物的设计在整个引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位扩增中占有十分重要的地位 特异性，扩增性特异性，扩增性 引物的序列应位于基因组引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序
12、列。这样的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性引物长度：引物长度：1530nt为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。引物的碱基尽可能随机发布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，引物的碱基尽可能随机发布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基碱基的含量在的含量在4060之间。之间。引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文结构。引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文结构。二个引物不应有互补序列，特别是二
13、个引物不应有互补序列，特别是3端应避免互补，以免形成端应避免互补，以免形成“引物二聚引物二聚 体体”，浪费引物。，浪费引物。引物引物5末端碱基无严格限制，在与模板末端碱基无严格限制，在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，结合的引物长度足够的条件下，其其5端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在引物互补而呈游离状态，因此可在引物5端加上限制性内端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的产物的分析克隆等，引物的5端最多可加端最多可加10个碱基而对个碱基而对PCR反应无影响。反应无影响。分子生药
14、学医学知识11PCR产物的分子克隆产物的分子克隆 克隆克隆PCR产物的目的通常是：建立用于杂交分析的克隆化产物的目的通常是：建立用于杂交分析的克隆化DNA的永久来源，的永久来源，得到高质量的得到高质量的DNA序列结果，以及当序列结果，以及当PCR扩增产生复杂混合产物时用于分离扩增产生复杂混合产物时用于分离PCR目的片段。目的片段。PCR产物的直接克隆可以通过对扩增片段进行合适的末端处理而产物的直接克隆可以通过对扩增片段进行合适的末端处理而提高效率。提高效率。基本方案基本方案 产生产生TA突出端突出端 TaqDNA聚合酶往往在所有的双链聚合酶往往在所有的双链DNA 3末端再加上一个非模板来源的核
15、苷末端再加上一个非模板来源的核苷酸酸(通常为通常为A)，使，使PCR片段的平端克隆往往效率不高。当只有片段的平端克隆往往效率不高。当只有dTTP存在时，存在时，Taq DNA聚合酶可在载体的平端加上一个聚合酶可在载体的平端加上一个T，这样就会产生一个与，这样就会产生一个与A配对的突出端。配对的突出端。分子生药学医学知识12遗传标记遗传标记（Genetic marker)遗传学中通常将可识别的等位基因称为遗传标记。遗传学中通常将可识别的等位基因称为遗传标记。但随着遗传学和基因概念的发展其内涵也发展。除基但随着遗传学和基因概念的发展其内涵也发展。除基因标记外遗传标记主要包括：因标记外遗传标记主要包
16、括：3.蛋白质标记蛋白质标记：非酶蛋白质和酶蛋白质在非酶蛋白质中，用得较：非酶蛋白质和酶蛋白质在非酶蛋白质中，用得较 多的是种子贮藏蛋白；酶蛋白质主要是同功酶。多的是种子贮藏蛋白；酶蛋白质主要是同功酶。4.DNA 标标 记记：也称：也称DNA多态性标记、多态性标记、DNA分子标记，分子标记，是是 DNA水平上遗传多态性的直接反映。水平上遗传多态性的直接反映。1.形形 态态 标记标记：是指那些能够明确显示遗传多态的外是指那些能够明确显示遗传多态的外 观性状，如株高、粒色等的相对差异观性状，如株高、粒色等的相对差异2.细胞学标记细胞学标记：是指能够明确显示遗传多态的细胞学特征。：是指能够明确显示遗
17、传多态的细胞学特征。如染色体结构上和数量上的遗传多态性等如染色体结构上和数量上的遗传多态性等分子生药学医学知识13 这里仅介绍这里仅介绍遗传的分子标记遗传的分子标记中的几种重要的分子标记中的几种重要的分子标记:1.同工酶标记同工酶标记:同工酶同工酶（Isozyme）是一类分子结构不同、是一类分子结构不同、功能相似、催化同样的生化反应的酶。功能相似、催化同样的生化反应的酶。同工酶标记是利用编码同工酶的等位基因与同工酶酶谱同工酶标记是利用编码同工酶的等位基因与同工酶酶谱的相关性及其共显性的特点进行染色体定位和遗传连锁分析。的相关性及其共显性的特点进行染色体定位和遗传连锁分析。2.DNA分子标记分子
18、标记:（基于（基于DNA-DNA杂交的杂交的DNA标记）标记）RFLP标记标记(restriction fragment length polymorphism)：DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致使酶切片段长度随之发生变改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致使酶切片段长度随之发生变化。这种变化引起的多态现象即为限制性片段长度多态性化。这种变化引起的多态现象即为限制性片段长度多态性（RFLP)。对对RFLP的检测主要是用的检测主要是用Southe
19、rn杂交的方法进行，即利用限制酶酶解及凝胶杂交的方法进行，即利用限制酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异分子，然后用经标记的特异DNA探针与之杂交，通探针与之杂交，通过发射自显影或非同位素显色技术来揭示过发射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。的多态性。(图图 Southern)分子生药学医学知识14（基于（基于PCR的的DNA标记：随机引物标记：随机引物PCR标记）标记）RAPD（random amplified polymorphic DNA）标记：标记：随机扩增多态性随机扩增多态性DNA，用随机短引物（人工合成的六核苷酸），用随机短
20、引物（人工合成的六核苷酸）进行进行DNA的的PCR扩增。所扩增的扩增。所扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性区段是事先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物和任意性，因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的标记技术可用于对任何未知基因组的研究。（研究。（RAPD 原理）原理）ISSR(Inter-simple sequence repeats)标记标记:简单序列重复简单序列重复区间扩增多态性。利用基因组中常出现的区间扩增多态性。利用基因组中常出现的SSR本身设计引物，无需本身设计引物，无需预先克隆和测序。预先克隆和测序。SSR（simple sequence repeats)标
21、记标记:简单重复序列多态简单重复序列多态性。又称微卫星性。又称微卫星DNA多态性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸多态性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串联重复的拷贝数目不等而出现的多态现象。串联重复的拷贝数目不等而出现的多态现象。(76)分子生药学医学知识15（基于（基于PCR与限制性酶切技术结合的与限制性酶切技术结合的DNA标记）标记）AFLP（amplified fragments length polymorphism）标记标记:扩增片段长度多态性。通过对基因组扩增片段长度多态性。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。酶切片
22、段长度的多态性。AFLP揭示的揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。性碱基的变异。（AFLP 原理原理）分子生药学医学知识16（单核苷酸多态性的（单核苷酸多态性的DNADNA标记）标记）SNP SNP（single nucleotide polymorphismsingle nucleotide polymorphism）标记）标记:单核苷酸多态性。不同个体基因组单核苷酸多态性。不同个体基因组DNADNA序列同一位置上的序列同一位置上的单个核苷酸的差别。其比较的不是单个核苷酸的差别。其比较的不是DNADNA的片段长度，而是相同的片段长度，而是相同序列
23、长度里的单个碱基的差别序列长度里的单个碱基的差别。(SNP_)(SNP_)主要类型的主要类型的DNADNA分子标记的技术分子标记的技术特点比较特点比较分子生药学医学知识17RAPD标记已被广泛应用于分子生药学各方面：标记已被广泛应用于分子生药学各方面：生物多样性：随着植物药研究的不断深入，可持续开发利用药用植物资源的问题生物多样性：随着植物药研究的不断深入，可持续开发利用药用植物资源的问题越来越受到重视。应用越来越受到重视。应用RAPD技术进行药用植物生物多样性研究，可以在遗传多技术进行药用植物生物多样性研究，可以在遗传多 样样性水平上了解天然产物多样性与物种、生态及地理分布的关系，挖掘潜在的
24、药物资性水平上了解天然产物多样性与物种、生态及地理分布的关系，挖掘潜在的药物资源，为开发新药寻找途径。源，为开发新药寻找途径。RAPD方法可以检测物种的遗传多样性，探讨物种方法可以检测物种的遗传多样性，探讨物种 的亲的亲缘关系和进化趋势。因此它是药用植物资源保护和种质资源保存的依据，特别是对缘关系和进化趋势。因此它是药用植物资源保护和种质资源保存的依据，特别是对濒危物种的研究更具有实际意义。（舒艳群濒危物种的研究更具有实际意义。（舒艳群,白守梅白守梅,陈毓陈毓 亨亨.RAPD技术在药用植物技术在药用植物研究中的应用研究中的应用.中草药中草药,1999,30(2):147）RAPD标记可用于生药
25、分类，在标记可用于生药分类，在DNA分子水平上鉴别生物不同种、亚种、变种甚分子水平上鉴别生物不同种、亚种、变种甚至株。至株。RAPD标记可用来制作生物类生药系统发育关系上的树状图，特别是种内水平。标记可用来制作生物类生药系统发育关系上的树状图，特别是种内水平。这为生药亲缘进化关系这为生药亲缘进化关系,寻找新的药用资源开辟了新途径。寻找新的药用资源开辟了新途径。RAPD标记可用于构建基因图谱，进行基因定位，和对未知序列的标记可用于构建基因图谱，进行基因定位，和对未知序列的DNA片段扩增片段扩增与测序。与测序。RAPD标记亦可用于遗传连锁图谱的构建，指导药用植物育种，防止品种间杂化标记亦可用于遗传
26、连锁图谱的构建，指导药用植物育种，防止品种间杂化和自交，选育优良性状的品种。和自交，选育优良性状的品种。分子生药学医学知识18DNA 分子鉴定前景广阔分子鉴定前景广阔我国生药品种繁多、来源复杂，根据最新统计我国生药品种繁多、来源复杂，根据最新统计,药用动植物约有药用动植物约有12000 种左右。但由于历史、地理、人为等因素，加之研究手段的种左右。但由于历史、地理、人为等因素，加之研究手段的局限性，长期以来我国生药仍处于品种混乱和质量难以保证的不局限性，长期以来我国生药仍处于品种混乱和质量难以保证的不利局面，很大程度上制约了中医药的发展。而利局面，很大程度上制约了中医药的发展。而DNA 分子鉴定
27、法，分子鉴定法，将使生药鉴定技术得以创新，而使得中医药的发展真正走向现代将使生药鉴定技术得以创新，而使得中医药的发展真正走向现代化、标准化、国际化之路。化、标准化、国际化之路。分子生药学医学知识19鉴定近缘生药品种；鉴定近缘生药品种；鉴定名贵易混淆生药；鉴定名贵易混淆生药；鉴定动物类生药；鉴定动物类生药；鉴定药材道地性；鉴定药材道地性；鉴定生药野生与家种；鉴定生药野生与家种；刻划生药质量标准化；刻划生药质量标准化；鉴定中药原粉制剂。鉴定中药原粉制剂。等方面具有重要应用价值等方面具有重要应用价值分子生药学医学知识20范例一范例一黄芪药材的植物来源复杂，药典收载黄芪药材的植物来源复杂，药典收载2种
28、植物种植物膜荚黄芪（膜荚黄芪（A.membranaceus Fisch.Bge）和蒙古黄芪（）和蒙古黄芪（A.membranaceus Fisch.Bge.Var.mongholicus）。此外还有地方不同属植物红芪。）。此外还有地方不同属植物红芪。由于市面上黄芪经过加工后，多种形态发生变化，而且近缘种形态特征由于市面上黄芪经过加工后，多种形态发生变化，而且近缘种形态特征相似，仅从形态学、化学成分鉴定，困难较大。相似，仅从形态学、化学成分鉴定，困难较大。利用利用RAPD（随机扩增多态性）进行相关研究，就可以从基因水平（随机扩增多态性）进行相关研究，就可以从基因水平揭示黄芪遗传本质，为黄芪鉴定提
29、供依据。揭示黄芪遗传本质，为黄芪鉴定提供依据。RAPD分子生药学医学知识21叶绿体叶绿体matk基金石斛鉴定真伪品基金石斛鉴定真伪品兰科石斛属兰科石斛属5种植物金钗石斛、铁皮石斛、束花石斛、粉花石斛、流苏石斛种植物金钗石斛、铁皮石斛、束花石斛、粉花石斛、流苏石斛资源短缺造成石斛属资源短缺造成石斛属30余种植物和近缘属的多种植物充斥与药材市场，因此余种植物和近缘属的多种植物充斥与药材市场，因此有必要利用分子标记技术对真伪品进行区分有必要利用分子标记技术对真伪品进行区分范例二范例二分子生药学医学知识22药典收录石斛药典收录石斛伪品伪品系统发育进化树系统发育进化树分子生药学医学知识23方法特点方法特
30、点利用利用DNA测序技术，测定真伪品石斛测序技术，测定真伪品石斛matk基因核苷酸基因核苷酸序列变化，通过核苷酸序列变化程度，利用进化分析软件，序列变化，通过核苷酸序列变化程度，利用进化分析软件，进行系统发育树构建，得出亲缘关系，从核酸水平揭示真伪进行系统发育树构建，得出亲缘关系，从核酸水平揭示真伪品区别品区别分子生药学医学知识243、4、5、6、7为野生天麻，为野生天麻，1、2、8、9为杂交天麻为杂交天麻SSR分子生药学医学知识26范例四范例四比较研究不同产地南五味子的基源植物华中五味子及混淆品比较研究不同产地南五味子的基源植物华中五味子及混淆品绿叶五味子的绿叶五味子的ITS碱基序列的差异及
31、其规律，寻找南五味子碱基序列的差异及其规律，寻找南五味子和绿叶五味子果实之间的分子鉴别方法。和绿叶五味子果实之间的分子鉴别方法。分子生药学医学知识27绿叶五味子绿叶五味子华中五味子华中五味子ITS分子生药学医学知识28PCR原理原理返回分子生药学医学知识291号样品为红芪号样品为红芪其他为药典收录蒙古黄其他为药典收录蒙古黄芪、膜荚黄芪芪、膜荚黄芪RAPD分子生药学医学知识30isozyme返回返回分子生药学医学知识31RFLP返回返回分子生药学医学知识32Southern blot返回返回DNA样品限制酶样品限制酶 酶解酶解电泳电泳分子生药学医学知识33RAPD返回返回分子生药学医学知识34返回返回分子生药学医学知识35AFLP返回返回分子生药学医学知识36SNP返回返回分子生药学医学知识37返回返回分子生药学医学知识38F76返回返回分子生药学医学知识39
