1、心血管疾病药效学研究一、实验设计的医学基础 根据缺血性心脏病(心绞痛、急性心肌梗死)的主要症状发现，中医将其归属于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范畴。病位以心肾为主。基本病机为本虚标实。本虚以脏气亏虚为主可兼阴虚；标实以血瘀痰阻多见，可兼气滞、寒凝。基本治法为宣痹通阳，活血化瘀，芳香温通及扶正固本。缺血性心脏病可由不同病因引起，最常见的原因是冠状动脉粥样硬化、冠状动脉血栓及冠状动脉痉挛。其共同特点是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而发生的一系列病理生理改变及证候。改善心脏血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代谢，缓解心绞痛，减小心肌梗死面积是药物治疗的主要目的。二、药效学研究
2、的实验设计 缺血性心脏病需要进行的药效学实验较多，般应以整体动物实验为基础，根据药物特点及实验要求适当选用器官、组织、细胞及分子水平的实验，多层次实验相结合，有利于重复验证和说明作用原理。但由于缺血性心肌发病机制复杂，防治的途径，方法及药物类型亦较复杂。应明确研究的思路，作用的途径，选择适宜的主要药效学实验方法及必要的观测指标，进行止确的分析判断，以求得科学的结论。心血管疾病药效学研究2 (一)对心肌缺血心肌梗死的防治作用试验 1常用动物模型 (1)冠状动脉阻断或缩窄形成心肌缺血和心肌梗死模型：通过阻断或缩窄冠状动脉方法，如结扎、电刺激、气囊法，血管内异物法及注入凝血酶或ADP法等。(2)药物
3、诱发心肌缺血模型：通过药物诱发冠脉痉挛法，如垂体后叶素、麦角新碱，以及通过增加心肌耗氧法，如异丙肾亡腺素等。(3)离体实验心肌缺血模型：结扎离体心脏冠状动脉法、离体心脏低氧或无氧灌流法。(4)体外培养心肌细胞缺血样损伤模型：控制心肌细胞的供氧和培养基中的含糖量，形成“缺血样损伤”模型。(5)心肌缺血冉灌注损伤模型：整体动物心脏缺血再灌注损伤离体心脏和心肌细胞缺氧缺糖再灌注损伤等模型。以上心肌缺血模型第一项可用于急性和慢性心肌缺血实验，可观察药物的药理作用、起效及作用时间等。其余均为急性心肌缺血模型，可作药物作用机制分析研究。心血管疾病药效学研究3 2观察指标 (1)直接测定心肌梗死范围：大体标
4、本活体染色法，以定量组织学(NBI染色或TIC染色或双重染色)观察心肌梗死面积的改变。病理切片显微镜检查，镜下观测心肌病变程度和范围。病理切片荧光照相法，利用四环素能与心肌坏死细胞中的钙整合的特性，在切片上进行荧光照相，以测定梗死面积。电子显微镜观察细胞膜、线粒体、内质网、细胞核及染色质等心肌细胞超微结构的改变。(2)间接测定心肌梗死范围：心外膜电图标测法，阻断或缩窄冠状动脉形成心肌缺血及心肌梗死，以多点心外膜电图标测心肌缺血的程度和范围的变化。酶学指标观测，测定血中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)等与心肌损伤相关的酶类变化，动态观察心肌损伤情况，定量分析心肌损伤程度。核示踪法，将
5、肘心肌坏死有亲和力的物质进行核索标记来观察梗死情况，常用的有锝四环素和锝焦磷酸亚锡。心血管疾病药效学研究4 (3)缺血区测定指标：染料及荧光素法，通过从冠脉注入染料或荧光素，然后进行肌切片观察心脏血流灌注情况，从而计算无染料(或荧光)的面积(即缺血面积)，如合并应用NBT做活体双重染色法可计算梗死面积与缺血面积的比值。核示踪法，利用放射核铊依靠钠泵进行转运而不能进入缺血或坏死细胞的特点，通过闪烁照相来观察心肌缺血部位及范围。放射自显影法观察缺血区。心表面荧光法，用表面荧光照相来分析缺血K情况。冠脉血流量、冠脉返流量及返流压的测定。心肌区域血流量的测定。(4)其他可供分析的指标：心肌代谢指标，如
6、心肌氧代谢，其他物质及能量代谢，如FFA、ATP、PGI2、TXA2、cAMP/cGMP，SOD、MDA、乳酸、钾、钙、镁离子、血凝状态及血液流变性等。心血管疾病药效学研究5 3方法学评价 以上各项试验方法中，以阻断动物的冠状动脉所致之局限性心肌缺血是目前国内外应用最广泛的方法，通过狭窄或完全闭塞冠状动脉，使其供应区的血流减少或缺无，造成心肌缺血，心肌因缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以致发生凝固性坏死，其发病过程和机制与临床相似，与中医理论“瘀血证”有一定联系，较为合理、实用。可根据所试药物功能、主治和作用特点选用上述形态、电生理、生化、放免、核示踪、荧光等观测指标与方法，可以定位、定性、定量的观
7、测缺血心肌的动态变化及药物影响，较为准确的评价药效。应作为新药主要药效学的首选试验。心血管疾病药效学研究6 (二)对心脏血流动力学及心肌耗氧量影响试验 1实验动物与观测指标 (1)犬心功能及血流动力学实验：观察指标应包括心电图、心率。动脉血压、冠脉流量，冠脉阻力、心输出量、心肌收缩力、左室做功、左室内压、左室内压最大上升速率、心搏出量、心脏指数、心搏指数、总外周阻力等，并可同时测定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指数等。(2)猫、鼠等其他动物心功能及血流动力学试验：观察指标应包括心电图、心率，动脉血压、心输出量、左室内压、左室内压最大上升速率、中心静脉压、左室别血的张力指数、左室作功指数、心脏指数、
8、左室舒张未期压等。(3)无创性心功能检查：如超声心动图、阻抗图、Y照相等。2方法学评价 心脏血流动力学、心肌耗氧量等应作为评阶药物作用及作用机制的重要指标，对于了解药物对心肌功能、血管顺应性、心肌供血及心肌氧代谢的影响，结合对心肌缺血、心肌梗死等指标的影响，作综合性评价有重要意义。心血管疾病药效学研究7 (三)其他试验 1血小板聚集性试验 血小板聚集性增强是造成血液循环障碍导致心肌缺血发生的重要原因之一。药物对动物血小板聚集性的影响可作为药效学研究的辅助指标。实验动物用兔或大鼠。以三磷酸腺秆、花生四烯酸(AA)、胶原、凝血酶等作为绣导剂，应用比浊法或其他方法测定。2血栓形成及溶栓试验 冠状动脉
9、血栓形成是直接导致心肌缺血因素之一。对血栓形成的影响和溶栓作用应为评价治疗心肌缺血药物药效的辅助指标。常用免或大鼠以Chmldlcr血栓形成法，测定心栓的重量及长度；应用大鼠以动静脉旁路法测定血栓湿重；电刺激人鼠颈总动脉形成动脉血栓，用以观察药物对体内血栓形成时间的影响;电刺激犬或猪的冠状动脉形成冠状动脉血栓，以心肌缺血程度范围、心肌梗死、心肌酶及冠脉血栓占管腔的百分比等多项指标综合观察药物对心肌缺血的防治作用和溶栓作用。心血管疾病药效学研究8 3血液流变学试验 心肌缺血发生前后，常伴有血液流变学改变。因此，测定血液黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降、血小板黏附和聚集等血液流变学
10、指标，对评价药物的作用有重要意义。4氧代谢试验 增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代谢是药物治疗缺血心脏病的重要作用。方法除前面介绍的心肌耗氧量测定外，可同时选用小鼠常压、低压耐缺氧等实验和指标。心血管疾病药效学研究9(四)阳性对照药 阳性对照药既可选择西药，也可选中药。西药作用明确，疗效肯定，尤其是一些经典药品，可检验实验方法可靠性。西药剂量与中药量相差较大，作用特点亦不大相同，不做药效强度比较。采用中药阳性药时，一股应选疗效肯定的功能主治相似的中成药对照，对照药应是药典记载或经卫生部批准生产的；对照药剂应与受试药等效或相当，以便进行比较，同一受试药的不同药效学实验选用不同的
11、阳性对照药。心血管疾病药效学研究10 三、动物模型建立方法 (一)犬或小型猪心肌缺血及心肌梗死模型 1原理 通过缩窄或完全闭塞冠状动脉，减少或停止供应区的血流，形成心肌缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以致发生心肌坏死。2方法 健康成年犬或小猪(现我国已培育出实验用“中国实验小型猪”)，雌雄兼用，体重1015kg，经戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，手术台固定，分离气骨并插管，连接电动呼吸机，调节潮气量300600wi，动脉氧分压维持在1213kPa(90-100mmHg)，血pH在正常范围；左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床；分离冠状动脉左前降支中段(一般相当厂第三分支根部)，可用以
12、下儿种方法阻断冠状动脉，形成心肌缺血：(1)冠状动脉结扎法：在冠脉分离处穿34号处线以备结扎，或用动脉夹阻断，一般用于急性心肌缺血实验。(2)冠状动脉血栓形成法：将弧型针状电极(刺激电极)置于分离的冠状动脉下，另一电极(参考电极)距刺激电极o6mm处置于心外膜下，两电极分别连接电刺激仪的隔离器正负极，以25、lmA直流电刺激冠状动脉30min左右，冠状动脉内血栓形成，阻断冠状动脉血流，诱发心肌缺血。心血管疾病药效学研究11 (3)冠状动脉气囊压迫法：压迫环由有机玻璃外套和可膨胀的乳胶小囊构成，外套长5mm侧面lmm的缝隙，血管由此进入肺内，小囊长34mm，一端密闭，一端与塑料管相连，充满蒸馏水
13、或生理盐水，经塑料管注水3040ul使小囊膨胀以压迫套内的血管，当压力去除时，小囊恢复原状，冠状动脉重新通畅，适用于急性和慢性心肌缺血或再灌实验。(4)Ameroid缩窄环法：为形成慢性冠状动脉闭塞、心肌缺血或观察冠状动脉侧支循环的变化，用具有吸水性的塑料环(Ameroid环)套在冠状动脉左旋支根部。关闭胸腔后，塑料环吸收组织水分膨胀，环外壳系硬质材料做成，限制环的外展，结果压迫冠状动脉，形成心肌缺血。环植人46星期，血骨内径缩小80-90。(5)清醒动物心肌缺血实验：将气囊压迫环固定在冠状动脉适当部位，缝合心包，放置心包膜电极，气囊的导管电极的导线分别穿过胸壁引出皮外，逐层缝闭胸。实验时注入
14、蒸馏水，使气囊膨胀，压迫冠状动脉造成心肌缺血，测量心外膜电图或其他观察指标,本法可反复阻断冠状动脉，进行多次清醒动物的心肌缺血实验及再灌注损伤实验。(6)缺血再灌注创伤：在心肌缺血一定时间造成心肌损伤后，冉供血一定时间，加重心肌损伤而形成再灌注损伤，观察药物的保护作用。心血管疾病药效学研究12 3药物疗效判断 (1)心外膜电图标测：心外膜标测点的定位应包括缺血中心区、边缘区和非缺血区，标测方法：将心电极固定于具有一定弹性的无刺激性材料作成的片子上，该片四角缝于心外膜，如多点固定式心外膜电极。或直接将每个电极固定于心外膜表面，或用一个灯芯电极按顺序点测标测点。或用一个电极沿心表山一定途径移，记出
15、一个连续的心外膜电曲线。电极用浸泡生理盐水的烛芯棉线或细毛笔尖等柔软材料探查电极，联于心电图胸前导联描记，用普通心电图机或多导生理记录仪记录。确定心肌缺血以ST段抬高作为指标，以ST段抬高2mv的点数(NST)代表心肌缺血的范围，以各点段抬高的毫伏数之和(ST)代表心肌缺血的程度。记录阻断冠脉血流前后的变化及药物的影响。心血管疾病药效学研究13 (2)缺血区及梗死区面积的测定：在阻断冠状动脉血流孔后，经左心耳根部向心房注人碳索墨水15mlkg，20-30s注完，迅速取下心脏，冰冻3040min，在冠状动脉结扎线下平行冠状沟等厚度将心室部分横切成5片，分别称重，再用求积仪或电脑图分析仪测量每片心
16、肌两面的墨水染色区与末染区(缺血区)，计算心肌缺血范围的重量及百分比。然后将5片心肌置硝基四氮唑蓝(NBT)染液中，震摇染色15min后取出，正常心肌染为暗蓝色，梗死区心肌则小着色或浅黄色，用求积仪或落点求积法或电脑图像分析法测量每片心肌两面的梗死区和非梗死区，计算出每片心肌总面积、总重量；缺血区和梗死面积和重量；计算缺血区占心室百分比，梗死区占心空白分比，及梗死区占缺血区百分比，以评价药物的疗效。心血管疾病药效学研究14 (3)生化指标：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测量血中乳酸脱氢酶的变化，分析心肌损伤情况。为避免具他肌肉组织释放的酶干扰，测同工酶。同时可测定血ATP、cAMPcGMP、无
17、机离子、代谢物、能量代谢物质等，如需了解药物作用与前列腺素的关系，可观察PGl2或代谢产物的变化，以观察药物对的影响。如需了解药物与氧自由基的关系，可测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)作为氧自由基产生和清除的观测指标。(4)血液流变性指标测定：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测定全血黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流变学指标。心血管疾病药效学研究15 4 注意点 犬和小型猪是建立心肌缺血模型最常用的动物，其体积大小适中，性情温顺、易训练、心脏解剖及生理特点与人相似，其影响因素有：(1)动物冠状动脉分支及侧支循环有个体差异，对分支及侧支变异大
18、的，不合标准的应剔除不用，各组动物模型心肌缺血程度和范围接近。(2)正式实验之前应熟练掌握动物开胸手术和冠状动脉分离手术，尽量减少出血，做心包床时，心肌不应移位而影响心脏的正常舒缩功能。(3)实验时应严格控制心外膜电极的位置、压力，心脏表面的温度、湿度及位置。心外膜电极放置的位置，或反复测定的位置应准确固定，不应移位。电极不可对心脏压力过大，心脏表面的温度及湿度应稳定，不可干燥。否则将影响实验的准确性。(4)实验可注射给药，但口服中药消化道给药，消化道灌胃给药或十二指肠给药，灌胃时，注意动物提前812h禁食。(5)在进行本项实验时一定要严格控制实验条件，排除干扰因素，确保实验结果。必要时同步测
19、血氧、pH等。心血管疾病药效学研究16 (二)大鼠实验性心肌梗死模型 I，原理 结扎大鼠的冠状动脉前降支，阻断其分布区域的心肌供血，心肌细胞长时间缺血缺氧而造成不可逆损伤和坏死。2方法 取体重200250g雄性大鼠，乙醚吸入或戊巴比妥钠腹腔麻醉，仰卧固定，气管插管，在胸骨侧作2cm的纵切口，近胸骨侧剪断第三第四肋软骨，打开胸腔，联接呼吸机(通气量2mll00g，50次min)。剪开心包膜，暴露心脏，冠状动脉左前降根部穿线以备结扎，记录标准导联心电图，稳定10min，结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔，用针筒或橡皮吸引吸出动物喉部分泌物，使动物恢复呼吸。心血管疾病药效学研究17 3 测定指标 (1)
20、心电图ST段及Q波标测：记录标准导联心电图及胸前导联心电图，测ST、病理性Q波、严重心律失常等指标。(2)测定血浆生化指标：如IDH、CPK、ATP、cAMPcGMP、PGI2TXA2等。(3)梗死面积估算：处死动物，取心脏横切数片，测梗死面积，方法同前，但误差较大。可用石蚶包坤组织块切片，染色，显微镜下观测，分级定度或用定量组织学方法直接算心肌梗死面积。4注意点 本实验方法在一般实验室条件均可进行，方法简便，但动物较小，操作不便，耐受缺氧时间不长，心脏较小，实验误差较大，可作为辅助试验。手术者必须熟悉冠状动脉的分布和解削位置，便于定位。操作者严格训练操作熟练，手术时间不宜过长，部分结扎冠状动
21、脉后ECG无改变者需剔除。心血管疾病药效学研究18 (三)心肌缺血再灌注损伤模型 1原理 心肌经一定时间缺血(缺氧)后，突然恢复血(氧)供，形成更严重损伤，即“心肌缺血再灌注损伤”，其形成原因可能是心肌恢复血流时，加速细胞膜内外的钠钙交换，大量钙离子进人细胞内，形成“钙超载”：心肌细胞发生“拘缩”而丧失功能。心肌缺血再灌注损伤模型既可用于整体动物，又能用于离体心脏和体外培养心肌细胞。在药效学研究可根据所试药物的药理作用及作用特点，选用不同的动物和模型。2 方法 (1)在体心脏心肌缺血再灌注损伤模型：实验可用多种动物如，犬、小型猪、猫和大鼠等。一般采用阻断局部冠状动脉血流一定时间，然后恢复冠脉血
22、流，形成再灌注损伤。手术方法观察指标大致同前。心血管疾病药效学研究19 (2)离体心脏缺血再灌注损伤模型：实验一般用成年Wistar种雄性大鼠，猛击动物头部使昏迷，快速开胸，摘取心脏、立即放人4改良Krebs-Hensleit液中，主动脉插管，装于Leaigendorff罐流装置，以KH液(pH74)恒温37进行灌流。将两电极分别于主动脉及左心室壁，记录心表面电图。实验程序：预备灌流期，心脏正常灌流(正常改良KH液)，稳定l0min，给药灌流(含不同药物的改良K-H液，实验持续进行)5min。缺血期，以00号线于左心耳部下力进针，从肺动脉圆锥旁穿出，结扎冠状动脉10min。复灌期，剪断结扎线，
23、进行再灌注15min。心血管疾病药效学研究20 3 观察指标 心表面电图，记录复灌后5min出现的室性早搏PVC个数对数值lgPVC及室速与室颤总时对数值。心肌丙醛(ADA)含量及越氧化物歧化酶(s0D)活性，实验结束后，剪下再灌区全层心肌约02g，制备匀浆进行测定。心肌离子含量测定，实验结束后，以无钙冲洗液(三羟甲基氨基甲烷缓冲掖)冲洗心肌，取再灌区层心肌约o 2g，干燥至恒重，以硝酸消化溶解，无离子水稀释至所需浓度，原子吸收分光光度汁或等离子休发射光谱仪测定钠，钾、钙，镁等离子含量。心肌梗死面积测定，实验结束时，将心脏横切染色，计算心肌梗死面积。心血管疾病药效学研究21 (四)体外培养心肌
24、细胞缺血样损伤模型 1原理 通常应用Wistar种大鼠乳鼠进行原代心肌细胞培养，用缺氧缺糖形成缺血样损伤。心肌细胞缺氧缺糖后，功能从形态有明显改变，如胞浆泡形成，胞浆颗粒增加出现异形心肌细胞等；经活体染色证实细胞死亡数增加；搏动频率下降，动作电位改变；胞浆的乳酸脱氢酶，羟酸脱氢酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用这些指标评定药物对心肌细胞缺血样损伤的保护作用。心血管疾病药效学研究22 2方法 取出生23曰乳鼠，开胸、取心室，放人盛有Eagle培养皿中，反复冲洗3次，三角烧瓶中用眼科剪将心室组织剪成碎块，加入006胰蛋白酶溶液。在搅拌器上37水浴消化10min自然沉淀后，丢上消液，沉淀的组织块再加
25、入胰蛋白酶，消化l0min，然后吹打1min，自然沉淀，上清移人离心骨中。加入等量冷培养基以终止消化，离10min(2000rmin)，弃上清，再加入适量培养基于离心管内的细胞沉淀中，混匀，离心，弃上清以洗残存的胰蛋白酶，加入15Eagle培养基，制成细胞悬液。将自然沉淀的组织块反复消化数次，直至完全分散为止。将各次消化制的细胞悬液集中，制成心肌细胞悬液，接种至玻璃培养瓶，塞紧，37c下静置单层培养或在二氧化碳培养鞘开放培养。体外培养心肌细胞缺氧缺糖性损伤模型的建立方法：取培养3日的心肌细胞，按下法进行缺氧缺糖实验缺糖：实验时采用无糖液或不含糖的Eagle培养基代替正常培养。缺氧：将无糖Han
26、ks液或无糖培养基预先用纯氮气(99.999)饱和15min；实验时换人这种缺氧缺糖液或培养基，培养瓶内再充人氮气(1l/min)30s以置换瓶内空气，然后塞紧瓶塞。正常对照组用正常Hanks液或培养基，不充氮气，如用二氧化碳培养箱加以培养，则通人95N2+5C02气体形成缺氧。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧损伤，开观察药物对供氧损伤的影响。心血管疾病药效学研究23 3测定指标 (1)形态学观察：用台盼兰染色进行死活细胞鉴定，观察细胞活力的改变及死亡比例，光学显微镜下可观测心肌细胞形态变化，如伪足变化、胞泡形成、胞浆颗粒增加、异形(长形、纺锤形)心肌细胞的出现。在扫描或透射电镜下观察超微结构的
27、变化。(2)心肌细胞搏动的变化：包括搏动的频率、节律及强度等。(3)胞浆酶的释放：可用生化或细胞化学方法测定缺氧缺糖后心肌细胞内从培养基中酶的变化，如IDH、CPK、羟酸脱敏酶、转氨酶等的变化。(4)其他：测定细胞内氧化物歧化酶的变化从钙离子运转等。上述观测指标综合选用，以判断心肌细胞损伤程度及药物保护作用。心血管疾病药效学研究24 4方法学评价 优点：观察药物对心肌细胞的直接作用，可排除药物通过其他间接影响心肌缺血氧的作用。节约药物，适用于分离或合成得到的极少药物进行实验。适用于从细胞或分子水平进行机制研究。局限性：技术设备要求高。不适于观察不溶于水或含杂质的粗制药物，或非直接作用心肌细胞的
28、药物的作用。因此，本法应与整体或器官水平的实验配合进行，以便更全面的判断药效。心血管疾病药效学研究25 (五)药物诱发心肌缺血模型 近年研究认为冠状动脉痉挛是导致心肌急性缺血的主要原因之致心绞痛、心肌梗死和猝死。目前常用垂体后叶素在整体动物(犬、小型猪、兔、豚鼠，大鼠)或离体心脏上造成冠脉痉挛心肌缺血模型，或用儿茶酚胺类药物引起心肌缺血的方法，以评价抗心肌缺血药物的疗效。l、垂体后叶素诱发心肌缺血模型 (1)原理：垂体后叶素能使冠状动脉痉挛，造成急性心肌供血不足，从外周阻力增加导致心脏负荷加重，心电图可见心肌缺血的典型变化，适用于缓解冠状动脉痉挛以防治心肌缺血药物的初筛方法；垂体后叶素能收缩全
29、身(特别是内脏)小血管，作用是非特异的。心血管疾病药效学研究26(2)方法：大鼠缺血模型：取体重200g健康大鼠，腹腔注射乌拉坦麻醉，仰卧固定，将电极插入四肢及胸前心尖搏动处皮下，调节心电图灵敏度1mV=15mm，纸速为50mm/s，可琏接心电示波器连续观察心电变化，记录胸前导联或导联心电图。实验前有心电图或心律失常异常变化，则弃去不用，根据所试药物特点选择适当给药途径和间隔，静脉给后15min腹腔注射后1530min，灌胃后1-2h，经下静脉或尾静脉注射垂体后叶素05或07ukg，注射速度5s或l0s。注射后即刻、5s、10s、15s及30s、lmin、2min及5min，重复记录心电图(记
30、录时间可据示波器所示异常情况决定)。正常大鼠注射脑垂体后叶素后心电图变化分两期：第一期，注射即刻至30s，T波升高，ST段抬高(超过o1mV)，尤以l0s变化最明显。第二期，注射后30s至数分钟，T波低双相、倒置，心率变慢，PR及QT间期延长。判定标准，以出现第一期或第二期缺血变化为阳性，否则为阴性，比较各组的差异，并做统计学处理。心血管疾病药效学研究27 家兔缺血模型：健康家兔，体重23kg，在清醒或麻醉状态下进行实验，记录胸前导联或D导联心电图，耳静脉30s注入垂休后叶素25ukg，心肌缺血的心电变化急剧，不便判断药效，亦可改用静脉滴注法，即在l0min内恒速滴人上述剂量的垂体后叶素，心电
31、图变化可持续到1530min，除上述缺血性心电图变化外，偶有窦性心律失常、室性早搏、室性心动过速等心律失常发生。判定指标同大鼠。心血管疾病药效学研究28 2，异丙肾上腺素诱发心肌缺血模型 (1)原理：异丙肾上腺素为受体兴奋剂通过加快心率增加心肌收缩力等环节，增加心肌耗氧量，造成心脏负荷过重，心肌微循环障碍，连续应用可形成心肌损伤，可用心电图和病理方法观测病变程度。适用调节心肌代谢、氧供需平衡及作用于受体药物的研究；(2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、猫或犬均可。经心电图检查，弃去心电图有异常改变或心律失常。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射异丙肾上腺素28mgkg，家兔1016mg/kg连续两日，
32、第一次和第二次绐异丙肾上腺素后30min内，每隔5min记录心电图一次，第二次给药后24h记录心电图后杀死动物，取心脏做病理切片检查。心血管疾病药效学研究29 异丙肾上腺素可引起T波倒置或双相，有ST段抬高，窦性心动过速(心率明显加快)，早搏或伴有其他心律失常。心肌病理观察可见：白细胞和巨噬细胞浸润，心肌纤维肿胀、断裂、横 纹消失、甚至溶解，发生玻璃样变和脂肪变性等。比较各心电图和病理变化，以判断药效。(3)注意点：适用于研究影响心肌氧代谢平衡或作用受体而防治心肌缺 血的药物，用心电图难于定量观测药物的作用，须用病理观测，但制备病理标本及观察 量较大，难准确定量，是其缺点，可用分级定度或半定量
33、法观测。心血管疾病药效学研究30 3麦角新碱诱发心肌缺血模型 (1)原理：动物左冠状动脉干注入麦角新碱，可诱发明显的冠状动脉痉挛 和血流动力学改变：平均动脉压、冠脉压和肺动脉压及外周阻力增加，心排出量下降，乙电图 ST-T抬高，60发生室性心律失常，左冠状动脉造影显示狭窄率达5075，动脉血氧下 降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺环素下降，显示急性心肌缺血缺氧全身高凝状态 的病理生理改变：、病理学证实，心肌有缺血坏死性改变及冠脉血栓形成。这种动物模型 可用以评价通过缓解冠状动脉痉挛、攻善血液流变性等多种途径防治心肌缺血的药物。(2)方法：健康犬，体重lo20kg，戊巴比妥钠30mgkg注射麻酢
34、，自右侧股动脉插入导 管至左冠脉主干，以麦角新碱o.22mgkg于生理盐水，lmin内拄入，可形 成冠脉痉挛及心肌缺血。(3)观测指标：心电图或体表标测心电图ST及NST改变。血流动力学 改变。生化指标：CPK、血小板聚集、TXB2、keloPGF等变化。心脏病理学 改变。(4)注意事项：本实验特点是不开胸，不结扎冠状动脉，通过心电图、血流动力学、生化 和病理研究以评价抗心肌缺血药的治疗作用。但设备及技术要求较高，如血流动力学的测 定需要带热敏电阻的Swan-Gmlg四腔导管等。为简化实验方法，可试用猫、兔、大鼠或豚鼠 按照垂体后叶素实验方法进行。心血管疾病药效学研究31 (六)心脏血流动力学
35、实验 1原理 心肌缺血往往伴随心脏血流动力学改变，人部分治疗缺血性心脏病的有效药 物均可改善血流动力学而发挥作用。因此，心脏血流动力学指标应作为主要药效学研 究内容。实验动物可用犬、小型楮、猫或大鼠，但后两种动物心脏较小，某些指标不宜直接观 测，犬和小型猪应作为首选动物。2方法 健康犬或小型堵，雌雄兼用，体重12-15kg实验动物用戊巴比妥钠(30mgkg)静脉麻酐，手术台固定，分离气管并插管，连接电动呼吸机，调节潮气量300600ml，动脉氧 分压维持在如100mmHg，血ph在正常范围；左侧第四肋开胸，露心脏，剪开心包，做 心包床：分离冠状动脉左旋及主动脉根部。放置相应直径电磁量计探头，分
36、别测量冠脉 血流量及心出量。左心室尖部插管，连接压力换能器，测定左室内压，再经微分恻定左室内压上升最大速率。颈外静脉插管至冠状静脉窦，动脉插管，以血氧测定仪或血气分析仪分别测定冠状静脉血氧含量及动脉血氧含量，计算心肌耗氧量。股动脉插管测定动脉血压，以肢体导联观测标准导心电图并计算心率。公式算其他血流动力学指标：心搏出量、耗氧指数、心脏指数、冠脉阻力外周阻力及氧利用率等。将上述各项指标同步录于多道生理记录仪。3.注意点 本实验难度较大，耍具备成套精密仪器。、实验人员要经过严格训练，尽量减少对心肌功能的影响。分离主动脉根部、冠状动脉及相应电磁换能器、心尖部插管等是手术成功的关键。心血管疾病药效学研
37、究32(七)冠脉循环实验 1原理 冠脉流量是评价防治心肌缺血药物的重要指标。多年来，国内外对扩张冠状动脉的药物进行广泛、系统、深入的研究：，虽然能增加冠脉血流量的药物很多，但不一定都有防治心肌缺血的作用。研究中，应以多种指标综合分析，了解平衡两方面的变化，特别是净效应，才能获得准确的结论。冠脉流量测定分两种：即整体冠脉流量的测定和离体冠脉流量的测定。为了解药物对缺血区心肌实际供血情况，可在整体实验动物中进行冠脉侧支循环、心肌区域血流量、心肌营养血流的研究，从不同角度反映药物对冠脉循环的影响及防治心肌缺血的疗效。心血管疾病药效学研究332方法 (1)犬冠脉循环实验法：冠脉血流量测定，手术方法与步
38、骤同心脏血流动力学试验。实验动物开胸完成后，分离冠状动脉左旋支，放置适宜电磁流量探头，测量冠脉血流量测定动脉血压。实验结束后，取下心脏称重，以13心重作为冠脉旋支血流供血区域，计算每100g心肌每lmin血流量。冠脉侧支循环研究方法：实验用健康成年犬，手术同前，开胸手术完成后，分离上动脉根部。放相应直径电磁流量计探头测量心输出量。在冠脉左前降支下13处，分离并结扎冠状动脉，于远端插入冠脉插管。分离颈总动脉插管，与冠脉插管相连形成旁路，灌注前降支远端。三通的第三臂接橡皮臂，以收集反流量，测量反流压。插前，静脉注入肝素750ukg。分离股动脉，插入动脉管，记录动脉血压。实验开始，阻断须总动脉向冠脉
39、左前支的灌流。停灌后10 min，分别记录心输出量、冠脉反流量及反流压，动脉压及心率，作为给药前对照值，然后给予实验药物。给药后不同时间，分别纪录各值，反流量推算单位压力差下冠脉恻支血管流量(CVC)=反流量动脉舒张压，以此反映侧支血流阻力变化。心血管疾病药效学研究34 (2)冠状静脉窦血流量测定：通过测量冠状静脉窦血流量，反映冠脉血流量的变化，约60的冠脉血经冠脉窦流入右心房。利用冠状静脉窦插管直接抽血测定血氧含量，计算出心肌耗氧量及氧摄取率。注意事项：本法研究药物对犬或猫的冠状静脉窦流出量、心肌耗氧量的影响，简单方便，作为初筛抗心绞痛药物，能从供血与耗氧两力面来评价。心血管疾病药效学研究3
40、5(3)Rb测定心肌营养血流量：冠脉血流除了通过毛细血管为心肌提供营养性血流外，一部分血流经动静脉吻合支分流人静脉，两者构成冠脉总血流量。为寻找治疗冠心病药物，观测心肌营养性血流量及冠脉总血流两者配合更有意义。铷与钾为同族元素，理化性质相似，均可通过血流进入心肌胞，血流越大，撮取量越多。Rb半衰期为195日，易于测定，对心肌有特殊的亲和力，摄取量为骨骼肌的2，5倍，故适用于测定心肌营养血流量。方法：取体重24g的健康小鼠分组，给药或对照药后隔一定时间，根据待试药物的药代动力学过程确定，从尾静脉注射RbCl生理盐水溶液o1ml(400010000脉冲min)，5s注入，注射后30s，立即处死动物
41、，取心脏，用生理盐水冲洗4次，每次l0ml。然后将心脏置玻璃研钵内磨成匀浆，放特制铝箔小皿内，在普通灯下烘干，用射线自动标器计数。以每个心脏放射性占注入总放射性的分数为指标，观察小鼠心肌摄取Rb量的多少。注意：为防污染，全部操作在盘内进行实验后一并处理。Rb量及动物处死时间要准确，井将心脏的动静脉全部剪掉。每只动物取心脏时所用剪刀、镊子齐用套以防不同动物间相干扰。心血管疾病药效学研究36 (4)心肌区域血流量测定：放射微粒法测定心肌区域血流量的原理是利用放射性素标记的微粒注入左心房，循环的微粒几乎全部组织固定，故微粒流人每个器官的量(以放射性表示)与该器官血流成正比。区域性心肌血流量的操作方法
42、是用羰化塑料微球悬于含o01吐愠80的生理盐水内，使用的置旋涡混合器I2min，取微球500万，用生理盐水稀释到l0ml，10s内注入麻醉开胸犬左房导管，再用10ml盐水冲洗导管：注射微球的同时用恒速泵以6-7mlmin的速度从插人动脉弓的导管连续取3份参考样品，每份40s。实验结束时取出心，剔除表面的脂肪、血管与心瓣膜，将左窒壁切割成每份重12g的组织块，每块分成内膜下、中间与外膜下心肌层。用多导Y能诺分析仪记心肌与参考血样品的放射。汁算心肌区域性血流量。根据阻断冠脉前后心肌组织内血流量的变化减少25以上者为缺血，减少大于75者为严重缺血区。用以研究药物对心肌缺血时不同部位，不问层次的心肌血
43、流量的影响。心血管疾病药效学研究37 (5)离体心脏冠脉灌流法：哺乳动物离体心脏，插管人动脉灌流肘，灌流液须经冠状动脉经右心房流出心脏，故流出量可代表冠脉流量，在灌注压不变的条件下，其流量可反映冠脉阻力的变化。方法：雄性大鼠，体重200-250g，腹腔注射06戊巴比罢钠45mgkg麻醉仰位固定，分离侧股静脉，注入肝素125u，剪开胸暴露心脏，动脉第支头臂动脉发出处近端横断，速将心脏投入4C灌流液，冲洗冠状动脉中的残留血液，将心脏移至lallgendoff灌流装置F端，以KrebsHenseleit液灌流。待心脏跳动规则后，在肺动脉起始处剪一小口，以利冠状血回流液排出。心脏表面放置铂电极，连接电
44、刺激，用于心脏起搏。灌注约15rain后，连续测定每分钟冠脉流量3次：待恒定后开始给药，H量筒收集流出记录给药前后及给药后每lmin流出量。同叫可测定心肌耗氧星及其他生化指标的变化。心血管疾病药效学研究38 注意事项：药物的pH及无机离子含量血接近生理值，否则酸性药液可增加冠脉流量，须用与药物同样pH及无机离子的对照剂。实验中供氧，温度、灌流压力及灌液PH要固定不变。灌流液必须用新鲜蒸馏水临时配制。冠脉血管阻力受血管张力影响，受心肌紧张度对心血管支持力的影响。药物抑制心肌收缩力，可使血管阻力降低冠脉流量增加，假阳性。为排除这种影响，可先心脏纤颤，然后观察约物对冠脉流量的影响。用6V直流电产生的
45、断续感应电震直接刺激心脏，或用方形波刺激器刺激，也用交流电刺激引起心纤颤，然后测定每lmin冠脉流量的变化。心血管疾病药效学研究39(八)心肌氧代谢实验 在心肌代谢中，氧的供需占有重要地位，供氧不足，耗氧增加是缺血性心脏病的主要矛盾。左心室心肌耗氧量为每分钟810ml100g(心肌)，工作负荷增加时每分钟可达40ml100g(心肌)。停心肌供氧，经3次收缩即出现缺氧，因此，心肌耗氧测定是研究防治冠心病药物的重要指标。心肌氧代谢的研究方法约分为三类。心血管疾病药效学研究40 1直接测定 心肌耗氧星测定，在电磁流量汁测定冠脉血鼓的同叫反复多次测定动脉血及冠状静脉窦血氧量。可计算心肌耗氧。心肌氧张力
46、测定，极谱仪的铂电极插入丌胸犬的心肌，连续纪录心肌氧张力的变化。心肌缺血时内膜下血流及氧张力下降甚于心外股，缺血什损伤及坏死也较外层心肌严重，因此，用双暴露电极测定左心室外内膜下氧张力变化以研究药物的影响，更有意义。能选择性增加心膜下氧张力的药物或措施，对缺血性心肌都有保护作用。这方法仪器昂贵，国内尚未广泛应用，离体心脏心肌片或心肌组织及体外培养心肌细胞耗氧量测定，离体心脏灌流，分别测定流人液及流小液的含量，可算出心肌耗氧。或用瓦氏呼吸器测定心肌的耗氧量。或测氧仪直接测定心肌片的耗氧量。方法简便，结果稳定。心血管疾病药效学研究41 2 间接测定 张力时间指数，根据心肌耗氧量与心脏做功有密切关系
47、的原理，间接推测心肌耗氧量的变化。心肌耗氧指数，根据左心室需氧量决定于心率及收缩压的原理，间接推算心肌耗氧量的变化。正性肌力作用，心肌收缩力、心肌缩短速度与心肌耗氧呈线形关系，凡有正性肌力作用或延长射血时间者，均增加心肌耗氧量，可根据药物指标的影响推测心肌耗氧量的变化。心血管疾病药效学研究42 3 心肌耐缺氧实验 增加心肌供血(供氧)或减少能量(氧)消耗，维持能量氧)代谢平衡，可提高心肌耐缺氧能力，国内常用耐缺氧实验综合评价些药物的作用。离体心脏灌流耐缺氧实验，用不同程度的低氧或无氧流液灌流离体心脏，观察心脏功能、形态及生化指标的变化，可反映离体心脏对不同缺氧程度的耐受能力以及药物的影响，并可
48、用于受体作用的研究，但易受体外环境的影响，须严格拧制实验条件。大鼠心肺灌流耐缺氧实验，此法除可反映离体心脏的耐缺氧能力和药物作用外，可同时测定血压、心输出、心房压及静脉压等各项指标，说明这些因素与心肌耐缺氧之间的关系以及药物的作用。实验方法较前者复杂，但可获得较多信息，对药物研究有定实用价值。体外培养心肌细胞耐缺氧实验，利用体外的人或动物心肌细胞，模拟临床缺血性心脏病形成缺氧缺糖性损伤的细胞病理模型，用于研究药物对心肌细胞缺氧能力的影响与前述方法结合。可从器官、组织及细胞水平反映药物对心肌耐缺氧能力的影响。其他，小鼠常压或减压缺氧实验，方法简单，应用广，反映整体(特别是脑组织)的耐缺氧能力，但
49、特异性差，不能反映心肌的耐缺氧力，易受镇静、催眠或刺激性药物的影响，出现假阳性。用小鼠或大鼠测定速度、存活时间及死亡时余存氧含量，可以较准确的反映出整体动物的耗氧速度及药物的影响，较前者精细，但亦不能直接说明心肌的耐氧能力，耗氧速度。心血管疾病药效学研究434，其他 心肌代谢除氧的摄取利用外，尚包括碳水化合物，脂肪、蛋白质等方面。深入研究药物对这方面的影响，是必要的。酶学研究如磷酸肌酸酶(CPK)可以定量地反映心肌损伤的程度，乳酸脱氧酶及天冬氨酸转氨酶(AST)等，也常用以反映心肌损伤度。测定动脉血，冠状静脉或缺血区血液乳酸或钾的含量，较心电图及血流动力学更敏感的反映心肌缺氧程度及药物的影响。
50、两者升高说明心肌缺氧。下面重点介绍几种常用方法。心血管疾病药效学研究44 (1)心肌耗氧量直接测定法：经冠状静脉窦和颈总动脉插管，抽取冠状静脉和颈总动脉血，以血氧测定仪或血气分析仪直接测定血氧含量算心肌耗氧量。可与实验中同时测定的其他血流动力学指标如冠脉血流量、血压、心电图等连续描记于生理记录仪，进行比较研究。方法：健康成年犬，戊巴比妥钠(30mgkg)静脉麻醉开胸手术同前，从颈外静脉插冠状静脉窦，同时颈总动脉插管。药前及药后不同时间抽取血样进行血氧测定，与其他血流动力学指标同时纪录相比较。注意事项：熟练掌握冠状静脉窦插管技术，保持导管在冠状静脉窦内正确位，以保证血流通畅。取血量要适度，避免抽
